Estudios citogenéticos: citogenética clásica y molecular

Estudios citogenéticos desde las de mayor a menor tamaño.

Citogenética humana: es la disciplina que tiene por objeto el estudio de la morfología, estructura
y comportamiento cromosómico y su relación con la patología genética.
El complemento cromosómico es característico de cada especie.

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Existen tres constantes cromosómicas: número, morfología, estructura.
Cada célula humana posee 46 cromosomas en metafase.
Para la técnica de citogenética necesitamos:
1. Cultivo de linfocitos:
• Toma de muestra: extracción de
sangre periférica, es la forma
más sencilla y menos invasiva de
obtención de material genético.
• Heparinización: para evitar la
coagulación.
• Medio de cultivo: suero fetal
bovino rico en nutrientes
necesarios.
• Fitohemaglutinina: estimulador
de la división celular y formación
de cromosomas.
• Estufa a 37°C1 por 72hs2.

2. Preparación del material a analizar:

• Arresto mitótico: colchicina3.
• Shock hipotónico: KCl4 para causar el aumento del volumen de la célula, la lisis de
las membranas plasmática y nuclear permitiendo la dispersión de los cromosomas
para una mejor observación.
• Fijación: MeOH:AcH5.
• Colocación en portaobjetos para la observación en MO.

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Simula la temperatura corporal.
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En 72 hs pueden realizarse al menos 3 ciclos celulares para la obtención de mayor cantidad de células
posibles.
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Colchicina: evita la polimerización de microtúbulos necesarios para la división celular, lo cual mantiene
unido los cromosomas a sus cromátides hermanas y no migran hacia los polos opuestos.
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KCl: cloruro de potasio.
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MeOH:AcH: metanol en ácido acético.
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Cromosoma metafásico:
Se observan al microscopio óptico y se estudia su número y estructura.
Estructura general de cromosomas:

• Centrómero: constricción primaria que mantiene unidas a las

cromátides hermanas. La altura del centrómero determina la
constitución del cromosoma.
• Cromosoma corto (p, petit).
• Cromosoma largo (q).
• Telómeros: regiones terminales de los cromosomas, implicadas
en el envejecimiento celular. En estas regiones se encuentran
genes relacionados con el desarrollo neuroconductual.

Morfología cromosómica:
Se diferencian de acuerdo al tamaño y la posición del centrómero.

Los satélites de los cromosomas acrocéntricos contienen información genética ribosomal. La falta
de satélites no desarrolla fenotipos severos gracias a los satélites de otros cromosomas
acrocéntricos.

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Cariotipo por bandeo G:

• Cada par cromosómico tiene un patrón de bandas específico.

• El número de bandas de cada par depende de la condensación. A medida que un
cromosoma se elonga, es decir, esta menos condensado, se observan mayor cantidad de
bandas.
• Nivel de resolución: mayor a 5Mb6.

Ideograma de la representación de las bandas del cromosoma.

ISCN: acuerda la nomenclatura para la identificación de determinada región en determinado
cromosoma.
1. N° de cromosoma.
2. Brazo: p o q.
3. Región.
4. Banda.
5. Sub-banda.

El bandeo G permite la observación de anomalías cromosómicas tanto numéricas (ej. t21) como
estructurales balanceadas sin pérdida de material genético.

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No se pueden observar regiones de menor tamaño.
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Fluorescent in situ hibridation (FISH):
Es una técnica que se basa en la
hibridación de una sonda de ADN
marcada con una sustancia
fluorescente sobre una secuencia
complementaria del genoma fijado
a un soporte sólido. Es utilizada
para la detección de anomalías
crípticas que son variaciones en
la estructura del cromosoma
menor a 3Mb que no se detectan
con bandeo G.
Se inicia con el cultivo de linfocitos de sangre periférica, luego se desnaturaliza el material genético
para su posterior hibridación con sondas marcadas y su observación a MO.

Aplicaciones del FISH:

• Diagnóstico prenatal.
• Diagnóstico postnatal.
• Oncología: tumores sólidos, oncohematología (leucemias).
Para la detección de síndromes de microdeleción se utiliza FISH.
Síndromes de microdeleción: causados por una deleción cromosómica que involucra uno o varios
genes contiguos. La deleción es muy pequeña como para ser detectada bajo el microscopio usando
métodos citogenéticos convencionales. Los síndromes de microdeleción más frecuentes son:

• Di George: del(22)(q11.2q11.2).
• Prader Willi: del(15)(q11q13) paterna.
• Angelman: del(15)(q11q13) materna.
• Smit Magenis: del(17)(p11.2p11.2).
• Miller Diecker: del(17)(p13.3p13.3).
• Williams7: del(7)(q11.23q11.23).
• Kallman: del(X)(p22.3p22.3).

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Síndrome de Williams: es una enfermedad genética que afecta muchas partes del cuerpo. Se caracteriza
por discapacidad intelectual leve a moderada, personalidad con características únicas, rostro distintivo,
problemas del corazón, y vasos sanguíneos (cardiovascular). Se hereda de forma autosómica dominante,
aunque la mayoría de los casos son esporádicos, sin que haya otros casos en la familia.
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Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA):
Consiste en el análisis de múltiples regiones de cromosomas.
1. Hibridación: utiliza sondas de ADN complementarias a la secuencia a estudiar. Estas sondas
están formadas por 2 hemisondas: primer forward y primer reverse, cada hemisonda es
complementaria a una secuencia específica.
2. Ligación: se utiliza una enzima ligasa para que las hemisondas se unan entre sí.
3. Amplificación: se amplifican las sondas ligadas por PCR, no se amplifica todo el ADN.
4. Electroforesis capilar (EC): el patrón de picos es generado sobre la muestra de un paciente
y una muestra de ADN de referencia (control sano). Se compara la altura relativa de los picos
y las diferencias reflejan los cambios en el número de copias.

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Mediante EC observamos distintos picos. Estos picos cuando se trata de información contenida en
cromosomas autosómicos nunca estarán en 0 porque generalmente las deleciones o duplicaciones se dan
en un solo cromosoma del par, por lo cual la elevación del pico corresponde al cromosoma “sano”.
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Ventajas de MLPA:
• Acorta el proceso significativamente, investigando varias regiones cromosómicas al mismo
tiempo.
• Es una alternativa precisa, confiable y rentable con respecto a FISH en el screening de
Síndromes de Microdeleción. Además, puede estimar la extensión de la deleción.
Aplicaciones de MLPA:
• Enfermedades asociadas a deleciones/duplicaciones de uno o más exones de un gen. Por
ejemplo, distrofia muscular de Duchenne/Becker (DMD/DMB), permite determinar si el
genotipo es hemicigota (XY, hay pérdida completa de material genético) o heterocigota (XX,
hay cierta cantidad de material genético que se expresa compensado por el X sano).

Hibridación genómica comparada [Array Comparative Genomic Hibridation (aCGH)]:

Esta técnica consiste en la hibridación de manera competitiva entre el ADN del paciente y el ADN
control. Permite identificar variaciones en el número de copias o ACN.
1. Preparación de la muestra el ADN genómico: tanto de la muestra como el de referencia son
preparados utilizando técnicas estándar de biología molecular.
2. Marcado: el ADN genómico de referencia y el de la muestra son marcados con un
fluorocromo específico, independientemente con Cy3 y Cy5 (por ejemplo, el paciente de
verde y el ADN control de rojo).
3. Hibridación: el ADN genómico de referencia y el de la muestra son hibridados a la plataforma.
El array (plataforma) es escaneado a diferentes longitudes de onda, 532nm (para la marca
Cy3) y a 635nm (para la marca Cy5).
4. Análisis de la información: las pérdidas y ganancias en el número de copias son identificados
utilizando un algoritmo incluido en el software.

La resolución del Array-CGH está determinada por la densidad y el tamaño de los segmentos
inmovilizados en las plataformas. Las plataformas se fueron desarrollando para el análisis de un
cromosoma entero, porciones de un cromosoma, regiones específicas, y el genoma entero.
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Mediante Array-CGH se pueden estudiar:
• Genes implicados en el desarrollo.
• Regiones asociadas a Autismo.
• Regiones psedoautosómicas.
• Sondas subteloméricas.
• Regiones criticas para síndromes de microdeleción y microduplicación.

Secuenciación:
La secuenciación Sager es la técnica “Gold estándar”. Está técnica fue utilizada para el proyecto
de secuenciación del genoma humano, en el cual se conoció que el número de genes presentes
en nuestro genoma es alrededor de 20.000.
Aplicación de secuenciación:
Identifica y estudia mutaciones puntuales: sustitución, inserción, deleción. Estas mutaciones
puntuales pueden dar lugar a mutaciones naturales, silenciosas, con sentido equivocado,
finalizadora, etc.
Las secuencias presentan mutaciones:
• Polimorfismos de único nucleótido (SNP): los polimorfismos son variaciones en la
secuencia presentes en más del 1% de la población que no determinan una patología, sino
incluso ventajas.
• Variaciones de único nucleótido (SNV): pueden estar asociadas o no a patologías
genéticas.