Módulo 6:

GeneXpert Tecnología y
Procedimientos del GeneXpert
MTB/RIF
Slides adaptados de Cepheid

Iniciativa Mundial de Laboratorio – Módulos de Capacitación de Xpert MTB/RIF

  Descripción general de la tecnología

 Preparación de muestras de esputo (directa y de

sedimento de esputo)

 Preparación de muestras extrapulmonares

 Procedimientos de la prueba del Xpert MTB/RIF

 Monitoreo del procedimiento

Global Laboratory Initiative

-2- Xpert MTB/RIF Training Package
Al final de este módulo, Ud. será capaz de:
 Describir la tecnologia básica del GeneXpert y de la prueba
Xpert MTB/RIF
 Explicar los procedimientos de la prueba Xpert MTB/RIF
 Usar el software para monitorear los resultados de la prueba
y emitir informes

Global Laboratory Initiative

-3- Xpert MTB/RIF Training Package
 Sistema cerrado basado en la transferencia de fluido
integrado, que comprende:

 Plataforma del equipo

 Cartuchos (cerrados e integrados)

 Protocolos automatizados

 Controles internos

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-4- Xpert MTB/RIF Training Package
 GeneXpert
Infinity-48

GX-XVI
Módulo
GeneXpert®
GX-I GX-II GX-IV

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-5- Xpert MTB/RIF Training Package
 Motor de pistón
Placa madre

Núcleo

Válvula de dirección del motor

Gabeta de
cartucho

Ultrasonicador

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-6- Xpert MTB/RIF Training Package
 Eje motor del émbolo

Tubo de inserción
ICORE

Ultrasonicador
Válvula de arranque
(cuña)

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-7- Xpert MTB/RIF Training Package
 Llene el cartucho con la muestra
Fin del trabajo manual
preparada e inserte en el equipo
 La muestra se combina con el Control de
Procesamiento de la Muestra (SPC)
 El filtro captura la muestra y el SPC

 Las células son lisadas ultrasónicamente

y liberan el ADN
 El ADN solubilizado se mezcla con las
esferas de reactivos liofilizados
 La amplificación y detección de
fluorescencia son simultáneos
 Los resultados están listos en menos de
2 horas

Global Laboratory Initiative

-8- Xpert MTB/RIF Training Package
 Permite realizar un ciclo
Cámaras de
térmico rápido de
procesamiento
excitación/detección
óptica
Tubo de
amplificación
Las cámaras contienen los
reactivos, cebadores, sondas, Cuerpo de
buffer y la muestra extraída válvula

Al girar, dirige los

líquidos a las diferentes
cámaras y al tubo de
PCR
Global Laboratory Initiative
-9- Xpert MTB/RIF Training Package
 Impulsor de la
jeringuilla

Tubo de PCR Cuerpo del cartucho

Cuerpo de la jeringuilla
Región de lisis ultrasónica y válvula rotatoria/filtro
Puertas del cuerpo de
la válvula
Tapa de interface uitrasónica

Base del cartucho

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-10- Xpert MTB/RIF Training Package
 Es un PCR en tiempo real (amplificación y detección al mismo tiempo)
 No ocurre interface húmeda entre el equipo y el cartucho, eliminando
la contaminación
 Sistema completo de control interno de los reactivos
◦ Sin necesidad de utilizar controles externos positivos y negativos
por separado
 Ultrasonido integrado para la rápida lisis de la célula para liberar el
ADN
 Los motores son dirigidos por el software para realizar el movimiento
de las válvulas y accionadores hidráulicos acoplados
 Cuenta con tecnología de fluído inteligente – los líquidos fluyen
directamente por microválvulas – permite el uso de cantidades
mínimas de los componentes de la reacción
 La interpretación de los resultados y análisis se los datos ocurre de
manera automática
Global Laboratory Initiative
-11- Xpert MTB/RIF Training Package
Vídeo disponible en FTP: ftp://hbdc:[email protected]
(pegar en el Explorador de Windows, no Internet Explorer)
Vídeos FTP son archivos de gran tamaño, por lo que se pueden descargar en un CD antes del entrenamiento.
Alternativamente, el vídeo se puede acceder a través de Youtube:
http://www.youtube.com/watch?v=mIsBLmjus6Q

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-12- Xpert MTB/RIF Training Package
 Esta diapositiva puede ser considerada opcional para la capacitación básica del personal de laboratorio
 Amplificación del ADN diana por DNA diana
PCR y detección simultánea
PCR
 El ADN diana se marca y se
amplifica con una sonda que tiene
una etiqueta fluorescente
 El producto acumulado se controla
y mide a través de la fluorescencia
detectada
 Las sondas utilizadas en la
tecnología Xpert se llaman
"Molecular Beacons« Fluorescencia
 Más de una diana puede ser
amplificado y detectado (multiplex)
 Cada diana se marca con diferentes Detección
colores
Global Laboratory Initiative
-13- Xpert MTB/RIF Training Package
 Esta diapositiva puede ser considerada opcional para la capacitación básica del personal de laboratorio

◦ Sonda de luz es un
pequeño segmento de
una sola hebra de ADN y
se compone de:
◦ Secuencia diana
específica
◦ Espaciador
◦ Fluoróforo reporter
◦ Supresor

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-14- Xpert MTB/RIF Training Package
 Esta diapositiva puede ser considerada opcional para la capacitación básica del personal de laboratorio

Sondas con señales

luminosas

Diana

Fluorescencia Sin Fluorescencia

 Sin diana = Sin Fluorescencia
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-15- Xpert MTB/RIF Training Package
 Esta diapositiva puede ser considerada opcional para la capacitación básica del personal de laboratorio

 Mutaciones en el gen rpoB que codifica para la subunidad

β del ARN polimerasa:
◦ Evita la unión de rifampicina a la ARN polimerasa, la
síntesis de proteínas y la muerte de bacilos

 95% de toda la resistencia que ocurre para rifampicina es a

causa de mutaciones que ocurren en el gen rpoB y el 5%
restante se debe a mutaciones fuera de este gen

 > 90% de las mutaciones en el gen rpoB estan localizadas

en la región de 81 pares de bases (codon 507 – 533)

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-16- Xpert MTB/RIF Training Package
 Esta diapositiva puede ser considerada opcional para la capacitación básica del personal de laboratorio

Región determinante de resistencia a rifampicina gene rpoB 81 pb

 5 sondas se unen al gen de tipo salvaje y no se unen a las

secuencias mutantes
 1 sonda para el control de procesamiento de la muestra -
SPC (Bacillus globigii)
 6 colorantes fluorescentes detectados simultáneamente

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-17- Xpert MTB/RIF Training Package
 Esta diapositiva puede ser considerada opcional para la capacitación básica del personal de laboratorio
 Control de Inspección de Sonda (PCC) – antes de iniciar los
ciclos térmicos se realizan varias lecturas de fluorescencia, a
diferentes temperaturas, para evaluar la respuesta de los
reactivos contenidos en el cartucho. La inspección de la sonda
verifica:
 Rehidratación de las esferas
 Relleno del tubo de PCR
 Integridad de las sondas
 Estabilidad del colorante o del represor (quencher)
 Los resultados son comparados automáticamente con los
ajustes de fábrica predefinidos en el software
 Una prueba se interrumpe si la inspección de la sonda no fue
APROBADA
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-18- Xpert MTB/RIF Training Package
 Esta diapositiva puede ser considerada opcional para la capacitación básica del personal de laboratorio

 Esporas no infecciosas

 Verifica si la lisis de las células ocurren correctamente

 Detecta inibidores de amplificación relacionadas con la

muestra: debe ser positivo en muestras negativas y puede
ser negativo o positivo en las muestras positivas

 El resultado se invalida si el SPC fue negativo en una muestra

negativa

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-19- Xpert MTB/RIF Training Package
 Esta diapositiva puede ser considerada opcional para la capacitación básica del personal de laboratorio

Global Laboratory Initiative

-20- Xpert MTB/RIF Training Package
 Procedimientos del Xpert MTB/RIF

Global Laboratory Initiative

-21- Xpert MTB/RIF Training Package
 1 2 4
Mezclar Añadir 3 Detectar
Insertar

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-22- Xpert MTB/RIF Training Package
 2 ml está
indicado por
una línea en la
pipeta
4. Transferir 2 ml al
cartucho
2. Mezclar bien y dejar en
reposo por 10 min.

3. Mezclar bien y dejar en

1. Añadir el reactivo de reposo por 5 min.
muestra a la muestra en la Iniciar la prueba
proporción de 2:1

 Añadir cuidadosamente el reactivo de muestra (tampón) a la muestra, evitar la formación de aerosoles.

 Evitar pipetear cualquier partícula sólida de la muestra al cartucho
 Evitar la formación de burbujas al pipetear la mezcla de la muestra al cartucho

Global Laboratory Initiative

-23- Xpert MTB/RIF Training Package
  Abra el frasco de esputo cuidadosamente
 Añadir directamente en el frasco 2 veces el volumen del reactivo de la
muestra en el esputo (dilución 2:1, reactivo:esputo). 1 ml de esputo es la
cantidad mínima, miestras que 3-4 ml es la cantidad requerida ideal)
 Para volumen de muestra mayor de 4 ml), será necesario tomar una porción
de reactivo de muestra en un segundo frasco, ya que cada frasco contiene
una cantidad de 8 ml de reactivo
 Tape y cierre bien el frasco y agite enérgicamente de 10 a 20 veces o utilice
un mezclador vortex durante 10 segundos como mínimo.
 Incube la muestra a temperatura ambiente por 10 minutos
 Luego agítela nuevamente de 10 a 20 veces o utilice un mezclador vortex
durante 10 segundos como mínimo
 Incube a temperatura ambiente durante 5 minutos. Transcurrido el tiempo,
la muestra debe estar líquida antes de ser procesada. Verifique que se
encuentra sin grumos visibles de esputo. Si aún la muestra persiste viscosa,
espere 5-10 minutos más antes de inocular al cartucho (solución final de 2-
4 ml).
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-24- Xpert MTB/RIF Training Package
 2. Añadir 1,5 ml del
1. Sedimento de esputo reactivo de la muestra
resuspendido en tampón (tampón) a 0,5 ml del 3. Agitar bien y
5. Transferir 2 ml al
fosfato, preparar un frotis sedimento (proporción dejar en reposo
cartucho
3:1) por 10 min.

4. Agitar bien y dejar en

reposo por 5 min.
Iniciar la prueba

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-25- Xpert MTB/RIF Training Package
 Añadir 1,5 ml de muestra reactivo a 0,5 ml del sedimento de la muestra
de esputo decontaminado/concentrado (nota: la proporción de reactivo y
muestra es de 3: 1)
 Cierre la tapa del frasco y agite enérgicamente de 10 a 20 veces o utilice
un mezclador vortex durante 10 segundos como mínimo.
 Incube a temperatura ambiente por 10 minutos
 Luego agítela nuevamente de 10 a 20 veces o utilice un mezclador
vortex durante 10 segundos como mínimo
 Incube a temperatura ambiente durante 5 minutos
 Transcurrido el tiempo de incubación, la muestra debe estar
líquida antes de ser procesada. Verifique que se encuentra sin
grumos visibles de esputo.

Global Laboratory Initiative

-26- Xpert MTB/RIF Training Package
 La OMS recomienda el uso de los siguientes muestras extrapulmonares para la
prueba del Xpert MTB/RIF
◦ Líquido cefalorraquideo (LCR)
◦ Nódulos Linfáticos u otros tejidos (las muestras deben ser procesadas en CSB)
 Las muestras de LCR son generalmente paucibacilares y pueden ser procesados de una
manera similar a la del esputo. Sin embargo, la concentración de la muestra por
centrifugación (sedimento) puede proporcionar mejores resultados en la prueba. Se
requiere un laboratorio con un gabinete de bioseguridad (CSB) para abrir los vasos de
la centrífuga y decantar el sobrenadante.
 Las muestras líquidas que pueden recibirse en el laboratorio dentro de jeringas deben
ser procesadas en CSB para realizar el Xpert MTB/RIF.
 Depositar el contenido de la jeringa en un tubo cónico de 50 mL, prevenir la
formación de aerosoles. Las medidas de bioseguridad deben ser adoptadas para
trabajar con objetos punzantes.
 Las muestras de tejidos necesitan ser homogeneizadas usando molinos de tejidos o
morteros, se pueden generar aerosoles por lo que las muestras deben ser procesadas
en CSB.
 El procedimiento puede ser consultado en el Manual de Implementación del Xpert de
la OMS. Anexo 2. www.who.int/tb/publications/xpert_implem_manual

Global Laboratory Initiative

-27- Xpert MTB/RIF Training Package
 Nódulos Linfáticos y Tejidos
1. Cortar la muestra de tejido utilizando tijeras y
pinzas estériles; poner en un homogeneizador o
molino de tejidos
2. Añadir 2 mL de solución salina (PBS)
3. Coloque el tejido en el homogenizador hasta
obtener una suspensión homogénea.
Protocolos alternativos están
4. Deje en reposo para que las partículas mayores disponibles en el Manual de
sedimenten en el fondo (5-10 minutos) procedimientos del Xpert de la OMS
5. Coloque 0,7 mL del sobrenadante en un tubo para muestras No Estériles. Esas
cónico con tapa de rosca (asegúrese que no se muestras necesitan ser
transfieran grumos de tejido) descontaminadas usando protocolos
6. Añadir 1,4 mL del reactivo de muestra del Xpert similares a la preparación de
muestras de esputo o de muestras de
7. Procese como se describe para la realización de la expectoraçión para cultivo.
prueba de Xpert para muestras de esputo
8. Inocule el cartucho con 2 o + mL Se recomienda también realizar un
Se cultivo del sobrenadante de la
9. Realice la prueba del Xpert
necesita muestra de tejido.
CSB Global Laboratory Initiative
-28- Xpert MTB/RIF Training Package
 Muestras de LCR (Atención: las muestras con sangre pueden interferir con la
prueba del Xpert )
1. Muestras de LCR con más de 5 mL
a) Transferir para un tubo cónico y centrifugar (3000g:15 minutos)
b) Decantar el sobrenadante en un recipiente con solución desinfectante (necesita una CSB)
c) Resuspender el sedimento hasta un volumen de 2 mL utilizando el reactivo de muestra
del Xpert MTB/RIF
d) Inocule el cartucho con la muestra procesada y realice la prueba del Xpert
2. Muestras de LCR con 1-5 mL( incluyendo muestras con sangre)
a) Añadir igual volumen de reactivo de muestra del Xpert MTB/RIF
b) Añadir 2 mL en el cartucho y realice la prueba de Xpert Se debe utilizar
CSB siempre que
3. Muestras de LCR con 0,1-1 mL
exista el riesgo
a) Añadir 2 mL de reactivo de muestra de Xpert de formación de
b) Añadir 2 mL en el cartucho y realice la prueba de Xpert aerosoles, ej.
Decantación
4. Muestras de LCR con menos de 0,1 mL
Es una muestra insuficiente para realizar Xpert MTB/RIF

Global Laboratory Initiative

-29- Xpert MTB/RIF Training Package
  Preparar el número de muestras de acuerdo a la cantidad
de módulos disponibles en el equipo Xpert (o sea, solo
los que se encuentren en funcionamiento).
 Iniciar la preparación de las muestras dentro de los 30
minutos antes que un módulo esté disponible
 No abra el cartucho hasta estar próximo a realizar la
prueba
 Utilice el cartucho dentro de 30 minutos después que se
destape el cartucho

Global Laboratory Initiative

-30- Xpert MTB/RIF Training Package
  La fecha de uso ha caducado
 El cartucho se encuentra húmedo
 La tapa de cierre está rota o ha sido accidentalmente
abierta
 Se ha caído o sacudido el cartucho después de haber
agregado la muestra preparada
 El tubo en la parte posterior parece haber sido dañado
 Cada cartucho es para un solo uso, y no se puede volver a
utilizar una vez que ha sido escaneado
 El paquete (bolsa de 10 cartuchos) ha estado abierto
por más de 6 semanas

Global Laboratory Initiative

-31- Xpert MTB/RIF Training Package
  Tome el cartucho sólo por los
lados. No toque la tapa, el
código de barras o el tubo de
reacción en la parte trasera
 Identificar el cartucho con el
número de muestra,
escribiendo al lado del cartucho
o pegue la etiqueta de
identificación
 No ponga la identificación en la
cubierta del cartucho ni
obstruya el código de barras 2D
del cartucho

Global Laboratory Initiative

-32- Xpert MTB/RIF Training Package
  Abra el cartucho y deposite de 2-
4 mL de la muestra preparada
usando la pipeta plástica de
transferencia (suministrada en el
kit)
 Introduzca la muestra
cuidadosamente evitando formar
aerosoles o burbujas Local do
Orificio del
 No transfiera partículas sólidas cartucho para
cartucho para
adição dala
en el interior del cartucho
depositar
amostra
muestra
 Cierre la tapa firmemente Figura 1: cartucho Xpert MTB/RIF (vista
 Inicie la prueba superior)

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-33- Xpert MTB/RIF Training Package
 Almacenamiento de las muestras:
 Esputo directo o procesado (descontaminado/concentrado)
 Conservar en refrigeración de 2–8°C, por 10 días como máximo
 Si es necesario conservar a temperatura ambiente (por encima de
35°C) hasta 3 días, y a continuación refrigerar de 2–8°C, en total no
debe exceder la conservación más de 10 días
 Almacenaje de la muestra en presencia del reactivo de la muestra:
 Esputo directo o procesado (descontaminado/concentrado)
 Procesar en un tiempo de 12 horas, mantener de 2-8°C. Si no puede
refrigerarse, procesar en 5 horas
 Almacenaje de cartuchos inoculados (ej, en caso de falta de energía
eléctrica):
 Realice la prueba dentro de las 4 horas después de añadir la muestra
 Si han transcurrido más de 4 horas, inocule un nuevo cartucho
Global Laboratory Initiative
-34- Xpert MTB/RIF Training Package
1. Conecte el dispositivo GeneXpert
(Una pequeña luz azul aparece en el panel frontal)
Windows XP

2. Encienda el ordenador

3. Inicie sesión en Windows como usuario Windows 7

Cepheid:
Nombre de usuario: Cepheid
Contraseña: CPHD

4. Haga doble clic en el icono "GeneXpert Dx" en

el escritorio

5. Por favor, acceda con su cuenta de usuario

Global Laboratory Initiative

-35- Xpert MTB/RIF Training Package
 6. Haga clic en "No" en
el cuadro de diálogo
"Gestión de Base de
Datos" para empezar el
día de trabajo

Global Laboratory Initiative

-36- Xpert MTB/RIF Training Package
 7. Haga clic en Check Status para confirmar que todos los módulos
están disponibles
- Si no es así, vaya a "Solución de problemas" (Módulo 9)

Global Laboratory Initiative

-37- Xpert MTB/RIF Training Package
 1.Haga clic en “CREATE TEST”

2. Abre una ventana pidiendo para escanear el código de barras

del cartucho

Global Laboratory Initiative

-38- Xpert MTB/RIF Training Package
 3. Tome el lector de código de barras y escanear el código de barras del
cartucho manteniendo presionado el botón amarillo.

Después de escuchar el Beef, mueva

el cartucho del escáner para evitar
escanear el código de barras en dos
ocasiones

ATENCIÓN: Si el escaner no funciona

se puede introducir manualmente el
código de barras escribiendo los En caso de fallo del lector del
números que aparecen en las dos código de barras durante el uso de
líneas del cartucho un nuevo lote, póngase en contacto
con el Soporte Técnico de Cepheid
para recoger los parámetros de
especificaciones del lote
Global Laboratory Initiative
-39- Xpert MTB/RIF Training Package
4. Después de haber escaneado el código de
barras, aparecerá esta ventana

5. Introduzca el nombre de identificación del

paciente

6. Introduzca la ID de la muestra Nr = Serie de

Laboratorio

De forma predeterminada, el software en

pantalla muestra el tipo de prueba a realizar

El módulo donde se coloca el cartucho se

selecciona automáticamente
(Nota: el módulo que menos se ha utilizado
es el que se selecciona, un módulo diferente
puede ser seleccionado de forma manual)

7. Haga clic en “Start test”

Global Laboratory Initiative

-40- Xpert MTB/RIF Training Package
  Abra completamente la puerta del
módulo elegido indicada por una
luz verde parpadeante por
encima del módulo seleccionado
 Inserte el cartucho
cuidadosamente con el código de
barras hacia adelante
 Al cerrar la puerta del módulo
con el cartucho la prueba se
iniciará automáticamente

Siempre sostenga el cartucho en posición vertical: evite agitarlo, inclinarlo o que caiga

Global Laboratory Initiative

-41- Xpert MTB/RIF Training Package
  Si el lector de código de barras no funciona, puede
introducir el código de barras

Clic en «Manual Entry» Introduzca manualmente

Clic en «Create Test»
las dos líneas de números
que aparecen en el
cartucho

Global Laboratory Initiative

-42- Xpert MTB/RIF Training Package
Video se encuentra disponible en FTP: ftp://hbdc:[email protected]
Los archivos de vídeo FTP son grandes, por lo que deben ser descargados en un CD
antes del entrenamiento.

Global Laboratory Initiative

-43- Xpert MTB/RIF Training Package
 En “Check status“ (ver siguiente diapositiva), asegúrese de que
la etapa se ha actualizado de "loading" (carga) para "run" (en
curso), lo que significa que se inició el proceso de prueba
 Si desea ver el progreso de la prueba, se puede comprobar:
 progreso de la prueba (por ejemplo, 3/45 significa que la
prueba está en el tercer ciclo de PCR de un total de 45 ciclos)
 tiempo restante hasta el final de la prueba
 estado de la prueba (por ejemplo, "OK")
 si el programa muestra Error o Warning (advertencia), ver
Messages (mensajes) para una descripción del problema (ver
siguiente diapositiva)

Global Laboratory Initiative

-44- Xpert MTB/RIF Training Package
1.Clic en
“CHECK STATUS”

2. Se dan el progreso,
el estado, y el tiempo
restante

3. Messages
Con más detalles

Global Laboratory Initiative

-45- Xpert MTB/RIF Training Package
 Si el cartucho no se prepara
adecuadamente, puede
detener la prueba para evitar
la pérdida de tiempo:
1. Clic en “STOP TEST”

2. Seleccione el módulo que

debe ser detenido, marcando
la casilla correspondiente

1. Una vez seleccionado, haga

Clic en “Stop”

Global Laboratory Initiative

-46- Xpert MTB/RIF Training Package
4. Confirme su elección
haciendo Clic “Yes”

5. Usted verá los detalles

de la prueba interrumpida
en la sección “Check Status”

Global Laboratory Initiative

-47- Xpert MTB/RIF Training Package
 Ver el Módulo 7 – Interpretación de Resultados para los
siguientes tópicos:
 Ver el resultado de la prueba

 Edite la información relacionada con la prueba

 Emitir un informe de prueba (muestra y paciente)

 Cómo imprimir automáticamente el informe de la prueba

 Las diferencias entre los archivos / copia de seguridad:

cómo archivar, recuperar, copia de seguridad y restaurar
datos de una copia de seguridad
 Datos de copia / pegar en una hoja de cálculo Excel

Global Laboratory Initiative

-48- Xpert MTB/RIF Training Package
 La prueba de Xpert MTB/RIF es un sistema de microfluidos integrado
compuesto por el equipo GeneXpert, cartuchos de prueba Xpert MTB /
RIF, un protocolo automatizado (amplificación de ADN y la detección
simultánea de la fluorescencia) con los controles internos (CPC y SPC)
 Los protocolos de preparación de muestras se deben seguir para
esputo directo (2: 1) o sedimento de esputo procesado (3: 1), y las
muestras extrapulmonares - seguir las medidas de bioseguridad de
acuerdo con la muestra recibida
 Compruebe la integridad del cartucho antes de su uso, identificar
correctamente, e inocular con una cantidad suficiente (2-4 ml) de la
solución final
 Después de cargar el cartucho en el equipo GeneXpert, el software del
sistema permite supervisar el progreso de la prueba

Global Laboratory Initiative

-49- Xpert MTB/RIF Training Package
 Enumerar y describir los diferentes componentes de la
tecnología GeneXpert
 Enumerar y describir los diferentes controles y sus
mecanismos
 Describir el procedimiento de preparación de la muestra (de
acuerdo con la muestra examinada) y los pasos posteriores
necesarios para crear y ejecutar una prueba
 ¿Cómo se puede controlar el progreso de una prueba?
 ¿Por qué es posible que se necesite detener una prueba?
Cómo hacerlo?

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-50- Xpert MTB/RIF Training Package