1

TEMA 4: APLICACIÓN DE PROCEDIMIENTOS DE

SEPARACIÓN DE SUSTANCIAS

ÍNDICE:

1. SEPARACIÓN DE MUESTRAS BIOLÓGICAS

2. MÉTODOS MECÁNICOS DE SEPARACIÓN

A. TAMIZACIÓN
B. FILTRACIÓN
C. DECANTACIÓN
D. CENTRIFUGACIÓN

3. MÉTODOS DIFUSIONALES DE SEPARACIÓN

A. DESECACIÓN
B. EVAPORACIÓN
C. CRISTALIZACIÓN
D. DESTILACIÓN
E. EXTRACCIÓN
F. ADSORCIÓN Y ABSORCIÓN

4. MÉTODOS DE SEPARACIÓN ELECTROFORÉTICA

5. MÉTODOS DE SEPARACIÓN CROMATOGRÁFICA

 2
1. SEPARACIÓN DE MUESTRAS BIOLÓGICAS

MEZCLA COMPLEJA DE BIOMOLÉCULAS

PRINCIPALES CARACTERÍSTICAS

- Polaridad: depende del número y distribución de enlaces que estén polarizados.

Un enlace está polarizado cuando hay una distribución desigual de los electrones.

Moléculas polares y apolares (interacciones entras sustancias de naturaleza

similar)

Atracción electromagnética
entre moléculas polares

- Volatilidad: capacidad de pasar a estado gaseoso

Interacción entre las moléculas es débil -> volatilidad alta

- Solubilidad: capacidad de un soluto de disolverse en un disolvente determinado

Moléculas y disolvente tienen polaridad similar -> interacción -> mezcla/disolución

Moléculas y disolvente tienen polaridad diferente -> no interacción -> separadas
 3
- Carga: presencia de moléculas con carga positiva o negativa en función del medio en
que se encuentre.

Formas iónicas de la alanina

- Tamaño

- Forma: la con guración molecular también permite diferenciar moléculas biológicas de

la misma naturaleza química

2. MÉTODOS MECÁNICOS DE SEPARACIÓN

Técnicas mecánicas de separación que se basan en diferencias físicas entre los

componentes de mezcla (tamaño de partícula, forma, densidad, …). Mezclas
heterogéneas.

TAMIZACIÓN

Separación de mezclas heterogéneas sólido-sólido en función del tamaño de las

partículas.

Tamiz

Se realiza con tamices que se caracterizan por:

• Luz (L): espacio entre 2 hilos consecutivos de la malla.

• Diámetro (D): grueso de los hilos que forman la malla
• Abertura de la malla (M): suma de los 2 anteriores -> M = L + D.
fi
 4
Los tamices se clasi can según el tamaño de sus aberturas:

*Series normalizadas: UNE (española), AFNOR (francesa), TYLER y ASTM

(norteamericanas)
Serie normalizada de tamices UNE
Nº de tamiz Luz del tamiz mm
3 2
6 1
10 0,63
16 0,4
20 0,32
60 0,1
100 0,063
110 0,05

- Con solo un tamiz:

1. Selección del tamiz del tamaño adecuado

2. Colocación de la mezcla sobre la malla
3. Sujeción del tamiz por el bastidor con ambas manos
4. Movimientos cortos, rápidos y rmes a ambos lados

Obtención de dos fracciones:

A. Fracción de gruesos o de rechazo: límite inferior. Partículas de diámetro mayor

que los ori cios del tamiz. Conocemos el menor tamaño de las partículas
retenidas.
B. Fracción de nos o cernido: límite superior. Partículas de diámetro menor que los
ori cios del tamiz. Conocemos el mayor tamaño de las partículas recogidas.

Ejemplo: se tamiza una mezcla con un tamiz nº 10 de la serie normalizada UNE (luz de
maya 0,63mm) ¿Cuántas fracciones obtendremos? ¿Cuál será el tamaño de partículas en
esas fracciones?
- Fracción de nos: límite superior conocido. Todas partículas recogidas -> <0,63mm
- Fracción de gruesos: límite inferior conocido. Todas partículas recogidas -> >0,63mm
fi
fi
fi
fi
fi
fi
 5
- Con varios tamices: tamización en serie o en cascada:

Separación en varias fracciones clasi cadas por tamaños

Siempre se empieza con el tamiz con mayor luz

Orden decreciente de luz

Nº de fracciones = Nº de tamices + 1

Ejemplo: se tamiza de forma fraccionada una mezcla con tres tamices nº 3, 10 y 20 de la

serie normalizada UNE ¿Cuál será el tamaño partícula de esas fracciones?

Fracción Límite Límite

inferior superior
1 Retenida en el primer tamiz: UNE 3 (L= 2mm) 2mm No se conoce

2 Retenida en el segundo tamiz: UNE 10 (L = 0,63mm) 0,63mm 2mm

3 Retenida en el tercer tamiz: UNE 20 (L = 0,32mm) 0,32mm 0,63mm

4 Cernido nal No se conoce 0,32mm

- Tamización: análisis granulométrico

Necesitamos: masa de cada fracción

Obtenemos: porcentaje en masa de cada fracción
fi
fi
 6

Fracción Límite inferior Límite superior Masa %

1 2mm No se conoce 20g 51,28 %

2 0,63mm 2mm 5g 12,82 %

3 0,32mm 0,63mm 11g 28,21 %

4 No se conoce 0,32mm 3g 7,69 %

Si tenemos el peso de todas las fracciones, sabremos la masa total:

Masa total = 20 + 5 +11 + 3 = 39g
Para calcular el % aplicamos la siguiente ecuación:
% = masa fracción/masa total x 100

FILTRACIÓN

Separación de mezcla heterogéneas sólido-líquido en función del estado de las partículas

Torta o residuo
(partículas sólidas)

Filtrado
(fracción líquida)

Filtros de papel:
Liso De pliegues Placa de papel
Función Interesa el sólido Interesa el líquido Interesa el sólido
Embudo Cónico Cónico Büchner
Tipo de ltración Por gravedad Por gravedad A vacío
- rápido + rápido
fi
 7
- Filtros de membrana:
• Cambiar antes de saturación del ltro.
• Evitar forzarlo.
• Polímeros dentro del disco
• Se conecta a jeringas
• Poca cantidad de sustancia

Partículas muy pequeñas

- Placas ltrantes
• Vidrio molido y compacto al fondo
• Suelen realizarse a vacío

Por gravedad:

Aro

cónico

Soporte

Vaso de precipitados (o Erlenmeyer)

fi
fi
 8
- Procedimiento:
• Preparar el montaje con los materiales necesarios
• Doblar el papel de ltro (liso de pliegues) y colocarlo en el embudo
• Mojar las paredes del ltro con unas gotas de agua destilada
• Verter la suspensión por el embudo a través de la varilla de vidrio para evitar
salpicaduras. La varilla no debe tocar el papel del ltro.
• Asegurarse de que se recoge la fase líquida limpia en el recipiente
• Arrastrar las últimas trazas del vaso inicial añadiendo un poco más de disolvente.

A vacío:

- Procedimiento:
• Preparar el montaje con los materiales necesarios
• Poner el tubo de goma conectando el kitasato a la trompa de vacío
• La trompa de vacío se conecta a un grifo de agua
• Colocar una placa de papel en el embudo Büchner
• Mojarlo con gotas de agua destilada
• Abrir el grifo
• Con la ayuda de la varilla, verter la suspensión en el centro del embudo Büchner
• Esperar a que pase la fase líquida limpia a través del ltro
• Limpiar el sólido con un poco de disolvente
• Finalizada la ltración, desconectar el kitasato de la trompa de vacío
• Cerrar el grifo

DECANTACIÓN

Separación de mezclas heterogéneas líquido-líquido (emulsiones) o sólido-líquido

(suspensiones) basada en la diferencia de densidad de sus componentes, gracias a la
fuerza de la gravedad.
De emulsiones:
fi
fi
fi
fi
fi
 9
- Procedimiento:
• Se añade la emulsión a un embudo de decantación con la llave cerrada, situado en
un aro con un soporte
• Se deja reposar la mezcla hasta que se distinguen las fases
• Se coloca en la parte inferior un recipiente para recoger uno de los líquidos
• Se abre la llave y se deja caer el líquido hasta llegar a la interfase
• Se cierra la llave

De sólidos

- Procedimiento
• Se añade la suspensión a un vaso de precipitados
• Se deja reposar la mezcla hasta que el sólido se deposita en el fondo
• Se traspasa el líquido a otro recipiente con ayuda de la varilla agitadora

* Método poco e caz

* Complementario a otros métodos (paso previo a ltración,…)

CENTRIFUGACIÓN

Separación de mezclas heterogéneas líquido-líquido (emulsiones) o sólido-líquido

(suspensiones) basada en la diferencia de densidad de sus componentes, gracias a la
fuerza centrífuga.
fi
fi
 10
La fuerza centrífuga es mayor que la fuerza de la gravedad

Mayor velocidad -> rapidez

Mayor compactación en la parte inferior

Centrifugación analítica

- Medir propiedades físicas de las partículas que separan (masa molecular, coe ciente
de sedimentación)
- Muestras puras
- Volúmenes pequeños
*Coe ciente de sedimentación = velocidad de sedimentación / aceleración de la
centrífuga

Centrifugación preparativa:

- Aislar partículas para su análisis posterior

- En gradiente de densidad
• Discontinuo
• Continuo
fi
fi
 11
A. Preformado (centrifugación zonal): se crea el gradiente antes de introducir la
muestra. Lo que determina la separación, es el coe ciente de sedimentación de
las sustancias que se van a separar. La densidad de la muestra tiene que ser
mayor a la del gradiente en cualquier punto.
Separación: coe ciente de sedimentación
Ejemplos: macromoléculas

A. Autoformado (centrifugación isopínica): se crea el gradiente por centrifugación a la

vez que la muestra se distribuye por las bandas (+ habitual)
Separación: densidad
Ejemplos: ácidos nucleicos

- Uso y manejo general:

• Muestras: tubos de centrífuga o eppendorf
• Todos los tubos deben tener la misma cantidad de muestra
• Si no se llena por completo: siempre se coloca un nº par de tubos llenos, aunque sea
de agua, en posiciones opuestas para hacer contrapeso.
fi
fi
 12
- Tipos de centrífugas:
• Centrífugas de baja velocidad o de sobremesa
Velocidad: 5000rpm
Utilidad: partículas grandes

• Micrófugas o microcentrífugas
Velocidad:10000rpm
Utilidad: volumen pequeños de muestra (biología
molecular)

• Centrífugas de alta velocidad:

Velocidad:18000-25000rpm
Utilidad: partículas muy pequeñas (fragmentos celulares)

• Ultracentrifugas
Velocidad: <50000rpm
Sistemas auxiliares (refrigeración, vacío)
Tipos: analíticas o preparativas
Utilidad: orgánulos celulares (mitocondrias, ribosomas,…)

- Tipos de rotores:
• Flotante o basculante:
Aspa donde se colocan las muestras verticalmente
En funcionamiento pasan posición horizontal

• Angular o de ángulo jo:

Posición ja de las muestras en forma de cono
truncado

• Vertical:
Posición ja de las muestras en posición vertical

- Aplicaciones habituales:
• Obtención de leucocitos
• Fraccionamiento subcelular
• Obtención de suero o plasma
• Concentración de células
• Extracción de biomoléculas
fi
fi
fi
 13
3. MÉTODOS DIFUSIONALES DE SEPARACIÓN.

Técnicas difusionales de separación que se basan en el cambio de estado de los

componentes de la mezcla.

DESECACIÓN

Separación de mezclas sólido-líquido (líquido retenido en el sólido). Eliminación de la

humedad de los productos
Preparación del producto:
1. Pulverización de la muestra
2. Extensión sobre super cie lisa
* Aumenta la super cie de muestra expuesta

- Estufa:
• Ajuste de tiempo y temperatura según el producto a desecar
• Control del peso del producto hasta que se estabiliza
• No todos los productos se pueden calentar

- Desecador
• Recipiente de vidrio cerrado herméticamente
• Agentes decantes comunes: CaCl2, Al2O3 (alúmina), SiO2(sílice)

EVAPORACIÓN
Separación de mezclas homogéneas sólido-líquido. Concentración

Tipos de evaporación:
- Evaporación a temperatura ambiente
• Cristalizadores

* cuidado con los gases que se forman

- Evaporación por calor y agitación

• Placa calefactor
fi
fi
 14
- Evaporación a vacío (calor y presión)
• Rotavapor

CRISTALIZACIÓN

Separación de mezclas homogéneas sólido-líquido en función de la variación de la

solubilidad de los compuestos con el disolvente y la temperatura.

1. Disolución en caliente del sólido: asegurar que se disuelva completamente la mayor

cantidad de soluto

2. Filtración por gravedad de la disolución en caliente: eliminar el soluto que no se haya

disuelto y las posibles impurezas

3. Enfriamiento lento del ltrado: recipiente bajo con super cie ancha placa de Petri
• Si el enfriamiento es rápido: sólido, sin cristalizar
• Si el enfriamiento es lento: sólido, cristalino

4. Filtración de los cristales

Elección del disolvente

- El soluto tiene que ser soluble en él y la solubilidad debe variar con la temperatura
considerablemente. Comprobar curva de solubilidad.
- Fácil eliminación tras la cristalización
- No puede reaccionar con el soluto
- No debe ser tóxico ni in amable
fi
fl
fi
 15
DESTILACIÓN
Separación de mezclas homogéneas líquido-líquido en función de las distintas
temperaturas de ebullición de los líquidos.

- Tipos de destilación:
Destilación simple

1. Se calienta la mezcla a la temperatura de ebullición del líquido que tenga

menor temperatura de ebullición (+ volátil)
2. El líquido más volátil pasará a estado gaseoso
3. El vapor ascenderá hasta alcanzar el refrigerante (más frío), por lo que se
condensará (pasa de gas a líquido).
4. El líquido cae por el refrigerante y se recoge con el matraz recolector.

Destilación fraccionada
 16
1. Se calienta la mezcla a la temperatura de ebullición del líquido con menor
temperatura de ebullición.
2. Los dos líquidos pueden pasar a estado gaseoso
3. En la columna de fraccionamiento, el menos volátil quedará retenido en los ”
platos”, mientras que el más volátil ascenderá en forma de vapor.
4. El vapor alcanzará el refrigerante(+ frio), por lo que se condensará (pasa de gas
a líquido)
5. El líquido cae por el refrigerante y se recoge en el matraz recolector

Destilación por arrastre de vapor

1. En el primer matraz, se coloca el disolvente con el que se va a extraer la

esencia y se calienta hasta su temperatura de ebullición
2. El gas formado pasa al segundo matraz donde entra en contacto con el sólido
que está más frío y pasa estado líquido
3. Debido a la entrada del gas, en este segundo matraz se produce una diferencia
de presión, que provoca que no sea necesario calentar tanto el recipiente para
que el líquido vuelva a estado gaseoso
4. El nuevo gas, será el líquido que ha estado en contacto con el sólido
 17
EXTRACCIÓN
Separación de mezclas que permite obtener sustancias principalmente de muestras de
origen natural (tejidos, órganos, plantas,…) a través de diferentes técnicas.

- Tipos de extracción

Extracción mecánica
• Extracción por calor: se calientan los tejidos para romper las células y que el
contenido salga al exterior
• Extracción por incisión: se realiza un corte en la super cie del tejido u órgano y se
recoge la sustancia semilíquida que suelta
• Extracción por expresión: se comprimen los tejidos mediante exprimidores o
prensas

Extracción por disolventes

• Extracción líquido-líquido:
- Disolventes: inmiscibles (disolvente 2 - disolvente 1)
- Sustancia a extraer: soluble en los dos, pero más en disolvente 2
- Impurezas: insolubles en disolvente 2, pero solubles en disolvente 1
Sustancia a extraer e impurezas en disolvente 1
Mezcla disolvente 2 y disolvente 1
Agitación de la mezcla
La sustancia a extraer ha pasado al disolvente 2
Impurezas se quedan en disolvente 1
Separación a través de decantación

• Extracción sólido-líquido
- Maceración: se tritura el sólido y se deja en un disolvente a temperatura
ambiente durante varios días
- Infusión / decocción: se calienta el disolvente a la temperatura de ebullición y se
añade el sólido momentáneamente / un tiempo variable, disolviendo la sustancia
de extraer en el disolvente.
- Percolación: se tritura el sólido y se coloca en un percolador, por donde se hace
pasar el disolvente para que arrastre la sustancia a extraer.
fi
 18
- Soxhlet: se tritura el sólido y se coloca en un sistema soxhlet, por donde se
hace pasar el disolvente en caliente varias veces para que arrastre la sustancia a
extraer

• Extracción de lípidos: procedimiento de Folch

Disolución de la muestra en cloroformo / metanol (CHCl3 / CH3OH)
Lípidos son muy solubles en cloroformo
Se extrae el cloroformo, se evapora y se obtienen los lípidos

• Extracción de ácidos nucleicos: extracción de ADN genómico

Muestra de sangre periférica
Adición de lisis: degrada las proteínas y el ARN
Centrifugación: interesa al sobrenadante con el ADN genómico
Adición de etanol (CH3CH2OH): precipita el ADN
Centrifugación: interesa el pellet

• Extracción de glúcidos
Por disolventes
Paso nal: cromatografía

• Extracción de proteínas
Centrifugación
Precipitación
Cuanti cación de proteínas (método Bradford)
fi
fi
 19
ADSORCIÓN Y ABSORCIÓN
Separación selectiva de mezclas homogéneas (líquidas o gaseosas) para eliminar
impurezas

Adsorción
• Adsorbentes: sustancias sólidas sobre las que se adhieren algunas moléculas de
mezclas líquidas o gaseosas de forma selectiva.
Adsorbentes más empleados: carbón activado (atrapa compuestos orgánicos
presentes en un gas o líquido), resinas de intercambio iónico (retiran iones, para
generar agua desgonzada T1)

Absorción
• Absorbentes: sustancias líquidas que absorben moléculas de una mezcla gaseosa

4. MÉTODOS DE SEPARACIÓN ELECTROFORÉTICA

ELECTROFORESIS

Técnica analítica que se basa en la migración de moléculas cargadas a través de un

medio por acción de un campo eléctrico
- Separa compuestos en función de su carga neta: aminoácidos, péptidos, proteínas,
nucleótidos o ácidos nucleicos
- Comportamiento de las moléculas:
Movilidad electroforética (U): tamaño, forma y carga
pH
Fuerza iónica del medio: concentración de todos los iones
 20
- Componentes
Fuente de alimentación: suministra la diferencia de potencial
Electrodo positivo: ánodo
Electrodo negativo: cátodo

Cubeta:
Dos compartimentos con disolución tampón
Puente sobre el que se coloca el soporte

Soporte:
No restrictivos (carga eléctrica): membrana o papel (desuso)
Restrictivos (carga eléctrica y tamaño): gel de agarosa o poliacrilamida

- Factores que afectan a la velocidad:

Campo eléctrico: gradiente de potencial (voltios)

Mayor voltaje -> mayor velocidad -> mayor temperatura

Tamaño y forma de las partículas

Mayor tamaño -> menor velocidad
Forma esférica -> mayor velocidad

Soporte:
Mayor adsorción -> menor velocidad

Disolución tampón: controla pH y fuerza iónica del medio

Mayor fuerza iónica -> menor velocidad
 21
Tiempo
Mayor tiempo -> más distancia entre los componentes de la mezcla

- Procedimiento:
1. Preparación previa
Muestra: centrifugación
Gel de composición adecuada
Disolución tampón al pH adecuado
2. Colocación de la muestra dentro de los pocillos del gel
Moléculas con carga positiva -> ánodo
Moléculas con carga negativa -> cátodo
3. Adición de estándar o marcador (masas moleculares…)
4. Conexión del campo eléctrico a un tiempo determinado
5. Revelado: adición de colorante para apreciar bien las bandas. UV.
6. Lectura: interpretación con ayuda del marcador.

- Tipos de electroforesis

• Electroforesis en gel de agarosa: separación de fragmentos de ADN

• Electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE): separación de proteínas. Amplio

intervalo de tamaño de poro.
Condiciones no desnaturalizantes
 22
Condiciones desnaturalizantes: agentes desnaturalizantes más comunes:
mercaptoetanol, ditiotritol (DTT), urea y algunos detergentes (SDS:
dodecilsulfóxido)

*SDS-PAGE: separación de proteínas por masa molecular, aporta carga negativa a

la proteína proporcional al número de aminoácidos

5. MÉTODOS DE SEPARACIÓN CROMATOGRÁFICA

CROMATOGRAFÍA
Técnica analítica de separación de una mezcla de solutos (analitos) basada en la
diferencia de velocidad de los mismos al ser arrastrados por una fase móvil (eluyente) a
través de una fase estacionaria.
Separa compuestos por la a nidad de los analitos con distintos disolventes
Las partículas siempre se mueven igual ante las mismas condiciones

- Componentes: el sistema consta de dos partes:

• Fase estacionaria: soporte rígido donde se sitúa la muestra
• Fase móvil: mezcla de disolventes que se hace pasar por la fase estacionaria
(eluyente)

- Tipos de cromatografía:

Según la fase estacionaria:

Cromatografía en capa na
Cromatografía de columna

Según el estado de los componentes

Cromatografía de líquidos
Cromatografía de gases
fi
fi
 23
Cromatografía en capa na
• Fase estacionaria: capa na de Alumina o sílice
• Fase móvil: mezcla de disolvente de distinta polaridad según la muestra

Procedimiento:
1. Disolución de la muestra
2. Preparación de fase móvil en la cámara cromatográ ca (10ml)
3. Preparación de la fase estacionaria (línea a lápiz)
4. Adición de la muestra con capilar en la fase estacionaria
5. Fase móvil se desplaza sobre fase estacionaria (2/3 partes)
6. Se saca y se calcula los factores de retención (Rf)

Cromatografía en columna:
• Fase estacionaria: columna de Alumina o sílice
• Fase móvil: mezcla de disolventes de distinta polaridad según la muestra

Procedimiento:
1. Preparación de la columna
2. Disolución de la muestra
3. Introducción de la muestra en la super cie de la columna
4. Adición de fase móvil / fases móviles
5. Recogida de las distintas fracciones
fi
fi
fi
fi
 24
Cromatografía en columna (HPLC) (High performance liquid chromatography)
• Fase estacionaria: columna de alumina o sílice
• Fase móvil: mezcla de disolventes de distinta polaridad según la muestra

Procedimiento
1. Disolución de la muestra e introducción en la columna
2. Adición de la fase móvil / fases móviles
3. Recogida de las distintas fracciones -> cromatograma
4. Adición de exceso de fase móvil para limpiar la columna

CROMATOGRAMA

Representación grá ca con información de los analitos

- tR: Tiempo de retención

- tM: tiempo muerto (del propio equipo, analito sin interacción con fase móvil)
fi