INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA SUPERIOR DE INGENIERÍA QUÍMICA E

INDUSTRIAS EXTRACTIVAS

LABORATORIO DE QUÍMICA ANALÍTICA

TÉCNICAS DE SEPARACIÓN

GRUPO: 3IM7A

SECCIÓN A

PRÁCTICA 3: EFECTO DE
LA
COMPOSICIÓN DE LA FASE
MÓVIL EN LA ELUCIÓN DE
LOS ANALITOS
ACUÑA GONZÁLEZ MARTHA TITA
Contenido
Objetivos................................................................................................................................................................... 3
Introducción teórica.................................................................................................................................................3
Influencia de la composición de la fase móvil en la elución de los analitos..........................................................3
Cómo se realizan los análisis isocráticos y los análisis de gradiente de composición...........................................3
Compuestos que se usan como fase móvil...........................................................................................................4
Propiedades fisicoquímicas de los solventes, que son importantes en cromatografía de líquidos de alta
resolución.............................................................................................................................................................5
Procedimiento experimental....................................................................................................................................6
Datos experimentales...............................................................................................................................................7
ANÁLISIS DE RESULTADOS......................................................................................................................................13
Conclusiones y recomendaciones...........................................................................................................................13
Referencias.............................................................................................................................................................13
Objetivos
 Inyectar estándares de benceno y tolueno a diferentes composiciones de fase
móvil
 Establecer la influencia de la composición de la fase móvil en la elución de
cada analito.
 Inyectar muestras de mezcla de benceno - tolueno para identificarlos por
comparación de tiempos de retención
 Realizar las modificaciones necesarias a los métodos de análisis para realizar
el trabajo experimental de esta práctica.

Introducción teórica
Influencia de la composición de la fase móvil en la elución de los analitos.
 Composición, fuerza iónica, temperatura y pH aparente de la fase móvil.
 Tipos de solventes que pueden ser utilizados en la fase móvil pueden tener
diferentes propiedades fisicoquímicas, como polaridad, viscosidad, densidad,
etc., que pueden influir en la separación de los analitos.
 Velocidad de flujo, dimensiones de la columna, temperatura de la columna y
presión.
 Tipo y concentración de aditivos, la adición de estos puede mejorar la
resolución y reducir la formación de picos asimétricos.
 La concentración y tipo de solución buffer en la fase móvil puede ayudar a
controlar el pH y mejorar la resolución de la separación. El tipo de buffer y su
concentración pueden afectar la carga de los analitos y, por lo tanto, su
interacción con la fase estacionaria.
 Es importante conocer nuestra muestra a analizar para poder seleccionar
una fase móvil adecuada, ya que muchos factores influyen en su separación
y si elegimos de manera incorrecta no tendremos una separación eficiente.

Cómo se realizan los análisis isocráticos y los análisis de gradiente de

composición

Una separación que utiliza un solo disolvente de composición constante se

denomina una elución isocrática. En este procedimiento en el que la composición
de la fase móvil permanece constante a lo largo del proceso de elución. La elución
implica el transporte de una especie a través de una columna por adición sucesiva
de fase móvil (eluyente). Sucesivas adiciones de fase móvil hacen descender las
moléculas de analito por la columna en una serie de transferencias entre la fase
móvil y la fase estacionaria. Si al final de la columna se coloca un dispositivo que
responda a los cambios de composición de fase móvil, es decir, a la presencia de
los distintos solutos (detector) se puede registrar un cromatograma, gráfico que
representa la respuesta del detector en función del tiempo de elución (o volumen
de eluyente añadido). La línea base del cromatograma corresponde a la señal del
detector en ausencia de compuestos eluídos, la aparición de un pico representa la
elución de un componente de la muestra. La separación se completa cuando el
cromatograma presenta varios picos, los cuales serán objeto de análisis.
Análisis de gradiente:
Procedimiento en el que la composición de la fase móvil cambia, de forma continua o en etapas, a lo
largo del proceso de elución. En este análisis Procedimiento en el que la composición de la fase móvil
cambia, de forma continua o en etapas, a lo largo del proceso de elución. En este procedimiento en el
que la composición de la fase móvil cambia, de forma continua o en etapas, a lo largo del proceso de
elución.
Una vez comienza la elución, se varía la relación de los disolventes de forma programada, a veces
continuamente y a veces mediante una serie de etapas escalonadas. Los instrumentos en la moderna
HPLC a menudo están equipados con unos dispositivos que permiten introducir los disolventes desde
dos o más recipientes en una cámara de mezcla a una velocidad que varía continuamente y la relación
de volumen de los disolventes se puede modificar lineal o exponencialmente con el tiempo.
Compuestos que se usan como fase móvil
 Acetona
 Hexano
 Tolueno
 Tetracloruro de carbono
 Cloroformo
 Cloruro de metileno
 Acetato de etilo
 Dioxano
 Acetonitrilo
 Isopropanol
 Metanol
 Agua
  Propanol
 Tetrahidrofurano
 Éter dietílico
 Heptano

Propiedades fisicoquímicas de los solventes, que son importantes en

cromatografía de líquidos de alta resolución

Polaridad: La polaridad es una de las propiedades más importantes en HPLC. Los

solventes polares tienden a interactuar más fuertemente con compuestos polares,
mientras que los solventes no polares son más adecuados para compuestos no
polares. La elección del solvente polar o no polar adecuado es esencial para lograr
una separación selectiva.

Viscosidad: La viscosidad se refiere a la resistencia del solvente al flujo. Los

solventes con baja viscosidad permiten una mejor transferencia de la muestra a
través de la columna y evitan problemas de presión en el sistema. La elección de
solventes con viscosidad adecuada es esencial para un funcionamiento suave del
HPLC.

Tensión superficial: La tensión superficial se relaciona con la capacidad de mojar y

fluir en la columna. Solventes con baja tensión superficial tienden a mojar mejor
las partículas de la fase estacionaria y permiten una mejor interacción con los
analitos en la columna.

Capacidad de disolución: La capacidad del solvente para disolver los analitos es

crítica. Los solventes deben ser capaces de disolver completamente los
compuestos de interés sin que se produzca precipitación o saturación.

Punto de ebullición: El punto de ebullición del solvente debe ser adecuado para la
temperatura de trabajo de la columna y el detector. Los solventes con puntos de
ebullición bajos son preferibles para facilitar la evaporación después de la
detección.

Pureza: Los solventes utilizados en HPLC deben ser de alta pureza para evitar la
contaminación de las muestras y garantizar resultados precisos y reproducibles. La
presencia de impurezas puede interferir en la separación y detección de los
analitos.

Inercia química: Los solventes deben ser químicamente inertes y no reaccionar con
los analitos, las fases estacionarias ni los componentes del sistema. La inercia
química garantiza que no se produzcan reacciones no deseadas que afecten la
separación y la detección.

Compatibilidad con detectores: La elección del solvente también depende del tipo
de detector utilizado en HPLC. Algunos detectores son más sensibles o compatibles
con ciertos solventes, por lo que es importante considerar la interacción entre el
solvente y el detector.
La selección adecuada de solventes en HPLC es esencial para optimizar la
separación y el análisis de los compuestos de interés. Deben equilibrarse varias
propiedades fisicoquímicas para garantizar un funcionamiento eficiente y preciso
del sistema.
Procedimiento experimental
Encendido.
Realizar como se indica en la práctica 1.
Generación de un método de análisis a partir de cero.
1. Encender computadora.
2. Abrir el programa chromera.
3. Seleccionar el icono de carpeta el cual muestra todos los métodos.
4. Elegir el método para la experimentación.

5. Abrir el método desde la opción Open.

6. En la pestaña “instruments” seleccionamos la opción de “FXUVDet-1” la cual

nos permitirá establecer los parámetros para el detector.
7. Establecer el tiempo del análisis.
8. Seleccionamos la casilla de “autozero” a la longitud de onda de 220nm.
9. Ya con los parámetros del detector, lo siguiente es establecer los de la bomba, se debe
seleccionar FXBPump-2.
10. Seleccionamos una transición de tipo isocráticos.
11. Seleccionamos la casilla de “Run Time Reconcilation”.
Obtención de los cromatogramas impresos.
1. Oprimir report
2. Elegir el reporte
3. imprimir

Apagado.
Realizar como se menciona en la práctica 1

Datos experimentales

Flujo % Metanol % Agua Presión

(mL/min) (psi)
0 95 5 90
0.2 90 10 420
0.4 85 15 1060
0.6 75 25 1890
0.8 70 30 2420
1 65 35 2580

Muestra tR Área Altura Área/Altura tanálisis %A-%B

Benceno 5.5 65-35
Tolueno 7.737 7433384.3 265963.6 27.9489 8 65-35
Mezcla Benceno- 5.703 6078356.7 208573.6 29.1425 8 65-35
Tolueno 7.563 42240991.3 967722.5 43.6499 8 65-35
Muestra tR Área Altura Área/Altura tanálisis %A-%B
Benceno 3.5 8 80-20
Tolueno 3.886 7262651.1 375021.9 19.3659 8 80-20
Mezcla Benceno- 3.5 8 80-20
Tolueno 3.866 45152681.1 1353218.4 33.3668 8 80-20

Flujo % Metanol % Agua Presión

(mL/min) (psi)
1 80 20 2380
0.8 85 15 1930
0.6 85 15 1360
0.4 90 10 840
0.2 95 5 340
0 95 5 90
ANÁLISIS DE RESULTADOS
Comparando el cromatograma de la mezcal con una composisción de
65-35 contra la de 80-20 podemos decir que es más favorable para este
análisis la composición de 65-35, ya que son mucho más claros los
picos, mientras que cuando hicimos la composición 80-20 no es claro el
pico del benceno, esto nos indica que la composición esta directamente
relacionada con la resolución.

Tambien podemos observar que mientras mayor sea la composición de

nuestro analito, el tiempo de retención es menor.

Conclusiones y recomendaciones
La composición de la fase móvil puede influir en la resolución de los
picos al afectar la diferencia en los tiempos de retención de los analitos.
Los analitos pueden retenerse más o menos tiempo en la columna según
la afinidad relativa de la fase móvil y la fase estacionaria. Cambiar la
composición de la fase móvil puede ajustar los tiempos de retención.
Cuando los tiempos de retención son diferentes debido a la composición
de la fase móvil, los picos se separan mejor y son más nítidos. Por el
contrario, si los tiempos de retención son similares, la resolución es
deficiente y los picos pueden superponerse, como lo que ocurrio cuando
cambiamos la composición a 80-20 y no era facil distinguir el pico del
benceno.

Por ello se recomienda tomar en cuenta las características de nuestro

analito a la hora de elegir la composición, de igual manera se pueden
realizar corridas de prueba para identificar a qué composición se tiene
una mejor resolución.

Referencias
Camacho, L. (9 de Diciembre de 2020). Youtube. Obtenido
de [Link]

Camacho, L. (16 de Diciembre de 2020). Youtube. Obtenido

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