DETERMINACIÓN

DE PROTEINAS EN
ALIMENTOS
YESICA LUZ VILCANQUI CHURA
 INTRODUCCIÓN COMPUESTOS POR:

Las proteínas alimentarias son muy complejas. Hidrogeno

Muchos han sido purificados y caracterizados.
Las proteínas varían en masa molecular, que Carbono
van desde aproximadamente 5,000 a más de un
millón de Daltons. Oxigeno

Veinte aminoácidos α son los componentes Nitrógeno

básicos de las proteínas
Azufre

El nitrógeno es el elemento
más distintivo presente en las
proteínas.
 INTRODUCCIÓN
❑ Sin embargo, el contenido de nitrógeno en varias
proteínas alimentarias varía de 13.4 a 19.1%.
❑ Las proteínas se pueden clasificar por su composición,
estructura, función biológica o propiedades de solubilidad.
Por ejemplo, las proteínas simples contienen solo
aminoácidos después de la hidrólisis, pero las proteínas
conjugadas también contienen componentes que no son
aminoácidos.
❑ Las proteínas tienen conformaciones únicas que pueden ser
alteradas por desnaturalizantes como calor, ácido, álcali,
solventes orgánicos y detergentes.
❑ Los agentes desnaturalizantes pueden alterar la
solubilidad y las propiedades funcionales de las proteínas
 INTRODUCCIÓN
❑ El análisis de las proteínas se complica por el hecho de
que algunos componentes de los alimentos poseen
propiedades fisicoquímicas similares. El nitrógeno no
proteico podría provenir de aminoácidos libres, péptidos
pequeños, ácidos nucleicos, fosfolípidos, azúcares amino,
porfirina y algunas vitaminas, alcaloides, ácido úrico, urea
e iones de amonio. Por lo tanto, el nitrógeno orgánico total
en los alimentos representaría nitrógeno principalmente de
proteínas y, en menor medida, de todas las sustancias no
proteicas que contienen nitrógeno orgánico. Dependiendo
de la metodología, otros componentes alimenticios
principales, incluidos los lípidos y los carbohidratos,
pueden interferir físicamente con el análisis de las
proteínas de los alimentos
 INTRODUCCIÓN
❑ Se han desarrollado numerosos métodos para medir
el contenido de proteínas. Los principios básicos de
estos métodos incluyen las determinaciones de
nitrógeno, enlaces peptídicos, aminoácidos
aromáticos, capacidad de unión a colorantes,
capacidad de absorción ultravioleta de proteínas y
propiedades de dispersión de la luz. Además de
factores como la sensibilidad, la precisión, la
precisión, la velocidad y el costo del análisis, lo que
realmente se está midiendo debe considerarse en la
selección de un método apropiado para una
aplicación en particular
 INTRODUCCIÓN
❑ El contenido de proteínas en los alimentos
varía ampliamente. Los alimentos de origen
animal y las legumbres son excelentes
fuentes de proteínas
MÉTODOS DE DETERMINACION
DE PROTEÍNAS
MÉTODO DE
KJELDAHL

MÉTODO DE ABSORCIÓN A
LOWRY 280 NM

MÉTODO DE
BIURET
 MÉTODO DE
KJELDAHL
❑ En el trabajo de rutina se
determina mucho más
frecuentemente la proteína total
que las proteínas o aminoácidos
individuales. En general, el
procedimiento de referencia
kjeldahl determina la materia
nitrogenada total, que incluye
tanto las no proteínas como las
proteínas verdaderas (aurand et
al, 1987)
 MÉTODO DE KJELDAHL
El método se basa en la determinación de la cantidad de nitrógeno
orgánico contenido en productos alimentarios, compromete dos pasos
consecutivos:
a. La descomposición de la materia orgánica bajo calentamiento en
presencia de ácido sulfúrico concentrado.
b. El registro de la cantidad de amoniaco obtenida de la muestra

Durante el proceso de descomposición ocurre la deshidratación y carbonización de la materia

orgánica combinada con la oxidación de carbono a dióxido de carbono. El nitrógeno orgánico
es transformado a amoniaco que se retiene en la disolución como sulfato de amonio. La
recuperación del nitrógeno y velocidad del proceso pueden ser incrementados adicionando
sales que abaten la temperatura de descomposición (sulfato de potasio) o por la adición de
oxidantes (peróxido de hidrógeno, tetracloruro, persulfatos o ácido crómico) y por la adición
de un catalizador. (Nollet, 1996)
 EL MÉTODO DE KJELDAHL CONSTA
DE LAS SIGUIENTES ETAPAS:

DIGESTIÓN

TITULACIÓN DESTILACIÓN
 MÉTODO DE KJELDAHL
• En la mezcla de digestión se incluye sulfato
sódico para aumentar el punto de
ebullición y un catalizador para acelerar
la reacción, tal como sulfato de cobre. El
amoniaco en el destilado se retiene o bien
por un ácido normalizado y se valora por
retroceso, o en ácido bórico y valora
directamente. El método kjeldahl no
determina, sin embargo, todas las formas
de nitrógeno a menos que se modifiquen
adecuadamente; esto incluye nitratos y
nitritos. (pearson, 1993)
 MÉTODO DE KJELDAHL
Para convertir el nitrógeno a proteína se Factores de conversión de nitrógeno
emplea el factor de 6.25 el cual proviene de a proteína para algunos alimentos
la consideración de que la mayoría de las
proteínas tienen una cantidad aproximada de
16% de nitrógeno.
 PROTEÍNA CRUDA. “MÉTODO DE KJELDAHL” (AOAC
OFFICIAL METHOD 2001.11)
DIGESTION
❑ Pesar de 0.1-0.2g de muestra e introducir en un tubo de kjeldahl, y
agregar 0.15g de sulfato de cobre pentahidratado, 2.5g de sulfato de
potasio o sulfato de sodio y 10 ml de ácido sulfúrico concentrado.
❑ Calentar hasta total destrucción de la materia orgánica, es decir hasta
que el líquido quede transparente, con una coloración azul verdosa.
❑ Agregar a cada balón 10 ml (50ml) de agua destilada por las paredes

• Calentar la mezcla (350 - 380 ºC) hasta la aparición de humos blancos.

• Continuar el calentamiento durante unos 180 minutos.
• Los vapores de agua y ácido sulfúrico se burbujean a través de una solución de hidróxido
de sodio (lavador de gases o scrubber) para ser neutralizados.
PROTEÍNA CRUDA.
“MÉTODO DE
KJELDAHL” (AOAC
OFFICIAL METHOD
2001.11)

DESTILACIÓN
PROTEÍNA CRUDA.
• Valorar con HCl 0,25 mol/l
“MÉTODO DE hasta que la solución tenga
KJELDAHL” (AOAC un ligero color violeta.
OFFICIAL METHOD • Con la concentración y el
volumen de HCl gastado en
2001.11) la valoración, podemos
calcular el número de moles
de átomos de nitrógeno en
TITULACIÓN la muestra y luego el % de
proteína en la muestra de
leche.
 PROTEÍNA CRUDA. “MÉTODO DE KJELDAHL” (AOAC OFFICIAL
METHOD 2001.11)

CALCULOS
𝑉∗𝑁∗0.014∗100
% Nitrógeno=
𝑚

• V = Volumen de ácido clorhídrico

empleado en la titulación, en ml
• N = Normalidad de ácido clorhídrico
• m = Masa de la muestra en gramos
• 0.014 = Miliequivalentes de Nitrógeno

% N * 6.25= % 𝑃𝑅𝑂𝑇𝐸𝐼𝑁𝐴
 ABSORCIÓN A 280 NM
La mayoría de las proteínas muestran una absorción a
280 nm., la cual se atribuye al grupo fenólico de la
tirosina y al grupo indólico del triptofano. La
cuantificación de proteínas basada en la absorción en
la región de UV, tiene la ventaja de que no es necesario
utilizar reactivos y la muestra no se daña o destruye
durante la determinación. Se toma en cuenta la
absorción del disolvente, ya que este puede absorber
en la misma región. Este método sufre interferencias de
compuestos que contengan anillos de purina y pirimida.
Se realiza una comparación con una proteína estándar,
de la que se debe conocer su composición. (Nollet,
1996)
 ABSORCIÓN A 280 NM (WARBURG Y CHRISTIAN, 1941)
Colocar la solución problema debidamente diluida en una celda de cuarzo del espectrofotómetro, de
1 cm de paso, y determinar la absorbancia a 280 nm, usando como blanco la solución en que se
encuentra preparada la muestra. La concentración de proteína se obtiene por referencia a una curva
de calibración preparada con albúmina bovina sérica en concentraciones de 50 a 500 µg/mL
 MÉTODO DE BIURET
El método comprende un ensayo colorimétrico de
un paso donde se cuantifica la formación de un
complejo estable entre proteínas y cobre (II). El
complejo presenta un color violeta característico,
que se puede observar a 310nm o 540-560nm, el
cual se da por la coordinación de un átomo de
cobre con cuatro átomos de nitrógeno. El complejo
se basa en la desprotonación de los grupos amida
para formar el enlace con el cobre (II) o por el
establecimiento de un enlace coordinado entre el
metal y los pares de electrones libres de los
átomos de oxigeno y de nitrógeno del péptido
 MÉTODO DE BIURET (GORNALL ET AL,
1949)
❖ Colocar 1 mL de la solución de proteína
adecuadamente diluida en tubos de ensaye
perfectamente etiquetados, y adicionar 4 mL del
reactivo de Biuret.
❖ Mezclar y dejar en reposo 30 min. a temperatura
ambiente.
❖ Determinar la absorbancia del color violeta
producido a 540 nm contra un blanco preparado de
la misma manera con 1 mL de la solución en que se
encuentra diluida la muestra.
❖ La concentración de proteína se obtiene por
referencia a una curva de calibración preparada con
albúmina bovina sérica con concentraciones de 1 a
10 mg/mL.
 MÉTODO DE LOWRY
El método de Lowry et al, 1951 combina la
reacción de Biuret con la reducción del reactivo de
Folin-Ciocalteu (ácidos fosfomolíbdico y
fosfotúngstico) por la oxidación de tirosina,
triptofano, cisteína, cistina de las cadenas
polipeptídicas (Nielsen, 1988). El proceso de
oxido-reducción se acompaña de la formación de
un color azul característico. Los quelatos de cobre
en la estructura del péptido facilitan la
transferencia de electrones de los grupos
funcionales amino al cromóforo ácido. Este método
es útil para determinar pequeñas cantidades de
proteína en una disolución. El desarrollo de color es
dependiente en gran cantidad del pH, que se
debe mantener entre 10 y 10.5. (Nollet, 1996)
 MÉTODO DE LOWRY (LOWRY ET AL, 1951))
❑ Colocar 1 mL de la solución adecuadamente diluida en tubos de
ensaye perfectamente etiquetados, y adicionar tomando el tiempo
3 mL del reactivo C preparado recientemente (50 mL de A y 2 de
B)
❑ Después de exactamente 10 min adicionar a la mezcla 0.3 mL del
reactivo D (1 parte de reactivo de Folin con 1 parte de agua),
agitando inmediatamente.
❑ Dejar en reposo a temperatura ambiente durante 30 min.
❑ Determinar la absorbancia del color azul producido a 750 nm
contra un blanco preparado de la misma manera con 1 mL de
agua en vez de la solución problema.
❑ La concentración de proteína se calcula a partir de una curva
patrón preparada con albúmina bovina sérica en concentraciones
de 10 a 100 µg/mL, tratadas de la misma manera con los
reactivos.
 ESPECTROSCOPIA
INFRARROJA
La espectroscopía infrarroja mide la absorción de
radiación (regiones de infrarrojo cercano o medio) por
moléculas en los alimentos u otras sustancias. Diferentes
grupos funcionales en un alimento absorben diferentes
frecuencias de radiación. Para proteínas y péptidos, se
pueden usar varias bandas del infrarrojo medio (6,47
μm) y del infrarrojo cercano (nir) (por ejemplo, 3,300–
3,500 nm, 2,080–2,220 nm, 1,560–1,670 nm)
características del enlace peptídico para estimar el
contenido de proteínas de un alimento. Al irradiar una
muestra con una longitud de onda de luz infrarroja
específica para el constituyente a medir, es posible
predecir la concentración de ese constituyente midiendo
la energía que refleja o transmite la muestra (que es
inversamente proporcional a la energía absorbida)