En breve empezamos…
Temario:
Clase 1:
Definiciones importantes – Introducción.
Instrumental: Introducción, Reservorio de la fase móvil, Tuberías, Uniones, Bombas, Sistemas de gradiente,
Inyectores, Detectores, Sistema de toma y procesamiento de datos.
Clase 2:
Bases de la Separación: Bases de Separación, Nomenclatura y Cálculos, Procesos de Ensanchamiento de Banda.
Solventes: Propiedades de los Solventes, solventes y aditivos de fase reversa, solventes de fase normal, preparación
de las fases móviles.
Clase 3:
Cromatografía de Fase Ligada: El material de relleno, cromatografía en fase reversa.
Cromatografía en Fase Normal: Materiales de Relleno, Fase Móvil, Mecanismo de la separación, Desarrollo de
métodos.
Clase 4:
Preparación de las muestras: Metodologías Convencionales, Extracción en Fase Sólida, Intercambio de Columna,
Derivatización.
Análisis Cuantitativo: Muestreo, Preparación de la muestra, Inyección de la muestra, Separación cromatografía,
Detección, Integración de la señal, Cálculo de la concentración de analito.
Clase 5:
Desarrollo de Método: Introducción, Ajuste de parámetros cromatográficos, Selección de la fase móvil, Efectos
secundarios.
Tendencias en Tecnología HPLC: UPLC
Introducción a la Validación de Metodologías HPLC
Clase 1:
• Ventajas • Desventajas
• Falta de operadores
• Versatilidad experimentados
• Excelente capacidad en análisis • Entrenamiento en
de trazas universidades escaso
• rapidez • Alto costo de equipamiento,
• Adaptabilidad al análisis entrenamiento recae en
cuantitativo fabricantes o químicos
experimentados en la materia.
Campos de Aplicación de HPLC
Fármacos: Antibióticos, sedantes esteroides, analgésicos
Bioquímica: Aminoácidos, proteínas, carbohidratos, lípidos
Productos de alimentación: Edulcorantes artificiales, antioxidantes, aflatoxinas, aditivos
Productos de la industria química: Aromáticos condensados, tensoactivos, propulsores,
colorantes
Contaminantes: fenoles, Pesticidas, herbicidas, PCB
Química forense: Drogas, venenos, alcohol en sangre, narcóticos
Medicina clínica: Ácidos biliares, metabolitos de drogas, extractos de orina, estrógenos.
Algunas aplicaciones importantes de la HPLC preparativa
Separación y purificación de metabolitos
Separación y purificación de los metabolitos de las drogas procedentes de muestras de
orina
Purificación y separación de enantiómeros
Purificación de compuestos naturales
Purificación y caracterización de enzimas y proteínas
Definición:
Según la IUPAC, la Cromatografía es un método físico de
separación, en la cual los componentes a ser separados,
son distribuidos entre 2 fases, una de las cuales es fija
(fase estacionaria) mientras que la otra es móvil (fase
móvil) en una dirección definida.
• Naturaleza de la Fase Móvil:
M
o Cromatografía Gaseosa (GC) fase móvil es un gas.
d
Cromatografía Líquida (LC) Cromatografía en capa delgada(TLC)
a fase móvil es un líquido Cromatografía líquida en columna abierta
l Cromatografía líquida de alta performance
(HPLC)
i
d
a • Naturaleza de la Fase Estacionaria
d
Cromatografía Líquido – Sólido (LSC) FE= sólido, FM= líquido
e Cromatografía Líquido – líquido (LLC) FE= líquido, FM=Líquido
s Cromatografía gas – líquido (GLC) FE=Líquido, FM=gas
Cromatografía Gas – Sólido (GC) FE=Sólido, FM=Gas
I.- Introducción
• Fenómenos que ocurren en la columna
M Cromatografía de fase normal
o Afinidad Cromatografía en fase ligada
Cromatografía de intercambio iónica
d
a Tamaño molecular Cromatografía de Permiación por Geles
l Cromatografía de Filtración por Geles
i
d • Cantidad de muestra aplicada
a
Si la cromatografía utilizada no destruye la muestra es posible recuperar el analito
d separado de su matriz a la salida del detector.
e
Cromatografía Analítica (pg hasta µg),
s Rango semipreparativo (µg hasta gramos),
Rango preparativo (mayores a un gramo).
II.- Instrumental
Cada una de sus partes están reunidas
en un gabinete y su intercambio o
conexión con otros componentes de la
Integrados : misma marca o diferentes en difícil.
Permiten ahorro de espacio, menos
cables y tuberías y conexiones
• Equipos expuestas, menores riesgos frente a
operadores inexpertos.
Los módulos son instrumentos
Modulares: individuales que permiten no solo
armar el equipo según la necesidad del
analista sino aumentar la complejidad
según esa necesidad varíe.
II.- Instrumental
• RESERVORIOS DE LA FASE MÓVIL
Recipiente que contiene la fase móvil. Se ubica siempre algunos centímetros sobre el
nivel de la bomba para que la fuerza de gravedad dirija el solvente hacia ésta,
manteniendo llena las conexiones.
- vidrio o polímero resistente.
- tapa para prevenir el ingreso de
partículas ambientales al sistema y diseñadas
para la desgasificación continua y mantener
presión positiva del gas sobre el solvente
venteando en exceso.
- Con filtro de acero o vidrio poroso (2 a10
µm de porosidad).
- Tapas especiales.
II.- Instrumental
• TUBERÍAS
La fase móvil debe circular por tuberías que conectan:
reservorio de solvente
Inertes
bomba Resistentes a altas presiones
inyector
detectores
colector de fracciones
válvulas de distribución
LARGO MAXIMO (cm) PARA UN
CARACTERISTICAS DE LA COLUMNA INCREMENTO DE UN 5% EN EL
ANCHO DE BANDA
L ID dp DIAMETRO DE LA TUBERIA
(mm) (mm) (μm) N
0.18 mm 0.25 mm 0.50 mm
33 4.6 3 4400 22 9 *
50 4.6 3 6677 33 14 *
100 4.6 3 13333 67 27 *
150 4.6 5 12000 167 68 *
250 4.6 10 10000 556 228 14
250 4.6 5 20000 278 114 *
250 2.0 5 20000 50 20 *
250 1.0 5 20000 12 * *
II.- Instrumental
• UNIONES
Permiten conectar tuberías y con ellas los diferentes componentes del sistema.
2 tipos de uniones: Convencionales y las universales.
Deben ser inertes a fases móviles y muestras
Cerrar herméticamente
No deben contribuir en forma notable a ensanchamiento de banda extracolumnar por la
presencia de volúmenes muertos.
1/16” FERRULE
1/16” NUT
1/16” O.D.
TUBING
II.- Instrumental
•Suministrar un caudal constante y libre de la
• BOMBAS fase móvil a través de la columna, sin que le flujo
sea influido por la presión en la cabeza de la
columna
•
• Características:
•Materiales químicamente inertes a la fase móvil.
Resistentes al ataque químico y desgaste mecánico:
•Acero inoxidable, Zafiro, Rubí, teflón.
•Trabajo a presiones elevadas.
•Proporcionar Flujo libre de pulsaciones (ruido de
fondo, disminuye sensibilidad).
•Suministrar Flujos adecuados para los diferentes tipos
de columnas.
•Caudal constante a lo largo del tiempo
(reproducibilidad de tiempos de retencion).
II.- Instrumental
Bomba reciprocante de un Bomba reciprocante de
solo pistón doble pistón
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II.- Instrumental
SISTEMA DE GRADIENTES
•Puede seguir un perfil lineal, cóncavo, convexo o
una mezcla de estos mismos perfiles en un mismo
•HPLC isocrático capaz de separar entre 10 a 12 cromatograma. El gradiente de solventes se gradúa
picos analíticos. por el intervalo de variación es decir por la
velocidad de cambio del solvente débil al fuerte.
•En Sistemas mas complejos se tiene dos
alternativas: •En todos los casos el gradiente debe comenzar
•Corrida multidimensional (intercambio de con el solvente débil aumentando gradualmente la
columna). fuerza de la fase móvil que recibe la columna.
•Gradiente de solventes. •No confundir la programación de solventes con la
•Se varía la composición de la fase móvil programación de caudales. La primera involucra un
(contenido porcentual del componente “fuerte cambio efectivo de la fuerza de elución de la fase
de la mezcla”), comenzando la elución con un móvil; la segunda es modificación del caudal de
solvente débil y aumentando progresivamente trabajo.
la proporción del componente “fuerte”.
II.- Instrumental
INYECTORES
• Dispositivo que permite introducir la
muestra en solución son interrumpir el
• Características:
caudal de solvente a través del
sistema. • Fácil de operar
• Inerte al ataque químico y capaz
de soportar altas presiones.
• preciso en cuanto a la cantidad de
muestra introducida en el
sistema.
• No debe provocar diluciones
importantes se la solución
inyectada.
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II.- Instrumental
Inyectores Automáticos
• Precisión mayor a métodos
manuales.
• No depende de la habilidad del
operador.
• Contiene:
Válvula de inyección
Mecanismo de llenado
Dispositivo para colocar las muestras
(bandeja)
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II.- Instrumental
DETECTORES
• Permite ver y ubicar en el tiempo y espacio la posición de cada
componente e una muestra a la salida de la columna
cromatográfica
Características:
Amplio rango dinámico de • Sensibilidad apropiada
respuesta. • No afectarse por cambio de
Debe poseer respuesta lineal. temperaturas
No debe contribuir al • Poseer una buena relación
ensanchamiento de la banda Señal / ruido
extracolumnar. • No destruir la muestra
Responder a todos los solutos.
• Tener una constante de
tiempo baja
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Ruido y Deriva de un Detector
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II.- Instrumental
DETECTORES
Clasificación:
Mide el cambio de alguna propiedad física
Generales de la fase móvil que contiene el analito en
comparación con la misma fase móvil pura
Sensible a alguna propiedad del soluto, Ej. EL
detecto UV que produce una señal proporcional
a la absorbancia del soluto a una longitud de
onda dada. El detector de Fluorescencia
Selectivos detecta solutos con fluorescencia natural o
conferida por reacción con un reactivo
fluorogénico (Derivatización)
II.- Instrumental
• Detector de Índice de Refracción
Mide la diferencia de índice de refracción entre el solvente puro y el solvente que
contiene la muestra. Detector universal y no destructivo, poco sensible y se afecta a
cambios de temperatura. No puede hacerse programaciones de solventes porque el
cambio de la composición de la fase móvil se acompaña del cambio del índice de
refracción.
II.- Instrumental
Detector de Índice de Refracción
Cromatograma típico basado en el método de medición de desviación del ángulo.
II.- Instrumental
• Detector Ultravioleta
Posee buena sensibilidad y rango lineal. Detecta analitos en orden a
nanogramos. No es destructivo, puede usar gradientes de solventes, Debe
usar solventes transparentes en la longitud de trabajo. Permite cambiar el
volumen de la celda (1 a 12µL). Muy poco sensible a cambios de caudal y
de temperatura. Opera en rango de 190 a 350 nm alguno equipos se
extiende a la zona visible de 350 a 700 nm (UV-VIS).
La Concentración del analito se determina utilizando la ley de Beer: A=
a.b.c
tipos de detectores:
De Longitud de onda fija
De longitud de onda variable.
II.- Instrumental
Detector de onda fija o
Fotométrico Detector de Onda variable o
espectrofotométrico
II.- Instrumental
• Detector de Arreglo de Diodos
II.- Instrumental
• Detector de Arreglo de Diodos
II.- Instrumental
• Detector de Arreglo de Diodos
Pureza de Pico demostrado con DAD
II.- Instrumental
• Detector de Fluorescencia Detector de Florescencia de
Detector de Florescencia a una sola
longitud de excitación múltiples longitudes de excitación
II.- Instrumental
• Sistema de toma y procesamiento de Datos
El resultado de un ensayo cromatográfico es la obtención de fracciones
separadas de los componentes de la muestra y un gráfico o cromatograma de
cuya interpretación pueden extraerse conclusiones cualitativas y cuantitativas.
Este registro se obtiene a partir de la señal proveniente del detector por medio de
un sistema de toma y procesamiento de datos:.
• Registrador gráfico: convierte la señal
en un grafico del tipo X-Y.
• Integrador: Tratamiento matemático
para el cálculo de concentraciones.
• Computadora: Con un software
apropiado permite registrar los
cromatogramas, los cálculos
apropiados, la manipulación de datos,
almacenamiento de ensayos,
generación de reportes incluso manejo
global de varios cromatógrafos
