MICROSCOPÍA.

mecánica, gracias a los adelantos tecnológicos aplicados a

los componentes antes mencionados.
Se denominan compuestos porque la imagen se forma
CÉSAR E. MONTALVO ARENAS.
mediante la utilización de tres sistemas de lentes, cada uno
Agosto de 2010.
de ellos constituidos por lentes convergentes y divergentes.
El estudio detallado de los componentes de células y tejidos
Los sistemas de lentes son el condensador, los objetivos y
animales o vegetales, por el tamaño que poseen, requiere el
los oculares.
uso de instrumentos que permitan ampliar muchas veces
más la imagen de las estructuras que los constituyen.
En la actualidad, el microscopio fotónico es un instrumento
de uso cotidiano en los laboratorios de investigación y de
El instrumento que fue empleado por los primeros biólogos
diagnóstico así como en las aulas de enseñanza de Biología,
para estudiar la célula y los tejidos, es el microscopio. El
Embriologia, Histología, Microbiología y Patología.
nombre deriva etimológicamente de dos raíces griegas:
mikrós, que significa pequeño y skopéoo, que significa
COMPONENTES DEL MICROSCOPIO FOTÓNICO.
observar. Es decir el microscopio es un instrumento que
El microscopio fotónico compuesto esta integrado por tres
sirve para observar objetos o estructuras pequeñas.
tipos de componentes:
Existen dos tipos de microscopios que emplean la luz como
a) COMPONENTES MECÁNICOS: Son aquellos que
fuente de energía para formar imágenes aumentadas y
sirven de sostén, movimiento y sujeción de los sistemas
detalladas de objetos que a simple vista no es posible
ópticos y de iluminación así como de los objetos que se
observar:
van a observar. Éstos se muestran en la imagen del
microscopio de la figura microsc. 2:
a) Microscopio fotónico simple o lupa.
b) Microscopio fotónico compuesto.
“ Base o pié. Es un soporte metálico, amplio y sólido en
donde se apoyan y sostienen los otros componentes del
El microscopio simple o lupa es un instrumento de
microscopio.
amplificación de imágenes que consiste en la utilización de
una o más lentes convergentes en un solo sistema óptico.
“ Brazo, estativo o columna. Permite la sujeción y
Dependiendo de la curvatura de la superficie de la(s)
traslado del microscopio. Soporta al tubo óptico, a la
lente(s) las lupas pueden ampliar las imágenes de los objetos
platina y el revolver.
desde 5, 8,10, 12, 20 y hasta 50 veces. Forman una imagen
de mayor tamaño, derecha y virtual.
“ — Platina. Superficie plana de posición horizontal que
posee una perforación circular central. En ella se apoya
Los microscopios fotónicos compuestos que se emplean
la preparación (lámina portaobjetos que contiene a la
actualmente tienen sus antecesores en los instrumentos
muestra que se va a examinar) que se sujeta a la platina
ópticos desarrollados, en el periodo comprendido entre 1590
mediante pinzas o con un carrito o charriot que,
y 1610, por Hans (padre) y Zacarías (hijo) Janssen; quienes
mediante mandos especiales facilitan el movimiento de
mediante el tallado cuidadoso de lentes biconvexas
la preparación de derecha a izquierda y de adelante
construyeron los primeros microscopios compuestos (fig.
hacia atrás.
microsc. 1).

lente ocular tubo extensible lente objetivo “ Tubo óptico. Consiste en un cilindro metálico que
suele medir 160mm o 170 mm de longitud
(dependiendo del fabricante del microscopio) el cual en
un extremo, está conectado al revolver o portaobjetivos
y en el otro se relaciona con el (los) ocular(es).

« Revolver o portaobjetivos. Es un componente que gira

A alrededor de un eje con la finalidad que los objetivos
que sostiene coincidan de manera perpendicular con la
diafragma perforación central de la platina. En su superficie
inferior posee varios agujeros donde se atomillan los
Figura microsc. 1. Diagrama que muestralos componentes del
microscopio compuesto fabricado por los Jansen. objetivos.

A partir de esa época, el microscopio es el instrumento más “ Tornillos macrométrico y micrométrico.

utilizado en el estudio de células y tejidos. Se fue Generalmente están situados en la parte inferior del
perfeccionando, tanto en su parte óptica como en su parte brazo o columna. Pueden estar separados (en los
 microscopios antiguos) o el tornillo micrométrico está
incorporado en la circunferencia del tomillo
macrométrico (microscopios actuales). Ambos tornillos
platina

N
permiten el desplazamiento de la platina hacia arriba y
hacia abajo con la finalidad de acercar o alejar la
preparación hacia los objetivos y así conseguir un
enfoque óptimo de la imagen. N
Oculares — Condensador

Cabezal
Revolver- e
Objetivos
— Desplazamiento platina
Platina — Mucrométrico Diafragma
— Micrométrico Rayos luminosos
Foco —
Condensudor Figura microsc. 3. Diagrama de los principales componentes de un
Base condensador y recorrido de los rayos luminosos.
Está formado por una o dos lentes convergentes que
reúnen los rayos luminosos y los orientan hacia la
Figura microsc. 2. Principales componentes de un microscopio
fotónico compuesto abertura central de la platina. Mediante un mecanismo
de cremallera se acerca o aleja de la platina. También
El macrométrico produce desplazamientos evidentes y tiene incorporado un diafragma iris que regula la entrada
rápidos de la platina, en cambio el tomillo de luz Todo ello con la finalidad de concentrar la mayor
micrométrico produce movimientos imperceptibles de cantidad de rayos luminosos en el plano donde está
la platina y sirve para efectuar el enfoque fino y situado el objeto a observar. La mayoría de los
definitivo de la imagen. En la actualidad los condensadores de los microscopios actuales también
microscopios tienen incorporados a los mecanismos de poseen una apertura numérica que indica la cantidad de
desplazamiento de los tornillos macro y micrométricos, luz que puede captar y luego enviar hacia la preparación.
topes de seguridad que impiden que éstos continúen
descendiendo indefinidamente y así se evita roturas y
daños a la laminilla y a las lentes de los objetivos. Objetivos. Los objetivos están considerados los
elementos más importantes en la formación de la
Engranajes y cremallera. Constituyen mecanismos de imagen microscópica, ya que estos sistemas de lentes
desplazamientos de las diferentes partes del establecen la calidad de la imagen en cuanto a su
microscopio. nitidez y la capacidad que tiene para captar los detalles
de la misma (poder de resolución). Están constituidos
Cabezal. Es un componente situado en relación con el también por un juego de lentes, en este caso,
tubo del microscopio que alberga — principalmente convergente y divergente, para eliminar, en la medida
prismas o espejos que sirven para acondicionar en él de lo posible, una serie de aberraciones que afectarían
dos o más oculares, o sistemas mecánicos que soportan la calidad de las imágenes formadas.
cámaras fotográficas, de vídeo o sistemas de proyección
de la imagen. Las lentes se disponen dentro de un soporte o camiseta
de metal, en cuyo exterior están inscritas una serie de
anotaciones numéricas que indican, como se observa en
b) COMPONENTES ÓPTICOS: Son los objetivos, los
oculares, el condensador y los prismas. Los tres la figura microsc.4: el aumento propio del objetivo, la
primeros están constituidos por sistemas de lentes apertura numérica, el tipo de material con que están
positivos y negativos. tallados las lentes (de fluorita o semiapocromáticos) o la
calidad que tendrán las imágenes, al anularse en la
Condensador: Es el componente óptico que tiene como construcción de los objetivos, algunas aberraciones de
función principal concentrar y regular los rayos las lentes (acromáticos, apocromáticos, aplanáticos etc.)
luminosos que provienen de la fuente luminosa (fig. o si se debe usar alguna sustancia de inmersión.
micros. 3).
1
 aberración trae consigo la acentuación de otra, que es la
de curvatura de campo, pues la superficie focal de la
E o E , E 7 imagen es ligeramente curva, dando como resultado
T TO T
que, al observar la imagen y tratar de enfocarla en la
Flúor. Plan zona central del campo microscópico se desenfoca la
10/0.22 40/0.65 100/1.25 oil
zona periférica y viceversa.

« Planapocromdticos. Son los objetivos en los cuales se

han corregido la mayor cantidad de aberraciones como
— EA la cromática, curvatura de campo, de esfericidad y de
Figura micros. 4. Principales caracteristicas exter M]eñw'ns. astigmatismo; por lo tanto se obtienen imágenes
sumamente nítidas y el campo microscópico aparece
Los objetivos se fabrican para ampliar las imagenes de los totalmente plano, enfocado en toda su extensión. Son
objetos observados en diversos aumentos; así se tienen los objetivos que generan imágenes con mejor
objetivos con aumentos propios de 3.5 x, 4x, 10x, 25x, 40x, resolución, es preferible usarlos cuando se desea
65x y 100x. Algunos objetivos tienen alrededor de ellos una obtener imágenes fotográficas ( fotomicrografia).
línea coloreada que indica a simple vista el aumento propio.
La complejidad en la construcción de los objetivos y el
Los objetivos también se clasifican de acuerdo al medio que número de lentes que se utilizan aumenta conforme se van
existe entre el objeto examinado y la lente frontal del corrigiendo más aberraciones. Por ejemplo un objetivo
objetivo. De acuerdo a esta característica son secos o de planapocromático suele incorporar en su construcción entre
inmersión. Son objetivos secos aquellos que entre el objeto 10 a 12 lentes. Esto, en consecuencia, encarece el costo de
observado y el objetivo solamente existe el aire; en cambio ellos.
se denominan objetivos de inmersión aquellos que requieren La imagen que forman los objetivos es aumentada de
que entre la preparación y la lente frontal del objetivo se tamaño, invertida y real.
coloque una sustancia líquida, ésta puede ser agua, glicerina
o un “aceite de inmersión”, natural como el “aceite de Se mencionó al inicio del acápite que los objetivos están
cedro” o aceites artificiales. considerados como los integrantes más importantes del
microscopio, pues de la calidad de sus componentes
Otra clasificación de los objetivos se refiere al tipo de depende que, en la imagen generada a través de ellos, se
corrección al que deben someterse las lentes con la finalidad puedan observar una mayor cantidad de detalles. En otros
de disminuir o anular algunas aberraciones que se producen términos, los objetivos son los responsables de ofrecer
en las lentes, como las aberraciones cromática, de curvatura imágenes mejor resueltas.
de campo, astigmatismo y de esfericidad. Dependiendo de
las aberraciones corregidas los objetivos pueden ser: La capacidad que tienen los objetivos de formar imágenes
en donde se distingan más detalles del objeto examinado
“ Acromdticos. Estos objetivos corrigen los rayos depende de una serie de factores como los que se mencionan
luminosos azules y rojos haciéndolos coincidir en un a continuacion:
solo plano focal. En tanto que los otros rayos
coloreados se forman en otro plano focal generando una Índice de refracción: Se denomina así a la relación
imagen cuyos bordes se observan levemente difusos existente entre la velocidad de la luz en el aire y su
(espectro luminoso secundario). Los objetivos de los velocidad en el medio transparente utilizado. De la misma
microscopios “de estudiante” son acromáticos. manera, se pueden obtener los índices de refracción de una
serie de sustancias que se utilizan en la construcción y
“ Semiapocromáticos. Se les conoce también como tallado de las lentes de los objetivos.
objetivos de “fluorita”, corrigen el espectro secundario
dando como resultado imágenes de bordes más nítidos. La velocidad de la luz es de 300,000 Km/sg en el aire. Al
Por la alta capacidad que tienen para transmitir las atravesar un medio transparente como el vidrio del cual
radiaciones luminosas de onda corta, se les considera están fabricados las lentes de los microscopios, su velocidad
como los objetivos ideales para microscopía de se reduce a 200, 000 km./sg. Por lo tanto el vidrio tendrá un
fluorescencia. indice de refracción de 1.5; pues el índice de refracción de
un objeto o una sustancia transparente se expresa mediante
“ Apocromáticos. En estos objetivos se hacen coincidir la fórmula:
en un solo plano los rayos luminosos azules, rojos y Velocidad de la luz en el aire
verdes, obteniendo así una imagen de bordes IR=
sumamente nítidos, pero la corrección de esta Velocidad de la luz en el medio
A continuación se muestran los índices de refracción de una
serie de sustancias transparentes que se emplean en
microscopía para construir lentes o como sustancias de
inmersión:
Agua=1.3300
Aceite de inmersión = 1.5150
Fluorita = 1.4340
Vidrio (crown) =1.5200
Flint = 1.6600

Angulo de apertura: Es la capacidad de un objetivo de

captar los rayos luminosos refractados cuando éstos
atraviesan un medio transparente. Cuanto mayor sea este
ángulo, la lente frontal del objetivo aceptará una mayor Figura microsc. 6. Trayectoria de los haces luminosos en un objetivo
cantidad de ellos (fig. micros. 5).
seco.
En la figura 6 los rayos que emergen del objeto, al llegar a
esta interfase constituida por aire se refractan o su ángulo de
Objetivo inclinación es tal que sobrepasan el dngulo critico de
refracción, por lo que al llegar a la lente frontal del objetivo
se reflejan en la superficie y no son captados por la lente.

En la figura (b) el índice de refracción del aceite de

inmersión (1.52) es similar al del vidrio (portaobjetos,
cubreobjetos y la lente frontal del objetivo) por lo tanto los
rayos luminosos periféricos que emergen del objeto no se
(a) (b) desvían y pueden ser aceptados por el objetivo,
Figura microsc. 5. Rayos luminosos que forman el ángulo de apertura. incrementándose de esa manera la cantidad de rayos
luminosos que penetran al microscopio.
En el esquema anterior, el ángulo de apertura de la lente
frontal del objetivo capta varios rayos luminosos teniendo
como límite los rayos laterales del cono luminoso (líneas
continuas), en cambio los rayos pe cos (lineas
punteadas) no son aceptados. Esta capacidad de captacion
está dada fundamentalmente por la distancia que existe entre
el objeto y el objetivo. Así, se puede constatar que en la
figura Sa el ángulo de apertura es de aproximadamente
50°, en cambio en la figura 5b el ángulo es mucho mayor
(95°) donde se observa que la lente logra captar más rayos
periféricos.

Dependiendo del índice de refracción del material

transparente que forma la lente del condensador, o la
interfase (aire o sustancia de inmersión) que exista entre el Figura microsc. 6. Trayectoria de los haces luminosos en un objetivo de
objeto y la lente frontal del objetivo, el ángulo de apertura inmersión.
será mayor o menor.
Captación de rayos luminosos a través de objetivos secos A la mitad del ángulo de apertura se le denomina alfa (at),
y objetivos de inmersión. La figuras microsc. 6 y 7 por ejemplo si el ángulo de apertura de un objetivo es de
muestran la diferencia en la captación de rayos luminosos 50°, su valor alfa será de 25°. Este valor es importante pues
de un objetivo (a) donde la interfase es aire y, en el objetivo permitirá calcular un factor que tiene que ver directamente
(b) se ha colocado como interfase una sustancia de con la capacidad del objetivo para formar imágenes que
inmersión que posee un índice de refracción similar al del muestren más detalles, es decir mejor resueltas.
vidrio.
Apertura numérica (NA): Es una medida que indica la
Los rayos luminosos que atraviesan el aire se refractan más capacidad del objetivo de poder captar los rayos refractados
y por lo tanto su desviación es mayor porque el índice de por las estructuras finas de las cuales está constituido el
refracción del aire es igual a 1.0. objeto que se observa. Esta capacidad se traduce en el poder
del microscopio de formar imágenes que muestren al El PR (d) se expresa mediante la fórmula de Abbe:
observador una serie de detalles del objeto que se está
examinando. Cuanto mayor sea la apertura numérica de un
objetivo, éste tendrá una mayor capacidad de mostrar 1223 A 122 x A
detalles finos en la imagen que forma. d= d=
2 (NA) 2(NA objetivo + NA condensador)
La apertura numérica de un objetivo se calcula empleando la
(a) )
formula matemática siguiente:

NA= nxsena 06lx A 061x A

d= d=
Donde n representa el índice de refracción de la interfase NA NA objetivo + NA condensador
que separa el cubreobjeto de la muestra examinada y la lente
frontal del objetivo y a es la mitad del ángulo de apertura. Lacifra 1.22/2 6 0.61 es la constante de Abbe.
Esto significa que si empleamos un objetivo de AN = 1.25
La apertura numérica de un objetivo guarda una relación
con una longitud de onda de 560nm, el poder de resolución
directamente proporcional con el aumento propio del
será de 273nm, la cifra obtenida nos indica que el objetivo
objetivo y también con la capacidad que tiene de mostrar
será capaz de distinguir o resolver la imagen de dos puntos
mayores detalles. Por ejemplo en la relación de objetivos
que en el objeto están separados entre sí por 273nm. Si la
que se muestran se puede comprobar lo afirmado referente
separación de ellos es menor a esta cifra el objetivo no
al aumento del microscopio:
podrá distinguirlos como dos puntos separados.

Aumento del objetivo Apertura numerica

La cifra resultante de aplicar la formula se denomina limite
3.2x 0.07
de resolución.
4x 0.10
10x 0.22 Un cálculo más exacto del poder de resolución se obtiene
10x 0.25 cuando en la fórmula se añade la apertura numérica del
25x 0.45 condensador, tal como se observa en la fórmula (b). Cuando
40x 0.65 se efectúa correctamente la iluminación del objeto
63x 0.80 utilizando (adecuar la distancia apropiada del condensador y
100x 1.250il la regulación de captación de la luz abriendo o cerrando el
diafragma iris del mismo) la apertura numérica del
La mayoría de los denominados microscopios de estudiantes condensador, la imagen que forma el objetivo logra mostrar
que se fabrican en la actualidad vienen implementados (AN el máximo poder de resolución. Por ejemplo si se emplea el
y aumentos propios) con los objetivos que están señalados mismo objetivo del caso anterior (de AN = 1.25), el mismo
en negritas. tipo de luz (1. = 560nm) y se ilumina la muestra con un
condensador de AN = 80 es posible comprobar lo
Aumento de un objetivo. Es la capacidad que posee un mencionado anteriormente.
objetivo de ampliar la imagen del objeto observado. Se
define como la relación entre el tamaño de la imagen y el Al realizar los cálculos correspondientes resulta que el
objeto, en valores lineales (largo y ancho). poder de resolución del objetivo, sin tomar en cuenta la AN
del condensador, es de 273nm. En cambio cuando se incluye
En la relación anterior, un objetivo que tiene grabado en la la apertura numérica del condensador el resultado es de
camiseta la cifra 10x aumentará 10 veces el tamaño de la 166nm. Estas cifras nos demuestran que cuando se realiza la
imagen del objeto examinado. iluminación del objeto mediante el uso adecuado del
condensador, la capacidad del objetivo de resolver detalles
Poder de resolución. Se define así la capacidad de un mejora casi en un 60% más.
objetivo de poder distinguir /a distancia mínima que debe
existir entre dos puntos del objeto para que se puedan
visualizar como dos puntos separados. La calidad de una El máximo poder de resolucion que se puede obtener es de
imagen, en la que se observe la claridad, nitidez y la riqueza 0.2 pm aproximadamente, para lo cual se requiere que el
de detalles, depende del poder de resolución del objetivo. microscopio proporcione una imagen de un aumento total
de 1000x a 1400x.
El poder de resolución (PR) de un objetivo depende de la
longitud de onda (1) del rayo luminoso utilizado y la
apertura numérica del sistema óptico del objetivo.
OCULAR. consisten en que uno de ellos posee un sistema de lentes
Es otro componente óptico del microscopio, debe su nombre móviles que permite enfocar correctamente la imagen del
porque la imagen final se observa a través de él acercando el objeto, después que el enfoque total del microscopio se ha
ojo a la lente “ocular” del componente. realizado y se nota aún una imagen levemente desenfocada
en uno de ellos, generalmente el izquierdo, porque al
Es el encargado de formar una segunda imagen a partir de la observar la imagen a través de cada ocular derecho e
imagen primaria que forma el objetivo. La imagen del izquierdo se nota que una de ellas no está enfocada
ocular es de mayor tamaño, virtual y derecho. Esta imagen correctamente.
únicamente amplía un número determinado de veces (5x,
8x, 10x, 12x) a la imagen formada por el objetivo. No PRISMAS. En los microscopios modernos monoculares o
añade, por más aumentos propios que posea, ningún detalle binoculares, se requiere el empleo de prismas, estructuras
alos generados por el objetivo. transparentes que, en el caso de los microscopios
monoculares, sirven para desviar los rayos luminosos de la
En la generalidad de los casos, los oculares están trayectoria rectilínea del eje óptico del objetivo y dirigirlos
construidos por dos lentes convergentes (planos convexos). hacia el tubo óptico ligeramente inclinado y luego hacia el
La primera lente se denomina “de campo o frontal”, está ocular.
situada en la parte anterior del ocular (fig. micros.8) y, es la
encargada de recoger y ampliar la imagen generada por el
Superficie
sistema de lentes del objetivo. La lente posterior, en
reflectante
contacto estrecho con el ojo del observador, se denomina
lente “ocular” y es la responsable de aumentar nuevamente
la imagen y orientarla hacia el ojo del observador

Los oculares se clasifican, dependiendo de la disposición de

las lentes y del diafragma, dentro de la camiseta metálica rayos de luz dirigidos
hacia el tubo óptico y
que los contienen, en: el ocular
Oculares negativos de Hiiygens. Están constituidos por
dos lentes plano convexos, con la superficie convexa Rayos luminosos provenientes del objetivo
dirigida hacia abajo. Entre ambos se sitúa un diafragma
anular, localizado en el plano focal de las lentes. En este Figura microsc. 9. Prisma con superficie reflectante que sirve para
desviar los rayos luminosos.
diafragma se puede adherir un puntero o señalador que suele
ser elaborado por una pequeña porción de una pestaña o En los microscopios binoculares, los prismas separan los
pelo. rayos luminosos provenientes del objetivo, en dos haces de
luz y los dirigen a cada ocular. En ambos casos existe
siempre una superficie reflectante para evitar la
descomposición de la luz.

C) COMPONENTES DE ILUMINACIÓN: Se
consideran dentro de este grupo a los instrumentos que
proporcionan energía luminosa al microscopio. Las fuentes
0) de energía luminosa son de dos tipos natural y artificial.
Figura microsc. 8. Diagrama de la disposición de las lentes en: (a) un La luz natural, emitida por el sol, se obtiene de manera
ocular negativo; (b) en un ocular positivo.
indirecta mediante un espejo que posee una superficie plana
Oculares positivos o de Ramsden. Las lentes plano y otra cóncava. El espejo está situado en la superficie
convexas están dispuestas con las superficies curvas superior de la base o pie. Un mecanismo especial permite
dirigidas hacia adentro. El diafragma está situado por debajo orientarlo hacia un lugar iluminado indirectamente por el sol
de la lente de campo o frontal; en el plano donde se forma la (una ventana, por ejemplo) y luego dirigir el haz luminoso
imagen formada por el objetivo. hacia la lente del condensador.

Además de estos oculares, existen otros tipos como los de La luz artificial se genera a través de una lámpara de bajo
campo de visión amplia; aquellos acondicionados para voltaje (generalmente de 6 voltios) que, mediante un
poder observar con los anteojos puestos y otros oculares reostato regula la emisión y la intensidad de luz. Al igual
que generalmente que se usan en los microscopios que el espejo, este sistema de iluminación se inserta en la
binoculares, denominados oculares de compensación. Éstos base o pie del microscopio.
En los microscopios que poseen un espejo, por carecer de El ocular solamente aumenta la imagen proporcionada por
una fuente de luz incorporada, también se puede emplear la el objetivo sin añadirle a ésta alguna capacidad de resolver
luz artificial emitida por una lámpara que proyecta el haz mejor los detalles.
luminoso de la misma manera como se orienta la superficie
reflectante del espejo cuando se ilumina el microscopio con Se define como aumento útil de un microscopio cuando al
luz natural. ampliar la imagen del objeto (a través de un juego de
objetivo + ocular) se distinguen una serie de detalles, es
FILTROS. En diversas partes del recorrido de haz decir se resuelven mejor las estructuras que lo integran (fig.
luminoso, aunque en la mayoría de los casos se sitúan entre micros. 10).
la fuente luminosa y el condensador. Tienen por finalidad
modificar la longitud de onda de la luz que ilumina el objeto
a observar.
Por ejemplo, cuando se utiliza Son estructuras transparentes
(de vidrio, plástico o gelatina) coloreadas que se localizan
luz artificial es necesario emplear filtros azules pues
modifican el color ligeramente amarillento que poseen los
rayos luminosos que emite las lámparas eléctricas,
a b c d e
transformándolos en rayos de luz “blanca”. Este color de luz Figura microsc. 10. Imágenes que muestran el poder de resolución de
es más aceptada por la retina y en las preparaciones los sistemas objetivo + ocular adecuados (aumento útil).
histológicas coloreadas mejora facilita la rendición de color a) objeto; b) objetivo 4x; c) objetivo 10x, d) objetivo 40x y e) objetivo
de las estructuras celulares o tisulares examinadas. 100x. Se ha utilizado un ocular de 10x.

Se denomina aumento vacío de la imagen de un objeto,

Para ciertos casos de microscopía fotónica especial se
aquel que por más ampliación que se haga de la imagen,
requiere el auxilio de filtros especiales como en el caso de
utilizando oculares de mayores aumentos, se llega a un
los microscopios de fluorescencia, contraste de fases y de
punto en que ya no se logran distinguir más detalles (fig.
polarización.
microsc.11).
Dependiendo del fabricante y de los modelos de
microscopios, los filtros se colocan en anillos o dispositivos
especiales denominados “portafiltros” que, en el caso de los
microscopios fotónicos de campo claro (de uso más
frecuente), están situados inmediatamente encima de la
fuente luminosa o debajo de la lente frontal del
condensador. (a) 0) © @
Figura microsc. 1. Imágenes que muestran un ejemplo de aumento
Aumento total del microscopio fotónico compuesto. El vacio. Juego de dos objetivos 4x y 10x y de dos oculares: de 10,x y 20x.
a) objeto; b) imagen con objetivo de 4x + ocular de 10x; ) imagen con
aumento total de la imagen del microscopio compuesto se objetivo de 10x + ocular de 10x y d) imagen de objetivo de 10x +
obtiene multiplicando el aumento propio del objetivo por el ocular de 20x.
aumento propio del ocular:
Para obtener el aumento útil de una imagen existe un
procedimiento que nos indica el juego de objetivos con los
AT= aumento del objetivo x aumento del ocular correspondientes oculares que se debe utilizar en la
ampliación de la imagen.

Aumento útil y aumento vacío del microscopio. La Una manera sencilla de calcular el aumento útil de un juego
imagen que forma el microscopio fotónico compuesto posee de objetivo + ocular es multiplicando la AN del objetivo
características que permiten ver menor o mayor cantidad de por 1000. La cifra obtenida es el aumento total que debe
detalles de la misma. tener la imagen cuando se multiplica el aumento del
objetivo por el aumento del ocular, por ejemplo si se tiene
Se observarán más detalles cuanto mejor sea el poder de un objetivo de 100x que posee una AN=1.25 el aumento
resolución del objetivo empleado. Ya se ha mencionado que máximo que debe presentar la imagen para ofrecemnos la
la resolución de la imagen del objeto depende esencialmente mayor cantidad de detalles es aquel que resultaría de
de la apertura numérica del objetivo y del tipo de luz que se multiplicar 1.25 x 1000 = 1250 aumentos, por lo tanto si el
utilice. objetivo es de 100 ampliaciones debemos usar un ocular de
por lo menos 12x, si usamos un ocular de 15x la ampliación
de la imagen nos estaría dando un aumento vacio.
 Al contrario, si empleamos un ocular de 5x = 500x, constituyen igual numero de puntos luminosos formarán la
estaríamos frente a un caso de subutilización del poder de imagen. Con la diferencia que la imagen será ampliada N
resolución del objetivo pues no se lograría el aumento número de veces correspondiente al aumento propio que
necesario para lograr observar los detalles de la imagen que posea el objetivo.
el objetivo empleado ha logrado resolver.
Los límites que existen para que un objetivo pueda ofrecer 2£
al observador un adecuado poder de resolución oscilarían
entre las cifras que señalan un máximo poder de resolución
equivalente a multiplicar la AN del objetivo utilizado por
1000, y un mínimo poder de resolución útil equivalente a
multiplicar la AN del objetivo por 500
Figura microsc. 12. Características de la imagen formada por &
PODER DE PENETRACIÓN O DE PROFUNDIDAD objetivo.
DE CAMPO. La imagen que se forma a través del
microscopio proviene de un objeto sumamente delgado Esta imagen es de mayor tamaño, real e invertida (ver
figura microsc. 12)
(5um a 10pm de grosor), que genera varios planos de
Los otros rayos luminosos que llegan a la lente frontal del
imágenes: profundos, intermedios y superficiales.
objetivo y que no iluminan ningún punto del objeto, al
Cuando se examina un tejido con objetivos de bajos
atravesar la lente, le confieren al campo microscópico una
aumentos 4x 6 10x la imagen que se observa puede
iluminación uniforme. A este tipo de iluminación se
enfocarse con facilidad con el tornillo macrométrico, sin que
denomina de campo claro.
se diferencien los planos de enfoque antes mencionados,
La imagen generada por el objetivo es captada
pero cuando la imagen se forma al emplear objetivos de 40x
posteriormente por la lente de campo del ocular y la amplía
y 100x, es necesario utilizar el enfoque fino a través del
el numero de veces del aumento que aquel posee.
tornillo micrométrico, pues es mucho más evidente que si
La imagen formada por el ocular será de mayor tamaño,
enfocamos el plano superficial, es probable que al ascender
derecha con relación a la imagen formada por el
levemente la platina por acción del micrométrico logremos
objetivo y virtual (fig. microsc. 13).
enfocar y visualizar con nitidez el plano focal medio o el
profundo.
E TECECOS

Por lo tanto, el poder de penetración o de profundidad de los

objetivos es inversamente proporcional al aumento propio
de los mismos.

Distancia libre de trabajo. Se denomina así a la distancia

que existe entre la superficie de la laminilla cubreobjetos y
la lente frontal del objetivo. Esta distancia será mayor
Figura microsc. 13. Caracteristicas de la imagen formada por el
cuanto menor sea el aumento propio del objetivo y ocular.
viceversa.
La imagen total formada por ambas lentes será: aumentada
FORMACIÓN DE LA IMAGEN A TRAVÉS DEL de tamaño, invertida y virtual con relación al objeto. Tal
MICROSCOPIO FOTÓNICO. La imagen total del como se esquematiza en la figura Microsc 14.
microscopio fotónico se forma mediante las imágenes que lente lente
generan sucesivamente el objetivo y el ocular. obj I¡vn ocular
Para que se forme una imagen del objeto observado es
indispensable que por lo menos dos rayos luminosos que
inciden en el objeto iluminen una porción del mismo.

Tal como se observó en los casos de formación de

imágenes, un punto iluminado del objeto trasmite dos rayos
luminosos: uno, orientado paralelamente al eje principal, se
refracta al atravesar la lente del objetivo, en tanto que el otro
se traslada en dirección oblicua hacia el centro óptico de la
lente y la atraviesa sin refractarse.
En el lugar donde los dos rayos luminosos se interceptan se
formará la imagen del punto iluminado. Si del objeto se
trasmiten dos rayos luminosos por cada punto que lo Figura microsc. 14. Características de la imagen total formada por el
sistema óptico del microscopio.
TIPOS DE MICROSCOPIOS FOTÓNICOS. El principio óptico de este microscopio es el de aprovechar
Las características descritas, de los componentes del un conjunto de rayos luminosos oblicuos que inicialmente
microscopio fotónico, así como la formación de las no entran a la lente frontal del objetivo, observándose el
imágenes de los objetos observados corresponden al campo microscopio totalmente oscuro.. Para que esto ocurra
microscopio fotónico de mayor uso en los ámbitos se requiere en primer lugar que la apertura numérica del
académicos docentes y de investigación el denominado: condensador sea mayor que la apertura numérica del
objetivo. Esta condición facilita que los rayos luminosos
Microscopio de transparencia o de campo claro. Este directos provenientes de la fuente luminosa sean impedidos
microscopio se caracteriza porque emplea luz natural o luz de entrar a la porción central de la lente del condensador y
artificial como energía luminosa para formar las imágenes solo penetren y emerjan de él, los rayos periféricos que al
del objeto que se observa. La imagen muestra puntos o áreas refractarse se hacen oblicuos.
iluminadas (generalmente coloreados) sobre un fondo claro
o transparente.

Figura microsc. 15. Las fotomicrogr añías muestran imágenes

i de células
descamadas del epitelio bucal a) imagen obtenida de células sin teñir,
b) imagen obtenida con células teñidas con azul de toluidina, 400x.
Para que la imagen sea visible con nitidez es necesario que Condensador
el objeto examinado este coloreado o teñido, es decir que los
componentes celulares y tisulares de la estructura se Figura microse. 16. Diagrama que representa el recorrido de los rayos
contrasten mediante colorantes específicos que absorban y Juminosos, en el sistema óptico del condensador y la desviación de los
transmitan determinadas longitudes de onda del espectro rayos luminosos oblicuos, en el microscopio de campo oscuro.
visible. Las longitudes de onda que no se absorban son
Cuando estos rayos oblicuos encuentran en su recorrido,
transmitidas al ojo humano o a un material fotográfico
sensible dando como resultado que la estructura teñida alguna partícula, son desviados hacia la lente frontal del
aparece de un determinado color. objetivo y la imagen de la partícula se observa brillante en
medio de un fondo oscuro.
El campo microscópico aparece claro o transparente porque
los rayos luminosos directos que provienen del condensador
10 encuentran en su camino ninguna estructura coloreada y
entran como rayos de luz blanca hacia el objetivo. Si se
examinan objetos sin colorear la imagen ofrecerá detalles
poco contrastados, casi transparentes.

Las secciones de tejidos deben ser delgadas con un grosor

de 5 pm a 10 um. Se puede emplear secciones de mayor
espesor pero la imagen no mostrará un buen poder de Figura microse. 17. Imagen células, fotografiadas mediante el
resolución y tampoco exhibirá contornos nítidos, pues en el microscopio de campo oscuro.
campo microscópico se observarán varios planos
Existen diversos tipos de condensadores diseñados y
superpuestos de las imágenes. fabricados especialmente para la microscopía de campo
oscuro.
Microscopio de campo oscuro. Se denomina así por que Una manera sencilla de fabricar un diafragma que produzca
La imagen que se forma está constituida por una serie de campo oscuro en un microscopio de estudiante es elaborar
estructuras brillantes sobre un fondo oscuro. con una cartulina negra un diafragma que se coloca debajo
del condensador del microscopio (ver fig. microsc.18).
 Cuando se trató en el tema de óptica, los índices de
refracción, se afirmó que un rayo luminoso retrasaba su
velocidad cuando atravesaba una sustancia transparente que
poseía un índice de refracción mayor que el aíre (IR= 1.00).
Los componentes celulares y tisulares de muestras sin teñir
no son fácilmente observables por el ojo humano porque
sus indices de refracción que posee cada uno de ellos, son
de escasa diferencia entre sí. Los rayos luminosos que los
atraviesan suelen retardar su recorrido en un % 6 % longitud
de onda, dependiendo de sus correspondientes índices de
refracción, respecto a los rayos luminosos directos que en
su recorrido no encuentran estructura alguna, por lo tanto el
campo oscuro en un microscopio fotónico. microscopio de contraste de fases utiliza la propiedad que
tienen dos ondas luminosas desfasadas de interferir entre
El microscopio de campo oscuro se emplea para ver células
ellas para generar imágenes contrastadas por la mayor o
vivas (protozoarios, bacterias, células descamadas, etc.) en
menor intensidad luminosa que exhiban sus componentes.
las cuales no se han aplicado sustancias fijadoras ni
colorantes. También se observan partículas de un tamaño
inferior a los 0.2 de micrómetro; esto se debe a que los rayos
de luz oblicuos que inciden en ellas forman un halo
luminoso brillante alrededor de las mismas. Mediante el
empleo de este microscopio se distinguen con facilidad la
forma y el movimiento helicoidal que muestra la
espiroqueta Treponema pallidum, una bacteria causante de
la sífilis.

MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASES. Es el

microscopio fotónico más utilizado para observar objetos o Result of
estructuras transparentes sin teñir. Al igual que el Interference
microscopio de campo oscuro facilita la observación de
células vivas para distinguir y analizar sus componentes @ (b) (©)
morfológicos y ciertas funciones que ellas puedan
desarrollar (fagocitosis, mitosis, movimientos ameboideos, Figura microsc.20. Recorrido de dos ondas luminosas para mostrar el
ciliares o flagelares, etc.). efecto de interferencia en: a) cuando las ondas de luz se encuentran en
fase; b) cuando las ondas están desfasadas en % longitud de onda y c)
en un % de longitud de onda.
El principio óptico de este microscopio consiste en la
capacidad que tiene para transformar, en los objetos De acuerdo a la construcción especial de ciertos aditamentos
transparentes, los pequeños índices de refracción que cada (anillo de fases y placa de fases) que posee el microscopio
uno de sus componentes posee en diferencias de intensidad de contraste de fases, es factible que el sistema separe los
luminosa, ofreciendo imágenes donde las estructuras del dos rayos luminosos que inciden y emergen del objeto (el
objeto aparecen contrastadas en tonos oscuros o tonos directo y el refractado) para que, de manera artificial, el
brillantes y tonos intermedios. rayo refractado retrase su recorrido mas o menos a la mitad
de longitud de onda y cuando estos rayos de luz se
interfieran puedan anularse ofreciendo una porción oscura
de la imagen es decir disminución de la intensidad
luminosa en un fondo iluminado formado por los rayos
luminosos directos (fig. microsc. 19 21).

El microscopio de contraste de fases requiere de un

condensador especial que contiene en su interior el
diafragma con el anillo de fases adecuado para cada tipo de
objetivos y éstos que alberguen placas de fases localizadas
en el plano focal de los mismos.

microscopio de contraste de fases.

10
 atraviesen (Las zonas iluminadas pueden tener índices de
refracción homogéneas, una zona homogénea y otra con un
IR diferente o bordes de estructuras con diferentes IR, etc.).
_H : [N En cualquiera de los casos, la onda luminosa que atraviesa
el objeto se retrasará con relación a la otra onda que no lo
atraviesa, la cual servira como referencia.

Rayo difectó rayo|refractado

Filtro analizador

N N N
Prisma de Wollaston #3-

Objep— 4

Condensador

Prisma de Wollastor'%1

Figura microsc. 21. Diagrama que muestra la trayectoria de los rayos Filtro polarizador
luminosos a través de los componentes ópticos del microscopio de
contraste de fases. CAA DD
nda luminosa
MICROSCOPIO DE CONTRASTE
INTERFERENCIAL DIFERENCIAL (CID) O DE Figura microsc. 22. Diagrama que esenta los componentes ópticos
NOMARSKI. del microscopio CIDy el rec rido de los rayos luminosos.
Este tipo de microscopio fue diseñado y construido
basándose en los principios ópticos semejantes al Considerando que el retraso está en relación directa con el
microscopio de contraste de fases, porque la imagen se grosor del objeto y con su índice refracción, el valor del
genera utilizando las diferencias de fase de los rayos retraso se puede emplear para determinar la masa por unidad
luminosos que atraviesan el objeto observado. de superficie del material observado, células por ejemplo y,
por lo tanto la masa de sus componentes.
La diferencia con el microscopio de contraste de fases
radica en que el sistema óptico, mediante un filtro especial Las ondas luminosas que emergen del objeto entran al
(de luz polarizada) hace vibrar las ondas de luz en un solo prisma de Wollaston # 2 (cuya estructura cristalográfica
plano, más o menos en un ángulo de 45°; estas ondas de luz tiene una posición invertida con respecto al prisma # 1) y
polarizada se dirigen a un prisma especial (de Wollaston 4 colocado ligeramente descentrado del eje óptico del
1) donde en la primera parte del prisma, se dividen en dos microscopio. Las dos ondas que estaban desfasadas
ondas luminosas que vibran ahora en dos planos diferentes empiezan a ponerse en fase en la primera mitad del prisma,
pero luego en la segunda parte vuelven a desfasarse un % de
de 90° entre ellas, pero ligeramente desfasadas, emergen,
longitud de onda y así salen del prisma, pero no pueden
después de atravesar la segunda parte del prisma, como dos
interferirse porque vibran en planos distintos. Se dirigen al
ondas luminosas separadas pero ahora en fase y se dirigen al
analizador, otro filtro de polarización con su estructura
objeto para que iluminen puntos muy cercanos y los
cristalográfica perpendicular al primer filtro de polarización,

11
encargado de hacer rotar el plano de las dos ondas un fondo oscuro; en cambio su respuesta a la iluminación
luminosas, los hace coincidir y se produce la interferencia. será muy débil o nula cuando las ondas luminosas incidan
De esta manera se observa una ligera diferencia de desde una dirección diferente y éstas no puedan ser
intensidad entre la zona que fue atravesada del objeto y la modificadas en su plano de vibración.
porción homogénea o de menor índice de refracción que se
muestra con una mayor intensidad luminosa. La birrefringencia de una estructura depende de la
disposición asimétrica regular de sus moléculas o iones, por
Si la primera zona es un borde, por ejemplo, de una célula ejemplo cristales de fosfatos y carbonatos de calcio
o de una estructura intracelular y la segunda zona es (cristales de hidroxiapatita) del tejido óseo o ciertas
homogénea o de menor índice de refracción se observará un inclusiones celulares como los granos de almidón
borde muy brillante o luminoso rodeado de una zona menos (birrefringencia cristalina o intrínseca) o una disposición
iluminada, dando el aspecto de una imagen tridimensional. regular de unidades submicroscopicas asimétricas como los
miofilamentos de miosina de las fibras musculares estriadas,
los microtúbulos del huso acromático (birrefringencia de
Jorma).

Se denominan estructuras — monorrefringentes 0

anisotrópicas aquellas cuyo arreglo molecular les confiere
un mismo índice de refracción. Esta disposición espacial
impide que las ondas luminosas polarizadas puedan ser
giradas.
Imagen: — brillante — oscura
Figura microsc. 23. Imágenes obtenidas mediante el microscopio de
contraste interferencial diferencial o de Nomarsky. a) eritrocitos
normales y crenados. B) células descamadas del epitelio bucal. Filtro analizador Q\\
El borde brillante se forma en un lado del objeto, en el otro
lado ocurre un proceso inverso, el borde se oscurece y el
< S SN
ámbito que lo rodea muestra cierta brillantez. La imagen
que se forma da la sensación visual de bajorrelieve o de un
onda de luz no girada
“aspecto tridimensional” ( fig. microsc. 23).

MICROSCOPIO DE LUZ POLARIZADA.

Una serie de componentes biológicos, vegetales y animales,
celulares o tisulares están constituidos por moléculas que
por su organización cristalina, paracristalina o fibrilar en su
estructuración bioquímica, adoptan determinada orientación
en el espacio.
luz
Estas estructuras orientadas en el espacio con un arreglo
molecular especial, interactuan con las ondas luminosas que
incidan en ellas de formas muy variadas, dependiendo de
cómo ese objeto esta orientado. Así, los índices de
refracción del objeto serán diferentes dependiendo de los
DAO

ejes de rotación del objeto. Un objeto con ejes que poseen ondas polarizadas
varios índices de refracción se denomina birrefringente. Por
RD

la disposición espacial de los átomos y moléculas también

le|

5g
=
5C
=5

E
1

se denominan anisotrópicas.
R NR 7
La birrefringencia resulta de la alineación de átomos o 2Z 0%RN£
¥ 2
moléculas en un determinado plano del objeto. Estos átomos ZR£
É NN7
y moléculas interaccionan intensamente con ondas
luminosas que incidan en ellos desde una determinada Ondas luminosas
Figura microsc. 24. Diagrama que muestra el recorrido de los rayos
dirección, haciendo que el plano de vibración de las ondas Juminosos en el microscopio de polarización y la birrefringencia que
luminosas pueda ser modificado o rotado hasta en un ángulo exhibe la estructura molecular del objeto.
de 45% Las estructuras birrefringentes cuando son Para analizar la anisotropía o birrefringencia de una
iluminadas con luz polarizada brillarán intensamente sobre estructura celular o tisular se utiliza el microscopio de luz
polarizada. Este microscopio se caracteriza porque posee en células animales como los hepatocitos resplandece de un
entre el recorrido de los rayos luminosos dos filtros o color blanco brillante.
prismas polarizadores. Uno de ellos (filtro polarizador)
está localizado después de la fuente luminosa y antes del Existen una serie de sustancias colorantes artificiales que
objeto, es el filtro encargado de polarizar la luz; el otro se también emiten fluorescencia cuando son excitadas. Estas
localiza posterior al objeto (filtro analizador). sustancias se denominan “fluorocromos”.

Las rejillas moleculares de cada filtro se disponen, en el Los fluorocromos se emplean para demostrar una serie de
microscopio de polarización, perpendiculares entre sí. Esto componentes celulares o tisulares pues al unirse de manera
significa que si iluminamos el microscopio y observamos el específica a algunos de ellos y ser excitados por radiación
campo microscópico, éste aparecerá totalmente oscuro, en ultravioleta o longitudes de onda menores (azul, violeta)
cambio si en la platina colocamos un objeto birrefringente resplandecen ofreciendo imágenes de colores diferentes,
(fibras musculares estriadas, células vegetales conteniendo generalmente de longitudes de ondas azules, verdes,
cloroplastos, células animales en mitosis, fibras colágenas, amarillas, naranjas o rojas. Uno de los fluorocromos más
granos de almidón, etc.) la estructura cristalina o conocidos es el naranja de acridina. Por ejemplo cuando se
paracristalina de sus moléculas harán rotar el plano de luz “colorean” células o tejidos con este fluorocromo es posible
polarizada que se trasmitió entre ellas y lo harán coincidir demostrar de manera específica ácidos nucleicos: El DNA
con el arreglo molecular de la rejilla del filtro analizador, emite radiación verde-amarillenta y el RNA fluoresce de
por lo tanto el objeto birrefringente aparecerá brillante sobre color rojo.
un fondo oscuro. Se emplea también para observar células y
organismos rgicroscópicos vivos. Existen dos tipos de fluorescencia:
a) natural o autofluorescencia se produce cuando
determinadas estructuras o sustancias animales o
vegetales, al ser excitadas con radiación ultravioleta
irradian fluorescencia. Los ejemplos citados en párrafos
anteriores (clorofila, Vitamina “D”, etc.), el pigmento
flavina, componente del semen también es
autofluorescente, corroboran lo mencionado.

b) fluorescencia artificial. Es aquella que irradian, de

manera específica, determinadas estructuras celulares o
tisulares cuando son “coloreadas” por fluorocromos” y
observadas a través del microscopio de fluorescencia.
y monorrefringentes (isotrópicas). La birrefringencia se debe ala La fluorescencia artificial se aplica mediante dos
disposición espacial que posen los filamentos de miosina. procedimientos:

MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA O DE “ Procedimiento directo que consiste en unir directamente

RADIACIÓN ULTRAVIOLETA. el fluorocromo, a ciertos componentes de las células o
Ciertas sustancias naturales o artificiales poseen la tejidos; por ejemplo, el naranja de acridina con los
propiedad que cuando son estimuladas por energia de cierta ácidos nucleicos. La auramina con los bacilos de la
longitud de onda ( por ejemplo energía radiante invisible tuberculosis (en este caso el Mycobacterium tuberculosis
como la radiación ultravioleta o radiación luminosa violeta fluoresce de color amarillo dorado). En otros casos es
o azul) absorben esta energía y emiten fotones que integran posible inyectar soluciones de fluorocromos vitales al
ondas visibles de luz, de longitudes de onda siempre interior de las células para observar el transporte de
mayores que las ondas con las que fueron excitadas. Este sustancias de una célula a otra.
fenómeno se denomina fluorescencia. La luz emitida se
observa en forma de destellos coloreados sobre un fondo “ Procedimiento indirecto. Para que se produzca
oscuro (fig. microsc.26). fluorescencia es indispensable que el fluorocromo se
ligue a una determinada sustancia proteínica, mediante
La condición esencial para que se produzca fluorescencia es enlaces covalentes (conjugados), la cual mediante la
que la longitud de onda de la energía radiante excitatoria sea reacción inmunológica antígeno (componente que se
menor que la longitud de onda emitida. desea identificar) - anticuerpo (sustancia ligada con el
fluorocromo), se unirán de manera específica. Por
La propiedad de generar fluorescencia es propia de ciertas ejemplo se ligan fluorocromos con anticuerpos anti-
estructuras celulares animales o vegetales. Por ejemplo la tubulina y el conjugado se vierte en un cultivo de tejidos.
clorofila cuando es excitada por radiación ultravioleta emite Gracias a este procedimiento se puede observar el huso
radiación visible de color rojo. La vitamina “D” contenida acromático (constituido por microtúbulos) de las células

13
 en proceso de mitosis. Así mismo se conjugan
fluorocromos a anticuerpos anti- actina o anti-miosina Existen dos tipos de microscopio de fluorescencia: aquel en
para demostrar el citoesqueleto de células como el cual las radiaciones excitatorias atraviesan la muestra a
macrófagos o fibroblastos u observar la disposición de observar, se le denomina microscopio de fluorescencia de
los miofilamentos de actina y miosina en las fibras fansmisión o de transparencia. Este tipo de microscopio
musculares. casi está en desuso. Y el denominado microscopio de
epifluorescencia donde la radiación excitatoria es aplicada
La microscopía de fluorescencia ha permitido avanzar de sobre la muestra a través de un sistema incorporado al
manera sorprendente en la investigación de procesos objetivo. La radiación no atraviesa el espécimen.
fisiológicos celulares que mediante otros procedimientos no Los aditamentos son:
hubiera sido posible realizar. La fluorescencia permite
demostrar, por la radiación luminosa que emiten, partículas “ Fuente luminosa de gran potencia que preferentemente
sumamente pequeñas que con otros tipos de microscopios emita radiaciones UV, violeta, azul y verde.
fotónicos no son fáciles de visualizar. En este tipo de
procedimiento es indispensable obtener el registro « — Filtros selectores o excitadores encargados de filtrar y
fotográfico de las imágenes obtenidas. seleccionar las ondas radiantes de aquellas que no se
Imagen fhuorescente desean emplear.
Plano de la imagen
“ Filtro protector o de barrera. Es un filtro de color
amarillo; está localizado entre el objetivo y el tubo
óptico. Es indispensable utilizarlo para bloquear algún
tipo de radiación ultravioleta que pueda haberse
trasmitido o reflejado y que no ejerció en la muestra
actividad excitatoria (la radiación UV posee una alta
energía que puede irritar e inflamar los tejidos del globo
ocular).
filtro protector

\ >
« Objetivos de fluorita. Los objetivos cuyas lentes están
construidos por silicatos (vidrios de flint o de crow)
poseen autofluorescencia, por lo que es necesario
objetivo > reemplazarlos por objetivos de fluorita. En el caso del
microscopio de epifluorescencia, los objetivos están
rayos verdes
espécimen Z diseñados y construidos para que ellos también
funcionen como lentes condensadores proyectando la
energía radiante uniformemente sobre la muestra.

“ Espejo divisor de haces. Es un aditamento propio de

este tipo de microscopio. Está situado en posición
oblicua por encima del objetivo. Sus características
fisicas solamente le permiten reflejar, hacia el
Rayos filtrados rayo filtrado espécimen la longitud de onda filtrada y seleccionada.
(azules) ultravioleta Radiaciones que no fueron bloqueadas por el filtro
excitador atraviesan el espejo divisor y continúan su
trayectoria sin ser reflejados.
Filtró selector

Figura microsc. 27. Diagrama que representa los principales

componentes del microscopio de fluorescencia por transparencia y el
recorrido de los rayos luminosos.
El microscopio de fluorescencia consta de los mismos
componentes de un microscopio fotónico al que se le añaden
varios aditamentos (fuente luminosa y filtros especiales) con Figura microsc. 26. Fotomicrografía de estructuras celulares que
la finalidad de que emita, de manera selectiva, radiaciones muestran fluorescencia.
de determinadas longitudes de onda: radiación ultravioleta u Imagen fluorescente plano de la imagen
ondas luminosas de color violeta, azul, ó verde. > Z—

14
 Esto obliga a que para obtener las imágenes fotográficas se
requiere tiempos de exposición bastante prolongados (a
pesar de existir material fotográfico con velocidades de
exposición sumamente rápidas) lo que ocasiona que se
presenten los inconvenientes mencionados anteriormente.

Ante estos inconvenientes se ha logrado diseñar y construir

un microscopio denominado microscopio — fotónico
tridimensional de rastreo confocal, a través del cual se
filtro protector _-| obtienen imágenes, — preferentemente fluorescentes,
sumamente nítidas, con una gran capacidad de resolución y
filtro selector espejo divisor sin que se produzca la fotooxidación del fluorocromo El

N
de haces mecanismo de acción de este microscopio se basa en la
iluminación de la muestra con un delgado rayo laser
concentrado en un foco que recorre con rapidez, punto por
punto, todos los componentes del espécimen, a una
profundidad microscópica constante, de tal manera que se
ilumina un plano muy delgado (plano “ óptico),
aproximadamente calculado entre 0.5 a 0.8 de micrómetro.

objetivo—>Cy
condensador

espécimen Figura microsc. 29. Imagen de una fase de la mitosis obtenida

mediante microscopio tridimensional confocal.

La imagen así obtenida se recoge en un monitor y se guarda

Figura microsc. 28. Diagrama que representa los principales en la memoria de un procesador, el cual junta las imágenes
componentes del microscopio de epifluorescencia y el recorrido de los de otros planos, inferiores o superiores hasta integrarla en
rayos luminosos.
una sola imagen de contornos sumamente nítidos y con una
gran exhibición de detalles que, en otras condiciones, no
MICROSCOPIO TRIDIMENSIONAL DE RASTREO
serían posibles de observar. Mediante el sistema
CONFOCAL.
Las imágenes obtenidas con los microscopios de computarizado la imagen compuesta se puede observar en
fluorescencia, de transmisión y de epifluorescencia, tienen tres dimensiones e inclusive puede rotarse para ser
el inconveniente que no siempre muestran una resolución y visualizada desde diferentes ángulos.
una nitidez deseada, ya sea porque los especímenes
examinados son demasiado gruesos (los componentes que MICROSCOPIO ELECTRÓNICO.
fluorescen muestran varios planos focales, los que al El microscopio fotónico tiene una capacidad máxima de
superponerse exhiben una imagen desenfocada) o porque mostrar detalles de la imagen de un objeto (poder de
durante proceso de preparación de la muestra y su resolución), cuando entre ellos existe una distancia
observación posterior el fluorocromo tiende a ser aproximada de 0.2 de micrómetro. Este tipo de microscopio
fotooxidado por la energía radiante que lo excita y su es incapaz de ofrecer un poder de resolución mayor porque
capacidad de generar luminiscencia se pierde con rapidez; existen dos factores limitantes: la longitud de onda (1) de la
en otros casos suele difundirse lentamente y el contorno del energía luminosa utilizada y la apertura numérica (A.N.) de
espécimen aparece levemente difuso. Si la muestra exhibe la lente del objetivo.
zonas sumamente pequeñas que reaccionan al fluorocromo, La única manera de aumentar el poder de resolución de un
el resplandor o el brillo de la imagen suele ser muy débil microscopio era encontrar energía radiante con longitudes
sobre un fondo del campo microscópico totalmente oscuro. de onda menores a las que posee el espectro radiante visible.

15
En 1930, el fisico De Broglie, basándose en estudios MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE
teóricos predijo que los electrones, emitidos bajo ciertas TRANSMISIÓN.
circunstancias, como en el vacío, por ejemplo, podían Fue diseñado y construido basándose en los mismos
desplazarse y comportarse como ondas de energía. principios de un microscopio fotónico; con la diferencia que
Comprobada esta teoría, entre 1932 y 1934, Knoll y Ruska, en vez de usar energía luminosa emplea haces de electrones
junto con otros científicos desarrollaron un microscopio y reemplaza las lentes ópticas (de vidrio) por “lentes”
electrónico, en el que mediante la aplicación de energía construidas mediante campos electromagnéticos.
eléctrica de alto voltaje a un electrodo metálico, se emitían
haces de electrones con longitudes de onda que en un En la figura microsc. 31 se representan los principales
principio no lograron sobrepasar el poder de resolución del componentes del M.E. de transmisión, los cuales son:
microscopio fotónico pero que, en el año de 1938, después
de una serie de innovaciones como el fabricar y adicionarle “ Un cátodo, constituido por un filamento de alambre de
un condensador que orientaba, concentraba y aceleraba la tungsteno que se calienta e irradia un chorro de
marcha del haz de electrones emitidos, les permitió alcanzar electrones cuya velocidad y longitud de onda están
imágenes con un poder de resolución cercano a los 10 relacionadas con el voltaje de la energía eléctrica que se
nanómetros (100A). le aplica.
“ Un únodo, encargado de orientar los haces de
La longitud de onda de los electrones emitidos por el electrones, reagruparlos y acelerar su recorrido.
electrodo metalico (catodo), depende del voltaje aplicado, es « “Lente” condensadora (primer campo
decir, a mayor voltaje utilizado menor será la longitud de electromagnético). Los haces de — electrones
onda del haz de electrones. La relación de A con el poder de provenientes del ánodo son concentrados por este
resolución del microscopio electrónico es: primer campo electromagnético y dirigidos hacia el
“ Soporte de la muestra, en este lugar, dependiendo de
« Con 10 kilovoltios (kV) de aceleración, se produce una la densidad que posean los componentes del espécimen
longitud de onda (1) de 0.001nm que genera, a su vez, los haces de electrones los atraviesan, son absorbidos,
una resolución de 10 nm. reflejados o son desviados en su recorrido. Las
« Con 100 kV, la A es igual a 0.0004 nm y el poder de muestras deben ser secciones sumamente delgadas para
resolución es de 4 nm. permitir el paso de los electrones. Generalmente se
« Con 1000 kV, la A es igual a 0.0001 nm y el poder de utilizan secciones de tejidos del orden de 20 a 100
resolución es de 1 nm. nanómetros. El escaso grosor del espécimen dificulta la
formación de la imagen por lo que es necesario “teñir”
Los haces de electrones emitidos por el cátodo se desplazan o contrastar las secciones con soluciones de sales de
en todas las direcciones del espacio, por lo tanto es metales pesados (plomo, uranio, plata o vanadio), los
necesario reorientarlos y acelerar su desplazamiento. Esto se cuales tienen cierta afinidad por determinados
consigue con un ánodo colocado en las cercanías de la componentes celulares.
emisión que genera un alto potencial eléctrico positivo. “ “Lente” objetivo (segundo campo electromagnético).
Los electrones que atraviesan la muestra o los
Existen dos tipos de microscopios electrónicos: el ME de desviados por los componentes de la misma, llegan a
transmis x el ME de barrido (scanning). esta zona donde son enfocados para formar una imagen
ampliada. Esta imagen es recogida por la Pantalla
fluorescente o placa fotografica
“% “Lente ocular” o de proyección (tercer campo
electromagnético) que vuelve a enfocar la imagen y la
proyecta, ampliada también numerosas veces, hacia
la pantalla fluorescente. Ésta es una superficie plana
constituida por un soporte de colodión donde se
distribuyen partículas muy finas de sales de zinc o de
fosforo verde, las cuales emiten energía luminosa
(ondas de mayor longitud, visibles al ojo humano)
cuando son estimuladas por el choque de los electrones.
Para obtener un registro permanente de la imagen
observada se reemplaza la pantalla fluorescente con una
placa fotográfica, cuyos componentes son estimulados
por los electrones de la misma manera que actúan los
Figura micr fotones.
transmisión.

16
 < — cátodo

haz de electrones

|
| <
l Lente
condensador

— muestra
// Figura microsc. 32. Fotomicrografía obtenida con el microscopio
¡"<x lente electrónico de transmisión.
/ '\.\@K objetivo
\ El M.E. de transmisión se emplea para obtener imágenes
NN con un gran poder de resolución que alcanza desde 0.5a 1.0
NN nanómetro.
2¡/ imagen ampliada
MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE BARRIDO
(SCANNING).
Este tipo de microscopio electrónico funciona con los
mismos principios electrónicos del M.E de transmisión: una
fuente generadora de electrones, campos electromagnéticos
Lente (ocular) proyectora que actúan como “lentes” concentradoras (3) de los haces de
electrones o como ampliadoras de imágenes. La diferencia
estriba en que los electrones no atraviesan el espécimen para
formar las imágenes.

Los electrones se aceleran y concentran hasta formar un haz

sumamente delgado de mas o menos 5 nm de diámetro que
Figura microsc. 31. Diagrama que representa los componentes rastrea o “barre” la superficie de la muestra. Los electrones
principales de un microscopio electrónico y el recorrido del haz de son reflejados por los componentes de la misma o al chocar
electrones. con ellos generan electrones secundarios.

Todos los componentes del microscopio electrónico están En ambos casos los electrones se envían e inciden en la
contenidos dentro de una columna metálica conectada a un superficie de un detector localizado en las cercanías de la
sistema de hacer vacío. Es imprescindible que exista el muestra. Este aditamento está conectado a un amplificador
vacío dentro de la columna pues los electrones son que envía señales en forma de rayos catódicos a la pantalla
desviados fácilmente si existen en el medio partículas o de un monitor de televisión (ver fig. microsc. 32). Para
moléculas suspendidas. registrar la imagen formada se utiliza una cámara
fotográfica.
Los electrones que atraviesan o son desviados por
estructuras del espécimen que poseen escasa o nula El M.E de barrido, ofrece imágenes con una resolución que
densidad llegan a la pantalla fluorescente y estimulan sus alcanzan de 10 a 20 nm. El aumento efectivo es de 15,000 a
partículas. 50,000 diámetros. Otra ventaja de este microscopio es que
forma imágenes con una gran profundidad de foco; de
Aquellos electrones que inciden en estructuras de mayor aproximadamente 500 veces que la del microscopio
densidad, son reflejados o absorbidos, no las atraviesan y fotónico. Esta propiedad le confiere a la imagen su aspecto
dejan zonas de la pantalla sin estimular, por lo tanto en esos tridimensional (fig. microsc. 34)
lugares no se emite luminosidad. De esa manera se forma la
imagen con zonas iluminadas o claras denominadas
electronlúcidas, y otras oscuras o electrondensas (fig.
microsc. 32).

17
 células por efecto de la tensión superficial en la interfase
< Catodo aire-agua. Para que esto no ocurra las muestras se preparan a
través de la técnica del secado hasta el punto crítico en el
que se sustituye el solvente de deshidratación por un gas en
su estado líquido (CO>) que, aplicándole una determinada
1 presión y a una temperatura específica, pasa a la fase
haz de electrones| gaseosa sin pasar por el estado sólido; esto evita que el
material se colapse y mantenga su superficie intacta; con

< | <
Lentes
Condensadoras
todos los relieves que tuvo al estado natural.

A continuación se cubre la superficie con una capa

< |
conductora (60 a 100 nm) de carbón finamente pulverizado
y posteriormente con una película de metal pesado (plata,
oro, platino o paladio) del mismo grosor. Ambos elementos
se depositan mediante un sistema de evaporación al vacío.

< |
Detector
De esta manera la superficie de la muestra está preparada
para recibir los electrones, reflejarlos o emitir electrones
secundarios.

muestra

Pantalla de TV
Figura microsc. 34. Imagen que forma el microscopio de “scanning” o
de barrido.
Imagen del objeto

Figura microsc. 33. Esquema que representa los principales

componentes del microscopio electrónico de barrido y la trayectoria
del haz de electrones.
Otra diferencia radica en la preparación del espécimen que
debe ser examinado; este microscopio sirve para observar
su superficie constituida por una serie de diminutos relieves,
sinuosidades, depresiones, grietas y prominencias, tal como
se exhiben en estado viviente, pero que debe estar
totalmente deshidratado pues también en este microscopio
se debe trabajar en el vacío. El agua del material biológico
no se puede sustituir por una sustancia de inclusión porque
no se requiere efectuar secciones delgadas del tejido. En
cambio, se le debe proporcionar a la superficie del
espécimen la capacidad de hacerse reflectante a los
electrones que incidan en ella.

La totalidad del material biológico a observar, posee un alto

contenido de agua, si se desea eliminarla secándola al aire se
producirían graves daños en la estructura morfológica de las

18