Espectroscopia

Ultravioleta-Visible
(UV-VIS)
Conceptos Generales Cuando una sustancia absorbe el máximo de luz a una determinada
longitud de onda, se da una relación única entre la sustancia y su espectro

La espectroscopia
UV-VIS. Esta relación puede servir para:

ultravioleta-visible
(UV-VIS)
•Análisis cualitativos, es decir, determinar la presencia de ciertas
sustancias.

▪Por ejemplo, la determinación de caroteno en aceites y grasas

comestibles.

•La identificación de contaminación, como el cromo y el hierro en el agua.

•Análisis cuantitativos, es decir, determinar las cantidades de ciertas

sustancias.

•Por ejemplo, la determinación de la concentración de sustancias en el

agua.

• La determinación de la unidad de amargor de las bebidas alcohólicas,

• La medición del contenido de azúcar en las bebidas y la cuantificación de

las proteínas.
¿Qué es la
espectroscopia
La espectroscopia Ultravioleta-Visible es un tipo de espectroscopia de
absorción en la que se ilumina una muestra con rayos

ultravioleta-visible?
electromagnéticos de varias longitudes de onda en el rango ultravioleta

Según la sustancia, la muestra absorbe parcialmente los rayos de luz

ultravioleta o visible.

El resto de la luz, es decir, la luz transmitida, se registra como una

función de la longitud de onda mediante un detector adecuado.

El detector produce entonces el espectro UV-VIS único de la muestra

(también conocido como el “espectro de absorción”).
¿Qué son la
Cuando la luz incide en un objeto, este puede absorberla, normalmente
porque la longitud de onda de la luz absorbida corresponde a una

absorbancia y la
excitación electrónica en el objeto.

El resto de la luz se transmite, es decir, atraviesa el objeto.

transmitancia? En un espectrofotómetro, la transmitancia se mide dividiendo el espectro

de intensidad de la luz transmitida a través de una muestra (I0) por el
espectro de intensidad de la luz transmitida a través del blanco (I).

La absorbancia (A), también conocida como “densidad óptica”)

Es la cantidad de luz absorbida por el objeto y puede expresarse de la

siguiente manera:

La transmitancia (T) óptica se refiere a la cantidad de luz que atraviesa

un cuerpo, en una determinada longitud de onda.
La región UV
La Region UV se define como el rango de El espectro de absorción es una representación
longitudes de onda de 195 a 400 nm. gráfica que indica cantidad de luz absorbida (ε) a
diferentes valores
Es una región de energía muy alta.

Y
A partir de una solución diluida de un compuesto,
Provoca daño al ojo humano, así como cuya absorbancia máxima entra dentro del rango de
quemadura común. medida del espectrofotómetro, se verá el valor de

El Espectro de
absorbancia a diferentes longitudes de onda
Los compuestos con dobles enlaces
aislados, triples enlaces, enlaces peptídicos, A partir del espectro de absorción se obtendrá el
sistemas aromáticos, grupos carbonilos y

Absorción
valor de λ al que el compuesto presenta la mayor
otros heteroátomos tienen su máxima absorbancia (λ max).
absorbancia en la región UV, por lo que ésta
es muy importante para la determinación El espectro de absorción de un cromóforo depende,
cualitativa y cuantitativa de compuestos fundamentalmente, de la estructura química de la
orgánicos. molécula.
PARTES DE UN
EQUIPO DE UV
 Las transiciones electronicas en moleculas organicas implican la absorcion
de radiacion UV-VIS por electrones situados en orbitales n, π o σ de las
moleculas lo que provoca su promocion orbitales anti-enlazante de energia
supeior (estado excitado)
Transiciones
electronicas UV
-VIS
 1.- Transiciones σσ*. Se presentan en todos los compuestos
orgánicos. Son en general de gran energía e intensidad.
2.-Transiciones σπ* y πσ*. Son posibles solo en compuestos
insaturados. Son transiciones de baja intensidad en el UV
Tipos de lejano. Carecen de interés práctico.
transiciones 3.-Transiciones nσ*. Se presentan en compuestos con
heteroátomos (O, N, S, Hal), generalmente en la región
cercana a los 200 nm.
4.- Transiciones ππ*. Presentes solo en compuestos
insaturados. En ausencia de conjugación estas transiciones se
presentan en UV de vacío.
5.-Transiciones nπ*. Presentes en compuestos insaturados
con heteroátomos.
 ¿Cómo se
utiliza?
Espectrofotómetro
Modelo UV-2601
 Gama de longitud de onda: 190-1100nm
Temperatura: 5° - 35°
Power: 200w

Anchura de banda espectral: 2nm (5nm, 4nm, 1nm opcionales)

Exactitud de la longitud de onda: & plusmn; 0.3nm

Especificacione Reproductibilidad de la longitud de onda: & le; 0.15nm

s Sistema fotométrico: UV

Exactitud fotométrica: & plusmn; 0.3%

Modo de trabajo: T, A, C, E
 (1) Funciones de autodiagnóstico
(2) Los parámetros se pueden guardar. El instrumento guarda los
parámetros configurados por el usuario automáticamente.
(3) Medición de escaneo de longitud de onda (WL Scan)
(4) Modo de medición de longitud de onda fija (medición
fetométrica)
(5) Modo de medición cuantitativa (Cuantificación)
Funciones (6) Modo de medición de cinética (T'ime sean)
principales
 •Determinación de grupos funcionales en moléculas
orgánicas
•Análisis de muestras bioquímicas

Aplicaciones •Determinación de metales en compuestos de

coordinación
Generales •Análisis de semiconductores
•Medidas de color
•Determinación cuantitativa
•Seguimiento de la cinética de procesos químicos y
bioquímicos
 La elección de la cubeta
adecuada implica seleccionar el
material y el tamaño apropiados
en función de la muestra y el
instrumental.
El material de la cubeta debe
tener suficiente capacidad de
transmisión a una longitud de
onda determinada. La
atenuación de la luz en las
¿Cómo se paredes de la cubeta no debería
afectar al resultado de los
elige la cubeta análisis

adecuada para Ejemplo:Las cubetas de vidrio

no se usan en la región
los análisis? ultravioleta para los análisis por
debajo de 370 nm, ya que
absorben la radiación. Se
recomienda usarlas únicamente
en la región visible.
 Al manipular las cubetas, llévelas siempre por los lados esmerilados. Evite
tocar las superficies ópticas transparentes con los dedos, ya que las
huellas dactilares pueden provocar una absorbancia significativa y, por
tanto, afectar a la exactitud.
Evite usar pipetas de vidrio de Pasteur para llenar la cubeta; podrían rayar
la superficie óptica y causar más interferencias. Se recomienda emplear
las pipetas con puntas de plástico desechables.

LIMPIEZA
La limpieza de las cubetas influye notablemente en los resultados,
¿Cómo por lo que debemos considerarla como un factor de gran importancia.
manipular •Se recomienda seguir estos pasos para limpiar en profundidad las
cubetas de cuarzo:
correctamente
•Sumerja las cubetas en la solución de limpieza.
las cubetas?
•Retire la solución de limpieza y enjuague las cubetas con agua
desionizada.
•Lave las cubetas con etanol o acetona, salvo en los casos de
proteínas (consulte la tabla siguiente).
•Seque las cubetas con un paño sin pelusa y dejándolas secar al aire
o en un horno.
 funcionamiento del software UV 3.2.
Conexión del instrumento Haga clic en "Conectar" en la parte
inferior izquierda de la ventana. Aparecerá un mensaje
"Conectar con éxito".

Instrucciones
de
funcionamient Inicialización del sistema Haga clic en "Inicialización" en la parte
inferior izquierda de la pantalla. Aparecerá un mensaje como
o se muestra
 Para utilizar un espectrofotómetro hay que preparar una serie
de diluciones con concentración conocida. Una de estas
muestras no contendrá soluto y es conocido como el
“BLANCO”. Se usa para ajustar el instrumento para leer
transmitancia del 100 % o 0 de absorbancia.
Blanco
Paso 2
Paso 4
 Relacion entre la cantidad de radiación absorbida y la
concentración
Ley de
Beer
La ley de Beer afirma que la totalidad de luz que procede de
una muestra puede disminuir debido a...
 El número de materiales de absorción en su
trayectoria, lo cual se denomina concentración

Tres fenómeno Las distancias que la luz debe atravesar a través

s de la física, de las muestra. Denominamos a este fenómeno,
distancia del trayecto óptico
que serían los
siguientes:
Las probabilidades que hay de que el fotón de esa
amplitud particular de onda pueda absorberse
por el material. Esto es la absorbencia o también
coeficiente de extinción.
 La ley tiende a no ser válida para concentraciones muy
elevadas, especialmente si el material dispersa mucho la luz.

Limitacione
s de la Ley La ley de Beer solo se cumple en disoluciones diluidas,
de beer aconcentraciones del orden de 10 ^ -2 M, por encima de este
valor la recta se curvadebido a que a medida que aumenta la
concentración de especies absorbentes, estas se van
aproximando entre ellas hasta que se pone en marcha las
interaccioneselectrostáticas.
 Tenemos que se puede escribir la siguiente forma exponencial:

Expresando la ecuación anterior en forma logarítmica se llega a:

En 1852, Beer (A. Beer, Ann. Physik Chem., 86 (1852) 78] y Bernard [F. Bernard, Ann. Chim. et Phys., 35 (1853)
385] establecieron que una ley similar rige la dependencia entre T y la concentración c:
 En la que k es una nueva constante, y entonces

Al combinar estas dos leyes se obtiene la ley de Beer,

donde a es una constante que resulta de la combinación de k y k', y

 Definir un término nuevo, absorbencia:

Nótese que la absorbencia es la directamente proporcional a la concentración.

 El producto de la
absortividad por el peso
molecular de la
sustancia absorbente se Donde:
llama absortividad molar A= Absorbencia
. Entonces, £= Coeficiente molar de extinción
b= Longitud de trayectoria (en cm)
c= Concentración molar
Absorción de la radiación.
P0 potencia de la radiación
incidente,
P potencia de la radiación
transmitida,
c concentración,
b distancia recorrida por la
radiación.
 Curva de Calibración.
Linealidad: es la capacidad del método para producir resultados proporcionales a la
concentración del analito en las muestras dentro de un determinado rango.

En las medidas UV-Vis la relación lineal mas usual es la ley de Beer.

Una curva de calibración lineal que relacione la absorbancia con la concentración debe
tener la forma:
A= kC

Donde:
A es la absorbancia.
k es el factor de calibración (pendiente de la curva de calibración).
Para construir una curva de calibración deben medirse los espectros de un grupo de al
menos, tres disoluciones patrón del analito.

Para determinar que valor o valores de longitud de onda dan lugar a una mejor exactitud, se
miden los espectros de un grupo de patrones y se construyen curvas de calibración a todas
las longitudes de onda, por lo tanto, se requiere de una muestra de calibración conocida
(muestra en la que se determino la CA con técnica diferente).
Para determinar la precisión de un método, se preparan un grupo de unas 10–20
muestras con la misma concentración se miden y se calcula la cantidad de analito.

La desviación estándar de los resultados es una medida de la precisión.

Sensibilidad: se refiere a la respuesta obtenida para una determinada cantidad de analito en
la que se indican los dos factores analíticos: el límite de detección (LOD) y el límite de
cuantificación (LOQ).

Límite de detección (LOD):

Es la concentración más baja del analito que puede ser detectada pero no necesariamente
cuantificada, en matrices de muestra. En general, el LOD es el punto al que la señal del
analito es igual a tres veces el ruido de la medida. Los resultados de las medidas de algunos
espectrofotómetros listan las desviaciones estándar basadas en el ruido de la medida. El
LOD es, aproximadamente, tres veces la desviación estándar.

Límite de Cuantificación (LOQ):

Es la concentración más baja del analito que puede determinarse con una precisión y
exactitud aceptables, en matrices de muestra. Para calcular el LOQ, deben definirse los
límites aceptables de precisión y exactitud.
Referencias:
1.- Espectroscopia ultravioleta al vacío . Vol 1. Métodos experimentales en ciencias
físicas. Elsevier; 2000: 347-377.
2.- Sánchez Rojas F, Bosch Ojeda C. Desarrollo reciente en espectrofotometría derivada
de absorción ultravioleta / visible: 2004-2008