GUÍA DE LABORATORIO-QUI-343

La Guía de Laboratorio corresponde a un material de

apoyo a la docencia experimental del curso Qui -343,
Bioquímica, impartido a alumnos de la carrera de
Ingeniería Bioquímica, que tiene como objetivo:
Conocer y aplicar técnicas de Laboratorio utilizadas en
la detección, cuantificación de macromoléculas y del
seguimiento de reacciones químicas que ocurren en
procesos metabólicos básicos.

PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATÓLICA DE VALPARAÍSO

INSTITUTO DE QUÍMICA PROFESOR RESPONSABLE: Carolina Gallardo Olea
Primer Semestre de 2021 e-mail: [email protected]
HORARIO DE ATENCIÓN ALUMNOS: Por confirmar

1
TABLA DE CONTENIDOS
IDENTIFICACIÓN DE LA ASIGNATURA .............................................................................................. - 3 -
INSTRUMENTOS DE EVALUACIÓN................................................................................................... - 4 -
MEDIDAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO ............................................................................. - 4 -
PROTECCIÓN PERSONAL ................................................................................................................. - 5 -
CLASIFICACIÓN DE LOS PRODUCTOS QUÍMICOS SEGÚN LA NORMA NFPA 704............................. - 6 -
PROTOCOLO DE URGENCIAS INSTITUTO DE QUÍMICA ................................................................... - 7 -
IDENTIFICACIÓN DE LA ASIGNATURA

Nombre de la asignatura BIOQUÍMICA

Clave QUI-343
Créditos 4
Horas teóricas 4
Horas experimentales 4
Ubicación dentro de la malla Tercer semestre
Prerrequisitos QUI 1149

Profesor responsable Laboratorio Carolina Gallardo Olea

Mail [email protected]
Horario atención alumnos

1.-Conocer Técnicas de Cuantificación de

Macromoléculas
Resultados de aprendizaje 2.-Identificación de Macromoléculas
(Laboratorio) 3.-Observación de procesos metabólicos
vinculados a la Cadena Transportadora de
electrones

1.-Controles de entrada
Instrumentos de Evaluación
2.-Informes de Laboratorio
(Laboratorio)
3.-Pruebas de Post Laboratorio

1.- Cuantificación de Proteínas

2.- Métodos Cromatografía
3.- Cuantificación de Hidratos de Carbono
Prácticas a desarrollar 4.- Cinética enzimática
5.-Metabolismo

1.- Asistencia Obligatoria

Otros (Laboratorio) 2.- Normas de Seguridad en laboratorio
3.- Retraso máximo permitido: 10 min
INSTRUMENTOS DE EVALUACIÓN
El laboratorio será evaluado de acuerdo a las siguientes consideraciones:

MEDIDAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

Por sus propias características, el trabajo en el laboratorio presenta una serie de riesgos de origen y
consecuencias muy variadas, relacionados básicamente con las instalaciones, los productos que se
manipulan y las operaciones que se realizan con ellos. Con respecto a los productos debe tenerse
en cuenta que suelen ser peligrosos, aunque normalmente se emplean en pequeñas cantidades y
de manera discontinua. En consecuencia, la prevención de los riesgos en el laboratorio presenta
características propias que la diferencian de otras áreas productivas.

Variaciones en los procedimientos, como el cambio de reactivos o las cantidades de éstos, son
peligrosas. Pregunte siempre al Profesor Responsable del Laboratorio, antes de hacer algún cambio
y recuerde:

“Realizar los procedimientos con seguridad no es solamente la manera correcta de trabajar, es la

única manera de hacerlo”.

Luego y antes de comenzar cualquier operación o hacer un experimento es importante preguntarse:

“¿Qué pasaría si...?”. La respuesta a esta pregunta requiere conocer los peligros de las sustancias
químicas y el equipo que se va a utilizar. La reactividad, inflamabilidad, corrosividad y la toxicidad
de los compuestos que van a utilizar son los que van a dictar las precauciones necesarias a tener en
cuenta. De este modo, la manera preferida de trabajar con sustancias químicas, es aquella en la que
se reduzca o minimice la probabilidad de que suceda un accidente o exposiciones a compuestos
tóxicos, aún a bajas concentraciones. Para reducir la probabilidad de accidentes debe:

 Practicar el hábito de la prevención de accidentes.

 Utilizar equipo de protección personal (por ejemplo: lentes de protección y bata de
seguridad) todo el tiempo que se esté en el laboratorio.
 Seguir las instrucciones del Profesor del Laboratorio y consulte siempre en caso de duda.
 Anticipar las posibles consecuencias del trabajo que se va a realizar en el laboratorio.

Asimismo, debe seguir las siguientes reglas de seguridad:

 No jugar bromas en el laboratorio
 Familiarizarse con la ubicación y uso del equipo de seguridad (salidas de emergencia, duchas
y lavaojos)
 Antes de entrar al laboratorio debe estar familiarizado con los peligros de las sustancias
químicas a utilizar. Aprenda lo que se puede hacer y lo que debe evitar hacer.
 Siempre utilice los lentes de protección cuando se esté trabajando con sustancias químicas
o equipo, sea usted quien esté trabajando o algún compañero que se encuentre cerca.
 Use vestimenta apropiada: zapatos cerrados y bata de laboratorio.
 Recoja el pelo largo y la ropa muy suelta.
 Siempre lave las manos y los brazos con jabón al salir del laboratorio.
 Nunca trabaje solo en el laboratorio.
 No prepare o almacene bebidas o comida en el laboratorio.
 Nunca consuma ninguna bebida o alimento mientras está trabajando en el laboratorio.
 Nunca pipetee con la boca.
 No puede manipular los lentes de contacto en el laboratorio, a no ser que sea para
removerlos y poder usar el lavaojos en caso de una emergencia.
 Nunca debe hacer experimentos no autorizados.
 Cuando se mueva dentro del laboratorio anticipe el movimiento de sus compañeros. Si se
llega a tropezar o caer llevando material de vidrio o sustancias químicas trate de lanzarlas
lejos de usted y de los demás.
 Nunca debe sacar sustancias químicas del laboratorio sin autorización.
 Mantenga los compuestos químicos y los equipos de laboratorio, lejos del borde de la mesa
de trabajo.
 No juegue o haga bromas en el laboratorio.
 Reporte a su Profesor las violaciones de las normas de seguridad en el laboratorio. Con esto
puede estar salvando su propia vida y la de sus compañeros.

PROTECCIÓN PERSONAL

 Protección de los ojos: Mientras permanezca en el laboratorio, debe utilizar lentes de

protección contra salpicaduras, sin importar que no esté realizando ninguna parte del
procedimiento. Los lentes de contacto no proveen ninguna protección contra una
salpicadura, por lo que debe, usar los lentes de protección aun cuando se utilicen lentes de
contacto.
  Vestimenta: La ropa utilizada en el laboratorio debe proteger tanto de salpicaduras como
de derrames y debe ser fácilmente removible.
 Una bata de laboratorio, no debe tener botones sino cualquier tipo de broches fáciles de
abrir para que pueda ser removible fácilmente.
 En el laboratorio se debe utilizar zapatos totalmente cerrados. No se acepta el uso de
sandalias o cualquier zapato que deje piel al descubierto.
 Se deben usar pantalones largos. El uso de pantalones o faldas es un riesgo de exposición a
sustancias corrosivas innecesario.
 Debe utilizar el pelo largo recogido.
 No se debe usar accesorios de joyería, ésta puede ser dañada por alguna salpicadura o por
vapores corrosivos, además incrementa el riesgo de contacto con alguna fuente de
electricidad.

 Guantes: Los guantes son una parte muy importante de la protección personal. El Profesor
de Laboratorio, indicará cuando su uso es apropiado o necesario. Utilice los guantes
correctamente; antes de usarlos debe revisar que no tengan agujeros. Para evitar dispersar
compuestos químicos inconscientemente, una vez terminado el trabajo debe remover los
guantes antes de abandonar el área de trabajo y antes de sostener cualquier cosa tales
como teléfonos, perillas de puertas, libros, cuadernos, etc. que puedan contaminarse.

CLASIFICACIÓN DE LOS PRODUCTOS QUÍMICOS SEGÚN LA NORMA NFPA 704

La norma NFPA 704 es el código que explica el diamante del fuego, utilizado para comunicar los
peligros de los materiales peligrosos. Es importante tener en cuenta que el uso responsable de este
diamante o rombo implica que todos conozcamos, tanto los criterios de clasificación como el
significado de cada número sobre cada color.

El rombo de color azul, está

asociado al peligro a la salud.

El rombo de color rojo, está

asociado al peligro de
inflamabilidad.

Grado de Peligro El rombo de color amarillo está

A estas tres divisiones se les asigna un número de 0 (sin asociado al peligro de inestabilidad.
peligro) a 4 (peligro máximo).

Grado de Peligro
4 Mortal
3 Muy Peligroso
2 Peligroso
1 Poco Peligroso
0 Sin Riesgo
PROTOCOLO DE URGENCIAS INSTITUTO DE QUÍMICA

Secretaria de Dirección
notifica Monitores de
Primeros Auxilios

Monitores de Primeros Auxilios

evalúan y trasladan a sala de
observación 2º piso

Secretaria de Dirección Instituto de Química: 32-2274910

Monitores de Prevención
Prevencionista de Riesgos Instituto de Química*: 32-2274935
Encargado de Materiales Instituto de Química*: 32-2274936
Administrador Campus: 32-2274693
*Oficina en piso -1 Edificio de Ciencias
ACTIVIDADES PRÁCTICAS
 LABORATORIO Nº1

ESPECTROFOTOMETRÍA: CUANTIFICACIÓN

1. Aspectos teóricos de espectrofotometría cuantitativa

La absorción de luz por parte de una sustancia es una propiedad característica de ella, que
puede ser utilizada para su identificación y cuantificación.

Todas las sustancias absorben luz en alguna región del espectro electromagnético (VIS, UV,
IR, etc.).

La absorción de luz depende de la estructura química del compuesto absorbente, y en

especial de ciertos grupos funcionales, de modo que es posible identificar un compuesto
por medio de las características de su espectro de absorción.

A NAD+

NADH

260 300 340  nm

+
Figura 1. Espectros de absorción del NAD y del NADH.

Ley de Lambert-Beer

Lambert y Beer demostraron que la absorbancia (A), también llamada densidad óptica
(D.O.) de una sustancia es directamente proporcional a la concentración (c) de la sustancia
absorbente, la longitud del paso de luz (l) (espesor de la solución) y una constante
denominada coeficiente de extinción o coeficiente de absorción (a), que es característico
para cada sustancia a una longitud de onda () determinada.
𝑨 = ℇ𝒍𝒄 Ecuación 1.1
Para medir la absorbancia de una sustancia se utiliza el espectrofotómetro, instrumento
destinado a medir la absorción por especies inorgánicas y orgánicas de luz monocromática
en la región ultravioleta / visible del espectro.
Los espectrofotómetros dan la lectura directa de la absorbancia (A) o bien, el porcentaje de
transmitancia (%T). La relación entre ambos es:

𝑨 = 𝟐 − 𝒍𝒐𝒈 % 𝑻 Ecuación 1.2

Análisis espectrofotométrico:

Todo método espectrofotométrico se basa en la comparación de la absorbancia de una

sustancia de concentración desconocida con la de una solución de la misma sustancia cuya
concentración se conoce y a la cual se denomina solución patrón o estándar.

La absorbancia de una solución es la resultante de la absorbancia del soluto cuya

concentración se desea conocer y la de otros componentes del sistema (solventes,
reactivos) que absorben también a esa longitud de onda. Estos compuestos se denominan
interferencias. Se debe descartar la absorbancia de las interferencias, para ello es necesario
hacer siempre una muestra que contenga todas los componentes del sistema menos aquel
que se desea medir. Esta muestra se llama blanco y la absorbancia de éste debe restarse a
las muestras problema y a los patrones, o bien, con el blanco se calibra el instrumento a
absorbancia igual a 0, o sea 100% de transmisión.

Curva de Calibrado:

Se obtiene la curva de calibrado midiendo la absorbancia de una serie de soluciones de

concentraciones conocidas de una misma sustancia tratadas con un mismo método y
medidas a igual longitud de onda en el mismo instrumento. Para medir la concentración de
una sustancia se elige por lo general, la región de máxima absorción del espectro,
denominada longitud de onda analítica.

El resultado se expresa en una gráfica de la absorbancia (A) en función de la concentración

(c). Si el sistema sigue la ley de Lambert-Beer se obtiene una línea recta que pasa cerca del
origen; de cuya pendiente se puede obtener el coeficiente de extinción (a) (Ecuación 1.3).

Es posible determinar gráficamente la concentración de una muestra desconocida (cx)

midiendo la absorbancia de la muestra (Ax) e interpolando en la curva de calibrado.

Normalmente la concentración se estima, a partir de la ecuación de la curva de calibrado.

𝑨 = 𝜺 × 𝒍 × 𝑪 + 𝑨𝒐 Ecuación 1.3

Donde, A es la variable dependiente (y), la pendiente es igual a (a  l), c es la variable

controlada (x) y Ao es el intercepto.
Las unidades del coeficiente de extinción dependen de las unidades de concentración y de
longitud del paso de luz. Generalmente la unidad de longitud es el centímetro y la longitud
del paso de luz es 1,0 cm. Si las unidades de concentración son moles L -1 o milimoles L-1, se
hace referencia al coeficiente de extinción molar (µl o milimolar, respectivamente
(Ecuación 1.4). Si la concentración está expresada en g/100 mL (% peso / volumen) se
obtiene el coeficiente de extinción específico (E1%).

𝑨 = 𝜺 × 𝒍 × 𝑪 + 𝑨𝒐 Ecuación 1.4

Cuando la concentración de la sustancia y la longitud del paso de la luz se hacen iguales a la

unidad, la absorbancia corresponde al coeficiente de extinción. Si se midiera la absorbancia
de una solución 1,0 M de una sustancia colocada en una celda de 1,0 cm se obtendría el
coeficiente de extinción molar (). Si la concentración fuera 1,0 g/100 mL se obtendría el
coeficiente de extinción específico (E1%). Estos coeficientes son una propiedad específica de
las partículas absorbentes y su valor es referido a un determinado solvente y a una
determinada longitud de onda.

Cuando se conoce por bibliografía el coeficiente de extinción de un compuesto (E1%), o éste

es estimado experimentalmente, midiendo la absorbancia (AX) de una muestra del
compuesto de concentración desconocida (cX) se puede calcular su concentración (ecuación
1.5).
𝑨 −𝑨
𝑪𝒊 = 𝒙 𝟎 Ecuación 1.5
𝜺×𝒍

En esta forma se obtiene la concentración (cf) de la muestra problema en la cubeta, para

obtener la concentración original (ci) se debe considerar las diluciones correspondientes al
ensayo usado para cuantificar (Ecuación 1,6).

𝑽𝒊 × 𝑪𝒊 = 𝑽𝒊 × 𝑪𝒊 Ecuación 1.6

Fórmula del Estándar.

La concentración desconocida puede determinarse sobre la base de un sólo estándar, de

acuerdo a la siguiente ecuación:

𝑽 𝑽
𝑨𝒔 × 𝑪𝒎𝒑 × ( 𝒊 ) = 𝑨𝒎𝒑 × 𝑪𝒔 × ( 𝒊 ) Ecuación 1.7
𝑽 𝒇 𝑽 𝒇

𝐀𝐬 y 𝐀𝐦𝐩 son las absorbancias del estándar y muestra problema, respectivamente.

𝐕𝐢 corresponde al volumen de la solución estándar o de la muestra problema ocupado en
el ensayo para cuantificar.
𝐕𝐟 corresponde al volumen final del ensayo ocupado para cuantificar.
𝐂𝐬 y 𝐂𝐦𝐩 corresponden a las concentraciones de las soluciones estándar y muestra
problema respectivamente. Ambas concentraciones se refieren a las originales sin la
dilución propia del ensayo ocupado para cuantificar.
Unidades.

Absorbancia (A): Adimensional (sin unidades)

Longitud (l): cm

Concentración (c):
 molar,
 milimolar,
 g/100 mL

Coeficiente de extinción (a)

 molar ()
 M-1 cm-1
 L moles-1 cm-1
 mL milimoles-1 cm-1

 milimolar ()
 mM -1 cm-1
 L mmoles-1 cm-1
 mL moles-1 cm-1

 Específico (E1%)
 dL g-1 cm -1
 (g/100mL) –1 cm-1

Cuantificación de proteínas de solución:

En general, no hay un método completamente satisfactorio para medir la concentración de

proteínas en una muestra. La elección del método depende de la naturaleza de la proteína,
de los otros componentes de la muestra problema, de la rapidez y sensibilidad deseada. En
este trabajo práctico se verán dos de los métodos que se usan corrientemente para medir
concentraciones de proteínas, Biuret y Lowry.

Método Biuret

Los compuestos que tienen dos o más uniones peptídicas (péptidos y proteínas) dan color
púrpura característico cuando se tratan con una solución alcalina de sulfato de cobre
diluida. El color se debe aparentemente al complejo de coordinación del Cu con cuatro
átomos de nitrógeno, que participan en el enlace peptídico. Este método es reproducible,
pero requiere una alta concentración de proteínas para la formación de color. La
sensibilidad del método es de 0,25 – 200 mg de proteínas por mL de solución.

Método de Lowry

Los aminoácidos pueden dar reacciones características con ciertos reactivos de acuerdo a
la naturaleza de sus cadenas laterales. Muchas reacciones de este tipo se caracterizan por
la formación de productos coloreados. La tirosina por ejemplo, debido a su grupo
hidroxifenilo, reacciona con una solución de ácido fosfomolíbdico tungstico en un medio
cúprico alcalino, produciendo una coloración azul, la cual absorbe a 650 nm.
Este método llamado originalmente Folín – Ciocalteau debido a sus estudios iniciales ha sido
desarrollado y transformado, por Lowry y colaboradores, en un procedimiento muy sensible
que ha sido ampliamente usado para la determinación cuantitativa de proteínas en una
muestra.

En el método de Lowry la muestra se trata con el reactivo de Folin – Ciocalteau modificado.

Si hay proteínas presentes se produce una coloración azul debido principalmente a la
presencia de residuos de tirosina y triptofano en las proteínas.

Se mide la absorbancia a 650 nm y se compara con las medidas obtenidas de soluciones de

proteínas de concentración conocida (patrón), tratadas de forma idéntica.

Sin embargo, debido a las diferencias en el contenido aminoacídico de una proteína a otra,
cantidades iguales de proteínas distintas, producen coloración diferente con el reactivo de
Lowry, motivo por el cual no es posible obtener la concentración real de una muestra de
proteína por este método, aun así, cuando se requiere una estimación relativa de la
concentración de proteínas, este método es ampliamente satisfactorio, debido a su alta
sensibilidad. Sensibilidad 1 – 200 g de proteínas por ensayo.

2. Objetivos.
Cuantificar proteínas ocupando técnicas espectroscópicas como el método de Lowry y el
método de Biuret.

3. Parte experimental
3.1 Equipos y materiales
 espectrofotómetro (visible)
 celdas para espectrofotómetro
 1 baño termostatizado
 1 termómetro.
 16 tubos de ensayo
 2 gradillas
 Micropipetas p1000 / p100
 1 pizeta.
 1 vaso precipitado de 250 ml  1 vaso precipitado de 100 ml

3.2 Reactivos.
 Reactivo de Biuret:
 Solución estándar de ovoalbúmina al 5% en NaCl 9%.
 Reactivo de cobre alcalino (RCA).
 Reactivo Folin (RF)
 Ovoalbúmina
 Albúmina de suero de bovino (BSA).

4. Procedimiento.
4.1. Método de Biuret.
De acuerdo a la tabla 1.1:
 Prepare una batería de tubos enumerados.
 Agregue el volumen indicado de la solución de ovoalbúmina estándar o muestra
problema con una micropipeta p1000/p100 según corresponda.
 Agregue el volumen indicado de agua con una micropipeta p1000/ p100 según corresponda
 Agregue 2,0 mL del reactivo de Biuret con una micropipeta p 1000

TABLA 1.1

 Agite y espere 20 minutos a temperatura ambiente para la formación del complejo

coloreado.
 Mida la absorbancia de los tubos en un espectrofotómetro a 540 nm, previa calibración
del equipo con el blanco.

De acuerdo a los datos:

 Calcule la concentración de la ovoalbúmina en los tubos (2S – 6S)
 Complete la tabla con los valores de absorbancia y concentración.
 Obtenga la ecuación de la recta y el coeficiente de regresión por regresión lineal.
 Construya una gráfica absorbancia versus concentración, trace la recta obtenida por
regresión.
 Calcule las concentraciones de las muestras problemas en las cubetas mediante la
ecuación 1.5.
 Calcule las concentraciones de las muestras problemas en las soluciones originales
considerando las diluciones realizadas en el ensayo (Ecuación1.6). Recuerde que cx
(Ecuación 1.5) corresponde a cf (Ecuación 1.6).

4.2. Método de Lowry.

De acuerdo a la tabla 1.2:
 Prepare una batería de tubos enumerados.
 Agregue los volúmenes indicados de la solución de seroalbúmina de bovino (BSA)
estándar o muestra problema con una micropipeta p1000 o p100
 Agregue los volúmenes indicados de agua con una micropipeta p1000.
 Agregue 1,0 mL del reactivo alcalino (RCA) con una micropipeta p1000. Espere 10
minutos exactos
 Después de los 10 minutos, agregue 2,0 mL del reactivo de Folin con una micropipeta
p1000
 Caliente los tubos por 5 minutos exactos a 55ºC en el baño termostatizado.
 Enfríe y lea en el espectrofotómetro a 650 nm, previa calibración con el blanco.

TABLA 1.2

 Calcule la concentración de BSA en los tubos (2S – 6S).

 Complete la tabla con los valores de absorbancia y concentración.
 Obtenga la ecuación de la recta por regresión lineal y el coeficiente de regresión.
 Construya una gráfica absorbancia versus concentración, trace la recta obtenida por
regresión.
 Calcule las concentraciones de las muestras problemas en la cubeta mediante la
ecuación 1.5.
 Calcule las concentraciones de las muestras problemas en las soluciones originales
considerando las diluciones realizadas en el ensayo (Ecuación 1.6).

5. Bibliografía
 Bohinski Robert, 1991, Bioquímica , 5ª Edición, Addison-Wesley, Iberoamericana.
 D Skoog, D. West y F. Holler, 1995, Química Analítica, 6ª Edición.
 D.Bozimowsk, J.D. Artiss and B. Zak, 1983, Spectrophotometric comparison of several
reactions used for cerebrospinal fluid protein determinations. Microchemical Journal
23, 285-293.
 LABORATORIO Nº2

MÉTODOS DE SEPARACIÓN: CROMATOGRAFÍA

1. Aspectos teóricos de la cromatografía.

La cromatografía es una técnica de separación de solutos de una mezcla, que se basa en la
diferente velocidad con que se mueve cada uno de los solutos a través de un medio poroso,
arrastrados por un disolvente en movimiento. A este disolvente se le llama fase móvil y el
medio poroso puede ser la fase estacionaria, o bien servir de soporte a esta fase. Se habla
de cromatografía en columna cuando la fase estacionaria o su soporte están contenidos en
una columna.

La separación cromatográfica constituye un proceso dinámico que permite un intercambio

continuo por desplazamiento de una fase con respecto a la otra. El diferente reparto de
solutos entre las fases móvil y estacionaria es la causa de la separación de los solutos. El
soluto que tiene mayor afinidad por la fase estacionaria se moverá con mayor lentitud.

La fase móvil se llama eluyente. Cuando emerge por la salida de la columna se llama eluato.
El proceso que consiste en hacer pasar un líquido o un gas a lo largo de la columna de
cromatografía se llama elución. El volumen de elución (ve) es el volumen de fase móvil que
se requiere para eluir un soluto dado de la columna cromatográfica.

Se puede clasificar las cromatografías en 5 grandes grupos:

 Cromatografía de Reparto.
 Cromatografía de Adsorción.
 Cromatografía de Intercambio Iónico.
 Cromatografía de Exclusión.
 Cromatografía de Afinidad.

a. Cromatografía de Reparto:
Está basada en la separación o reparto de una mezcla de solutos entre la fase móvil
(disolvente) y la fase estacionaria soportada sobre un sólido adecuado, de acuerdo a las
distintas solubilidades de estos solutos en ambas fases. Si el disolvente es un líquido se
denomina cromatografía líquida. Son cromatografía de reparto la cromatografía en papel y
la cromatografía en capa fina (TLC).

La cromatografía en papel se utiliza para la separación de cantidades mínimas de soluto y

también como un criterio de pureza. Se basa en la diferente velocidad con que se mueve
cada uno de los solutos a través de una fase estacionaria que es el agua retenida sobre un
soporte sólido e inerte (celulosa), arrastrado por un disolvente en movimiento.
Una vez realizada la cromatografía, la posición de los componentes se determina mediante
una técnica que permita “visualizarlos”. Es común revelar el cromatograma mediante
reacciones que originen productos coloreados.
 Los componentes de una mezcla se pueden identificar por su migración con respecto al
solvente móvil en condiciones definidas en relación con el comportamiento de patrones. El
cromatograma no es alterado por la presencia de otros solutos.

Se calcula la razón de migración del soluto con respecto a la fase móvil (Rf ) que se compara
con la de los patrones (Ec. 2.1).

𝑑𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑒𝑙 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜

𝑅𝑓 = Ecuación 2.1
𝑑𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑙𝑎 𝑓𝑎𝑠𝑒 𝑚ó𝑣𝑖𝑙

El Rf debe calcularse de acuerdo a la distancia recorrida por el soluto, desde su punto de

partida hasta el punto medio de la posición de éste una vez corrida la cromatografía, y la
distancia recorrida por la fase móvil, también medida desde el punto de partida del soluto
hasta el frente del solvente en el papel.

Como los Rf son constantes en condiciones definidas y controladas permiten identificar los
componentes de una mezcla de solutos, en la medida que los Rf de muestras y patrones se
obtengan en un mismo experimento.

b. Cromatografía de Adsorción:
Está basada en la diferente adsorción y posterior desorción de sustancias contenidas en
un disolvente móvil (líquido o gas) sobre un sólido estacionario. No se debe confundir
la adsorción que es un fenómeno de superficie que se manifiesta por el aumento de
concentración de la interfase que rodea al medio estacionario, con la absorción que
consiste en la penetración de una sustancia en el seno de otra. Ejemplos de
cromatografía de adsorción son la cromatografía en columna de alúmina y de carbón
activado, la placa de sílica gel.

c. Cromatografía de Intercambio Iónico:

La fase estacionaria es una matriz polimérica porosa que posee grupos iónicos unidos
covalentemente y contraiones móviles que pueden ser intercambiados por iones
arrastrados por la fase móvil (líquido).

d. Cromatografía de Exclusión Molecular:

Las moléculas pueden ser separadas también sobre la base de sus diferentes tamaños al
pasar a través de una columna que contiene partículas hidratadas de geles porosos. Se
encuentra en el mercado un buen número de materiales para estos fines, cuya composición
y porosidad son controladas cuidadosamente, de modo que moléculas de tamaño
relativamente parecido puedan ser separadas mediante la adecuada selección del tamaño
del poro gel (tabla 1). El Sephadex consta de partículas pequeñas de dextrano formadas por
una red tridimensional de cadenas de polisacáridos ramificados. Es altamente polar debido
a su alto contenido de grupos hidroxilos, por ello se hincha considerablemente cuando se
coloca en agua. La mezcla de moléculas grandes y pequeñas se colocan sobre la superficie
libre superior del gel. A medida que la muestra desciende por la columna, las moléculas
pequeñas difunden dentro del gel teniendo que recorrer un camino más largo, mientras
que las moléculas grandes pueden ser completamente excluidas de los poros del gel.
Eventualmente se obtiene una separación completa en la que las moléculas grandes salen
primero de la columna y por último las más pequeñas.

El resultado de la columna cromatográfica se expresa en la forma de un diagrama de elución

que muestra la variación de la concentración del soluto en el eluyente versus el volumen
del eluyente que ha pasado por la columna. De este diagrama se obtiene el volumen de
elución.

El volumen de elución (Ve) no es un criterio para definir el comportamiento de un

compuesto, ya que varía con el volumen total de la columna (Vt) y la forma como la columna
ha sido empaquetada. Para ello se utiliza la constante Kav (Ec. 2.2).

𝑽𝒆 − 𝑽𝟎
𝑲𝒂𝒗 = Ecuación 2.2
𝑽𝒕 − 𝑽𝟎

En cromatografía de exclusión el volumen de la fase móvil se llama volumen intersticial (V0).

El valor de V0 se determina haciendo pasar por la columna una molécula grande e inerte de
peso molecular superior al límite de exclusión del gel. El azul de dextrano 2000, un colorante
con peso molecular de 2*106, se utiliza generalmente con este propósito. Cuando no se
dispone de la información adecuada para este cálculo, el Vo se puede estimar como el 35%
del volumen total de la columna (Vt). El volumen total de la columna se calcula a partir de
las dimensiones de la columna (Vt =  · r2 · h ).

De los cuatro tipos de cromatografía, en este laboratorio se usará la cromatografía de

reparto en papel y la de exclusión sobre Sephadex G-25.

2. Objetivos.

Identificar aminoácidos de una muestra problema mediante la cromatografía de reparto en

papel.

Separar diclorofenol-indofenol y hemoglobina ocupando la técnica de cromatografía de

exclusión.
3. Parte experimental.

3.1 Materiales
 espectrofotómetro / celdas.
 1 cámara cromatográfica
 6 capilares o utilizar micropipetas
 1 papel filtro (14 cm de ancho)
 1 pizeta
 2 placas de porcelana
 1 columna cromatográfica de Sephadex G-25 hidratado
 1 manguera y regulador
Micropipetas p100/p 10
 1 pipeta graduada de 1 ml
 1 pipeta graduada de 5 ml
 1 vaso precipitado de 250 ml
 1 vaso precipitado de 150 ml
 2 gradillas
 20 tubos de ensayo

3.2 Reactivos
 leucina, glicina, lisina y prolina (1mg/ml) (patrones)
 solución n-butanol / ácido acético/ H2O en relación 3:1:1 (fase móvil).
 ninhidrina 0,2 % en etanol.
 tampón fosfato 67mM pH 7,0 / NaCl 0,1 M .

4. Procedimiento.

4.1 Cromatografía de reparto en papel para separación e identificación de aminoácidos.

 Coloque con anticipación la fase móvil en la cámara cromatográfica y tape la cámara, de

modo que se sature con los vapores de esta fase.
 Tome el papel de un borde (superior) ocupando guantes de goma para evitar
contaminarlo con aminoácidos o proteínas que se encuentren en las manos.
Corte el papel filtro como un rectángulo de 30 cm de alto y 14 cm de ancho. Marque
con lápiz grafito una línea a lo ancho del papel a 1,5 cm del borde inferior. Marque
puntos en esta línea separados por una distancia de 1,5 a 2,0 cm entre si.
 Coloque con un capilar fino, diferente para cada muestra, las soluciones de los
aminoácidos patrones y las muestras problemas sobre la línea marcada. Identifique
siempre con lápiz grafito cada aplicación.
 Enganche la tira de papel filtro en la parte superior de la cámara cromatográfica que se
encuentra saturada con los vapores de la fase móvil. Deje el borde inferior del papel
sumergido 1,0 cm en la fase móvil.
 Deje que la fase móvil ascienda unos 15 cm aproximadamente, no permita que el líquido
sobrepase el borde superior y saque el papel de la cámara.
 Deje secar a temperatura ambiente.
 Revele la cromatografía rociando el papel con ninhidrina y secando el cromatograma en
una estufa a 80 – 90ºC. Los aminoácidos aparecen como manchas púrpuras y amarillas.
 Marque el centro de las manchas de los aminoácidos, mida el avance de cada muestra
y del frente del solvente a la altura de cada muestra.
 Calcule la razón de migración de los solutos con respecto a la fase móvil (Rf) (Ec. 2.1).

4.2 Separación de la hemoglobina (Hb) del colorante diclorofenol-indofenol (DCPIP) por

cromatografía de exclusión en Sephadex G-25 (1- 5 kD).

 Abra la llave reguladora del flujo de la columna cromatográfica y deje salir el tampón
hasta que quede al nivel del Sephadex, una vez realizado, detenga el flujo cerrando la
llave.
 Agregue 0,5 ml de la muestra problema sobre la superficie del gel de la columna
cromatográfica y mantenga el flujo detenido. Recolecte y mida el volumen eluido a
partir de este momento.
 Conecte la columna a la fase móvil y regule el flujo a 10 gotas por minuto mediante las
llaves reguladoras.
 Recoja fracciones de 3,0 ml del eluyente hasta que toda la muestra haya eluido.
 Mida la absorbancia de todas las fracciones recolectadas a 420 nm (Hb) y 580 nm (DCFIF)
 Mida la absorbancia de las muestras recogidas a 420 (Hb) y 580 nm ( DCFIF).
 Grafique en un gráfico la absorbancia versus el volumen de elución a ambas longitudes
de onda.
 Determine el Kav para cada constituyente de la mezcla según la Ec. 2.2.

5. Bibliografía

 Robert Bohinski, 1991. Bioquímica, 5ª Edición, Addison-Wesley, Iberoamericana.

 Donald Voet and Judith G. Voet, 1998. Biochemistry. John Wiley & Sons.
 A.L. Lehninger, D.L. Nelson and M.M. Cox, 1993. Principles of Biochemistry (Second
Edn.) Worth Publishers.
 LABORATORIO Nº 3

DETERMINACIÓN DE GLUCOSA POR MÉTODOS CUALITATIVOS Y CUANTITATIVOS

1. Aspectos teóricos

En estado de post-absorción la concentración de glucosa sanguínea en el hombre varía

entre 70 -110 mg/100mL. La mantención de valores estables de glucosa en la sangre es uno
de los mecanismos más finamente regulado. En esta regulación participan el hígado y varias
hormonas.

Cuando la glucosa sanguínea alcanza valores relativamente altos, el riñón también ejerce
un efecto regulador. La glucosa filtrada continuamente por los glomérulos es habitualmente
reintegrada por completo a la sangre por el sistema de resorción de los túbulos renales. La
resorción de glucosa está enlazada con el aprovisionamiento de ATP en las células
tubulares. La capacidad del sistema tubular para absorber glucosa está limitada a una tasa
aproximada de 350 mg/min. Cuando la cantidad de glucosa en la sangre sobrepasa la que
puede ser reabsorbida el exceso pasa a la orina produciéndose glucosuria.

En los individuos normales la glucosuria ocurre cuando la concentración de glucosa en la

sangre venosa es superior a 170 – 180 mg/100 mL.

[glucosa]normal en sangre 70 – 110 mg/dL ( 3,9 – 6,1 mmol/L).

[glucosa]normal en orina 1 – 15 mg/dL ( 0,06 – 0,8 mmol/L).

Método cualitativo:

Tiras colorimétricas.

La glucosa puede ensayarse cualitativamente con el uso de tiras colorimétricas. Este test
usa glucosa oxidasa que cataliza la oxidación de D-glucosa a ácido glucónico con formación
de H2O2. En presencia de loa enzima peroxidasa, el H2O2 generado oxida un cromógeno
(orto-dianicidina), produciendo un cambio de color, que indica la presencia de glucosa. Este
método es específico para la glucosa y la detecta cuando su concentración está sobre el
rango normal.

Métodos cuantitativos.

Método químico: o-toluidina.

La o-toluidina se condensa inicialmente con el grupo aldehído de la glucosa para formar una
mezcla en equilibrio de la glucosilamina y la base de Schiff correspondiente. Las reacciones
que tienen lugar después de la condensación original producen una mezcla de cromógenos
verdes con una longitud de onda analítica a 630 nm
 La reacción entre o-toluidina y glucosa es la siguiente:

MEDIO ÁCIDO

o-toluidina + glucosa Complejos Cromogénicos

T° 100 °C
(Incoloro) (verde-azulado)

2. Objetivos.

 Detectar glucosa en una muestra biológica mediante tiras colorimétricas.

 Cuantificar Glucosa por método Químico y por método enzimático.

3. Parte experimental.
3.1 Materiales

 espectrofotómetro/ celdas
 trípode/ rejilla / mechero
 baño termostatizado
 cronómetro
 15 tubos de ensayo
 2 gradillas
 Micropipetas p100/p1000
 1 pipeta graduada de 5mL
 1 pipeta graduada de 2 mL
 1 pizeta
 1 matraz de aforo de 100 mL
 1 vaso precipitado de 250 mL
 1 vaso precipitado de 500 mL
 termómetro
 micropipeta de 20 µL, puntas
 tira colorimétrica

3.2 Reactivos
 glucosa 16 mg/dL
 o-toluidina
 glucosa estándar (ensayo enzimático Trinder)
 reactivo de trabajo Trinder-100
4. Procedimiento.
4.1 Tiras colorimétricas.
 Introduzca una tira de prueba en el tubo que contiene la muestra.
 Remueva inmediatamente el exceso de muestra de la tira.
 Espere 10 minutos exactos para el desarrollo del color.
 Compare el color de la tira con la escala de colores que indica el nivel de glucosa.
 Descarte cambios de colores después del tiempo indicado.

4.2 Método de la o-toluidina

De acuerdo a la tabla 1:
 Prepare una batería de tubos rotulados.
 Agregue el volumen indicado de la solución estándar de glucosa (16 mg/dL) a los tubos
2S – 6S.
 Agregue 0,5 ml de las diferentes muestras problemas a los tubos 7MP – 9MP.
 Complete el volumen de los tubos a 0,5 mL agregando el volumen indicado de agua
destilada.
 Agregue 3,0 mL de la o-toluidina con una pipeta graduada de 5 mL. Tape los tubos con
bulbos de vidrio.
 Homogenice y lleve los tubos a un baño de ebullición por 10 minutos
 Enfríe y lea la absorbancia a 630 nm. El color es estable por 30 minutos.

TABLA 1

De acuerdo a los datos:

 Calcule la concentración de glucosa en los tubos (2S – 6S).
 Complete la tabla con los valores de absorbancia y concentración.
 Construya una gráfica absorbancia versus concentración de glucosa.
 Obtenga la ecuación de la recta por regresión lineal y el coeficiente de regresión.
 Calcule las concentraciones de las muestras problemas (tubos 7MP – 9MP) en la cubeta
mediante la ecuación 1.5.
 Calcule las concentraciones de las muestras problemas en las soluciones originales
considerando las diluciones realizadas en el ensayo (Ecuación 1.6).
4.2 Método enzimático GOD
Productos
Buscar en página web: www.valtek.cl :

 Bajar y estudiar inserto de trabajo Química

 Es su obligación llevar el inserto al
laboratorio
Parámetros

Glucosa
Preguntas

1.- Indique en que se basa el método de detección cualitaiva de Glucosa según utilización
de tiras reactivas

2.- ¿Qué ventajas presenta el método de la glucosa oxidasa con relación al de o-toluidina
en la cuantificación de glucosa en un fluido biológico?

3. Calcule el coeficiente de extinción para el método de o-toluidina considerando las

unidades de concentración: mg/mL, mg/ dL, g/L, g/100 mL, M y mM.

Nota : PM Glucosa = 180 g/mol

1 dL = 0,1 L = 100 ml
 LABORATORIO Nº4

DETECCIÓN DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA:

Introducción

La mayoría de las reacciones catalizadas por enzimas se realizan a nivel biológico en el orden
de los mili segundos (miliseg) o menos. No obstante, existen métodos que permiten seguir
la reacción catalizada por una enzima a través del tiempo a nivel experimental,
independiente de la rapidez con la que ejercen la catálisis. Lo anterior puede ser manejable
desde un punto de vista experimental por ejemplo manejando el pH (con una solución
tampón) y/o la temperatura a valores óptimos y/o no denaturantes.

Métodos de Determinación de Actividad Enzimática:

A manera general podemos decir que existen dos métodos de detección enzimática: los
Continuos y Discontinuos.
En los primeros, los denominados Continuos se caracterizan por que la enzima se coloca en
contacto directo con el sustrato y una vez que la ella cataliza la reacción, la reacción puede
seguirse en forma inmediata por medio de la aparición o desaparición de la coloración ya
sea porque se forma un producto coloreado o bien por que el sustrato que inicialmente
presenta una coloración, en la medida que se transforma en producto lo va perdiendo.
Los segundos, los discontinuos o también llamados acoplados consisten en aquellos
ensayos en donde el producto de la actividad enzimática se hace reaccionar con otra enzima
u otra sustancia y es esta es quien genera la coloración que se detecta
espectrofotométricamente.
Una realizada la reacción, ella se detiene utilizando para ello por ejemplo un reactivo que
inhibe la actividad enzimática. Luego, se cuantifica el producto espectrofotométricamente
utilizando para ellos una curva de calibración.

De esta forma, la actividad se expresa como Unidades de Actividad través del tiempo
(UA/t)

NOTA: es importante entender que cualquier ensayo enzimático esta sujeto al control del
tiempo.
1. Actividad Práctica
Detección de la actividad de la Beta Glicosidasa

Los polisacáridos tales como el almidón, la celulosa y el glicógeno, así como los de tipo
heteroplisacaridos tales como el hialuronato entre otros, se mantienen enlazados por
enlace O-Glicosídicos del extremo terminal no reductor de ciertos oligosacáridos,
disacáridos y por consiguiente liberan β-D-Glucosa. La hidrólisis de estos enlaces es
catalizada por las Glucosidasas que se diferencian en especificidad según la identidad de la
configuración anomérica del glúcido (Alfa o beta respectivamente).
Estas enzimas se encuentran ampliamente distribuidas en los sistemas vivos y de ello
depende su especificidad. A manera de ejemplo, en bacterias y hongos, ellas se encuentran
formando parte de complejos multienzimáticos denominados celulasas, las que se encargan
de la degradación de celulosa.
En nuestro caso, se determinará la actividad de la beta glicosidasa utilizando para ello un
sustrato artificial, el p- nitrofenil-β-D-glucopiranosido.
Cuando la enzima se coloca en contacto con dicho sustrato, se forma como producto el P-
Nitrofenolato que en medio alcalino genera coloración amarilla, detectable en el espectro
visible a una longitud de onda analítica cercana a 405 nm.

Enlace O-
Glicosidico

2. Objetivos.
 Determinar la actividad de una enzima utilizando como modelo experimental la
enzima de la enzima α-Glicosidasa mediante método discontinuo.

3. Actividad enzimática. Cálculos

Para obtener la velocidad de la reacción se debe
calcular la [producto]/tiempo, siendo el producto, el p-
nitrofenol (PNF).
Usando la ley de Lambert –Beer se calcula la cantidad
de PNF generado en un tiempo de reacción dado pero
ello se debe aplicar el tiempo de reacción. De esta
forma la ecuación a utilizar queda

Para efectos de cálculo, se utilizará el Coeficiente de Extinción teórico para el p-Nitrofenol

a 405 nm 18,45 (mM*cm)-1 . Por esta razón la unidad de velocidad quedará expresada en
mM/min.

4. Parte experimental.
4.1 Materiales
 baño termostatizado / termómetro
 espectrofotómetro / celdas
 Gradillas
 Micropipetas (p-100)
 1 pipeta graduada de 1 ml
 1 pipeta graduada de 2 ml
 1 Cronómetro
 1 pizeta

4.2 Reactivos
 Sustrato: p-NPGP 2mM (para Nitrofenil Glucopiranosido)
 Tampón fosfato 0,1 M, pH 3
 Carbonato de Sodio 1M
 Enzima comercial ( mantener a 4ºC)

5. Procedimiento.
1. En un tubo de ensayo adiciones 0.9 ml de sustrato (pNPG) 2 mM disuelto en tampón
fosfato 0.1M pH=3.
2. Pre incube en baño termostatizado durante 3 minutos a 40ºC.
3. Inicie la reacción adicionando 100µl de enzima comercial. Una vez adicionada la enzima
comience a control inmediatamente el tiempo.
4. Detenga la reacción después de 5 minutos adicionanado 2,0 ml de Na 2CO3 1M.
5. Lee la absorbancia debida al PNF a 405 nm y determine su concentración a al tiempo
determinado utilizando para ello el coeficiente de extinción teórico.
6. Determine la actividad catalítica de la β-Glicosidasa a los 5 minutos de reacción
7. Repita al menos tres veces el ensayo de tal forma que sea reproducible
BLANCO: para las determinaciones, no olvide que Usted debe preparar una solución blanco
de tal forma que sea útil para calibrar el espectrofotómetro. En este caso, dicha solución se
prepara:
1. Adicione 0.9 ml de sustrato en un tubo0 de ensayo
2. Adicione 2.0 ml de Na2CO3
3. Finalmente adicione 100µl de enzimas

Preguntas:
1.- ¿Si usted tiene un extracto de sacarosa , esperaría observar actividad de la Beta
glicosidasa?

2.- ¿Por qué el Bicarbonato de sodio detiene la reacción de la enzima?

3.-¿Qué esperaría usted si este ensayo se realizara a 60ºC , explique

4.- ¿Cómo se define una unidad internacional (UI) para la actividad de una enzima?
 LABORATORIO Nº5

EFECTO DEL PH Y DE LA TEMPERATURA EN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA.

1. Aspectos teóricos.
Las enzimas son proteínas que presentan actividad catalítica específica, esto es, aumentan
la velocidad de reacciones específicas. La actividad catalítica de una enzima es una
propiedad que se mide por el aumento de la velocidad de reacción en presencia de la
enzima con relación a la reacción no catalizada en un sistema químico dado.

La velocidad de las reacciones se determina de acuerdo al aumento de la concentración del

producto o la disminución de la concentración del sustrato de la reacción en el tiempo.

𝑽 = − 𝒅[𝑺]⁄𝒅𝒕 = + 𝒅[𝑷]⁄𝒅𝒕 Ecuación 5.1

Existen diferentes métodos que permiten cuantificar la concentración de reactantes y/o

productos. Entre los métodos analíticos físicos destacan los ópticos, que se basan en la
absorción de radiación electromagnética en la región visible y ultravioleta. Determinando el
coeficiente de extinción de un compuesto se estima la velocidad sobre la base de las medidas
experimentales de absorbancia a un tiempo dado.

Hay diferentes factores que afectan la actividad de las enzimas. Los factores más importantes
son: concentración de enzima, concentración de ligandos (sustratos, productos, inhibidores y
activadores), pH, fuerza iónica y temperatura.

La actividad de las enzimas se ve notablemente afectada por el pH del medio. En general, son
sólo activas en un rango limitado de éste, observándose en la mayoría de los casos una zona
de pH óptimo y una disminución de la actividad a ambos lados del pH “óptimo”. El efecto del
pH en la actividad enzimática se debe fundamentalmente a cambios en el estado de ionización
de los componentes del sistema; esto puede darse en la enzima libre, en el complejo E-S o en
el sustrato. En la zona de pH óptimo predomina la forma iónica activa, a valores de pH menores
y mayores su proporción disminuye, aumentando la proporción de formas iónicas no activas;
a causa de ello la curva de velocidad versus pH tiene aproximadamente la forma de una
campana. El pH no sólo afecta la actividad de las enzimas, sino que también la estabilidad, lo
que contribuye a la disminución de la actividad generalmente a valores extremos de pH.

Las reacciones enzimáticas están fuertemente afectadas por la temperatura. Hay dos factores
determinantes, el efecto de la temperatura en las constantes de velocidad de la reacción y el
efecto de la temperatura en la estabilidad de la enzima. Como es de esperar, un aumento de
la temperatura aumenta la velocidad de la reacción; sin embargo, sobre cierta temperatura
hay inactivación de la enzima que lleva a una disminución en la velocidad. La zona de
temperatura en la cual se observa mayor actividad se conoce como “temperatura óptima”,
ésta tiene sólo valor operativo, ya que depende de una serie de factores, como el pH y el
tiempo de reacción.
En este práctico se verá el efecto que produce en la actividad de la enzima -
glucosidasa de almendra dulce los cambios de pH y temperatura. Se determinará la
velocidad de la hidrólisis de un sustrato artificial, el p-nitrofenil--D-glucopiranósido
(pNPG), midiendo la formación de un producto de la reacción, el p-nitrofenolato, que en un
medio alcalino es de color amarillo y presenta un máximo de absorción alrededor de 405
nm.

𝑨− 𝑪𝒐 𝟏 𝑽
𝑽= × × × 𝒇𝒅 𝒇𝒆 Ecuación 5.2
𝜺×𝒍 𝒕 𝒗

A = Absorbancia
C o = absorbancia del ensayo control
𝜀 × 𝑙 = pendiente curva de
calibrado t = tiempo (minutos)
V = volumen de ensayo (ml)
v = volumen de enzima (ml)
fd = factor dilución en el ensayo enzimático (en ensayos discontinuos)
fe = factor de dilución de la enzima previo al ensayo enzimático.

Una unidad internacional (UI) de enzima se define como la cantidad que cataliza la
formación de 1 mol de producto por minuto en condiciones definidas de ensayo.

2. Objetivos.

Estudiar el efecto del pH y de la temperatura en la velocidad de la hidrólisis del p-

nitrofenil--D-glucopiranósido catalizada por la -glucosidasa de almendras. Establecer
condiciones adecuadas de ensayo.

3. Parte experimental.
3.1 Materiales
 espectrofotómetro / celdas
 1 cronómetro
 1 trípode / rejilla/ mechero
 1 termómetro
 1 baño termostatizado
 1 vaso precipitado de 500 ml
 1 vaso precipitado de 250 ml
 2 gradillas
 20 tubos de ensayo
 1 pizeta
 1 pipeta graduada de 1 ml
 1 pipeta graduada de 2 ml
  1 pipeta graduada de 5 ml
 plato poroso.
3.2 Reactivos
 p-nitrofenolato 0,2 mM.
 tampón acetato 50 mM, pH 4,0; 5,0 y 6,0.
 tampón fosfato 50 mM, pH 7,0.
 p-nitrofenil--D-glucopiranósido 2 mM / tampón.
 -glucosidasa de almendras (baño agua / hielo).
 Na2CO3 1.0 M.

4. Procedimiento.

4.1 Obtención del coeficiente de extinción milimolar del p-nitrofenolato (pNF).

De acuerdo a la tabla 1.1:
 Prepare una batería de tubos rotulados.
 Agregue el volumen indicado de la solución de p-nitrofenol (0,2 mM) a los tubos 2S
 7S.
 Complete el volumen a 1,0 ml a cada tubo (1B, 2S  7S) agregando tampón
acetato pH 5,0.
 Agregue a cada tubo 2,0 ml de Na2CO3 1,0 M. Homogenice la solución.
 Mida la absorbancia de los tubos 2S  7S ocupando el blanco (1B) para calibrar el
equipo y anótela en la tabla.
 Calcule y anote en la tabla la concentración del pNF en el volumen final de 3,0 ml.

TABLA 1.1
TUBO pNF Tampón Na2CO3 pNF A405nm
(ml) (ml) (ml) (mM)
1B ------ 1,0 2,0
2S 0,1 0,9 2,0
3S 0,2 0,8 2,0
4S 0,3 0,7 2,0
5S 0,4 0,6 2,0
6S 0,5 0,5 2,0
7S 0,4 0,6 2,0

De acuerdo a los datos.

 Construya el gráfico absorbancia versus [pNF].
 Determine la ecuación de la recta por regresión lineal y el coeficiente de regresión.
 Calcule el coeficiente de extinción milimolar.

 Obtención de la velocidad de la reacción catalizada por la -glucosidasa (Método
discontinuo).
 Preincube 0,9 ml del sustrato (pNPG) 2,0 mM al pH dado durante 3 minutos a la
temperatura indicada.
 Inicie la reacción mediante la adición de 0,1 ml de la enzima, inmediatamente,
homogenice la solución y colóquela en el baño de agua termostatizado a la
temperatura correspondiente. Al mismo momento inicie el cronómetro.
 Detenga la reacción a los 5,0 minutos con 2,0 ml de Na2CO3 1,0 M.
 Cuantifique el p-nitrofenolato, producto de la reacción, por absorbancia a 405 nm.
 Calcule la velocidad de la reacción de acuerdo a la ecuación 5.2.

Blanco.
 Prepare el blanco (control tiempo 0 o tubo tiempo 0, t0) con todos los
componentes del ensayo mezclados en tal forma que no haya reacción.
4.1.15.1 Preincube 0,9 ml del sustrato al pH dado durante 3 minutos a la temperatura
indicada.
4.1.15.2 Inmediatamente, detenga la posible reacción no enzimática agregando 2,0
ml de Na2CO3
4.1.15.3 Agregue 0,1 ml de la enzima.

Control.

 Prepare el control incubando a la temperatura definida todos los componentes del

ensayo, menos la enzima, de modo que no haya reacción enzimática.
 Incube 0,9 ml de pNPG durante 8 minutos (3,0 min de preincubación y 5,0 min de
ensayo),
 Inmediatamente, detenga la posible reacción no enzimática agregando 2,0 ml de
Na2CO3,
 Agregue 0,1 ml de la enzima.

Ocupe el blanco para calibrar el espectrofotómetro y el control para detectar una reacción
no enzimática, reste esta lectura a la del ensayo enzimático correspondiente (Ecuación 5.2).

4.2 Efecto de la temperatura en la velocidad de la reacción enzimática.
Para estudiar el efecto de la temperatura en la actividad de la -glucosidasa, se trabajará a
cuatro temperaturas, a un pH dado (pH 5,0), a concentraciones de sustrato y de enzima
constantes.

TABLA 1.2

4.3 Efecto del pH en la velocidad de la reacción enzimática.

Para estudiar el efecto del pH en la actividad de la -glucosidasa, se trabajará a cuatro
valores de pH, a temperatura (40ºC), concentración de sustrato y de enzima constantes.

De acuerdo a la tabla 1.3:

 Prepare una batería de tubos rotulados (1R pH  4R pH) para los ensayos
TABLA 1.3

 Repita la operación a los restantes pH.

 Prepare el blanco correspondiente a cada valor de pH (1B pH  4B pH).
 Prepare los controles a cada valor de pH (1C pH  4C pH).
 Lea a 405 nm la absorbancia de los ensayos enzimáticos y de sus respectivos
controles ocupando el blanco para calibrar el espectrofotómetro.
 Calcule la velocidad de las reacciones de acuerdo a los resultados y a la ecuación
5.1.

5. BIBLIOGRAFÍA
 Jürgen Bergmeyer and Marienne Gral, 1984.
Methods of Enzymatic Analysis, Third Edition, Verlag Chemie.
 Apuntes de Preaboratorio.
 LABORATORIO Nº6

CADENA DE TRANSPORTE DE ELECTRONES EN CLOROPLASTOS Y LEVADURAS

Introducción

Los organismos vivos producen energía para el mantenimiento metabólico de todas las
funciones celulares. En el caso de los de células animales, la producción de energía en
forma de ATP se produce mediante cadena transportadora de electrones (CTE) y
fosforilación oxidativa, mientras que en sistemas vegetales, las plantas superiores
presentan cloroplastos donde ocurre la fotofosforilación para síntesis de ATP y síntesis
de carbohidratos a partir de la fijación del CO2.

Un modelo de estudio para evaluar la CTE de manera activa es la levadura. A nivel de la

membrana plasmática, las levaduras tienen una ATPasa de H+ que acopla la hidrólisis del
ATP con el bombeo de protones hacia afuera de la célula. Como resultado de la
actividad de la ATPasa de H+ en la levadura, se genera un gradiente electroquímico de
protones que se utiliza para impulsar el transporte de nutrientes al interior de la célula,
proceso catalizado por sistemas de transporte llamados simportadores o uniportadores.
Para darse una idea de la importancia de esta enzima en la economía celular y en la
energización de la membrana celular, basta decir que la ATPasa de H+ consume hasta un
25 % del ATP que se sintetiza en la célula.

Además de esta ATPasa de H+ de la membrana plasmática, las levaduras tienen otra

bomba de protones en la membrana interna de las mitocondrias, la ATP sintasa, que se
encarga de la síntesis del ATP. En contraste con la enzima de membrana plasmática, el
flujo de protones a través de la ATP sintasa induce la síntesis de ATP. Así, se puede
proponer uno de los muchos ciclos en los que interviene el ATP en la levadura: por un
lado, el ATP se sintetiza en la mitocondria por medio de la ATP sintasa, y a nivel de la
membrana plasmática, la ATPasa de H+ lo hidroliza para bombear protones al exterior
de la célula. El factor común en ambos casos es un flujo de protones a través de la
membrana.
Una manera de estudiar este proceso es incubar levaduras en un medio carente de
nutrientes. Bajo esta condición la levadura necesitará energía para llevar a cabo sus
procesos metabólicos, y por lo tanto requerirá de ATP para ello. Ahí es cuando se agrega
glucosa, nutriente escencial para la fermentación alcohólica que realizan este tipo de
células para sintetizar ATP. De esta forma, al activar la síntesis de ATP, se activará la
ATPasa y liberando H+ al espacio extracelular observándose cambios en el pH
extracelular como se observa en la figura 1.

- 38 -
 ATPasa

ATP
sintasa

Figura 1. Bombas de protones en levaduras. Se observa la ATPasa a nivel de

membrana plasmática y la ATP sintasa a nivel de membrana interna mitocondrial.

Por otra parte, las células vegetales tiene vías alternativas para la síntesis de ATP,
mediante la utilización de la luz en los cloroplastos. El modelo que describe este proceso
se conoce como esquema Z, y se resume en la Figura 2.

Figura 2. Esquema Z de la fase fotoquímica de la fotosíntesis. Se observa el flujo

de electrones cíclico y no cíclico.

- 39 -
De acuerdo a este modelo, la luz proporciona la energía necesaria para que los
electrones de la clorofila a 680 del fotosistema II sean transportados a través de una
serie de acarreadores (Q, plastoquinona, citocromo b, plastocianina y citocromo f) hasta
la clorofila a 700 del fotosistema I, quien a su vez, al ser excitado por la luz, ocasiona un
nuevo transporte de los electrones hasta el NADP+ para formar NADPH + H+. Como
sabemos, los electrones perdidos por la clorofila del fotosistema II son recuperados
mediante la ruptura del agua (fotólisis). En resumen, durante la fase fotoquímica de la
fotosíntesis se produce un transporte de electrones desde la molécula de agua hasta el
NADP+, siendo la luz quien proporciona la energía necesaria para llevar a cabo este
proceso.

Ahora bien, ¿Cómo podemos detectar este transporte de electrones? Durante el

transporte de electrones éstos son donados y recibidos por substancias naturales
encargadas de hacerlo. Ahora, si nosotros introducimos artificialmente una sustancia
que recibe electrones y que al hacerlo, cambie de color, podemos detectar este
transporte. Así, con sustancias como el azul de Metileno o el DCPIP
(Diclorofenolindolfenol), se puede estudiar el transporte de electrones y la importancia
de la luz en la fotosíntesis. Pero, ¿qué tiene que ver lo anterior con algunos herbicidas?
Pues, como se podrá comprender la presencia de substancias que interrumpan el
transporte de electrones impedirán (dependiendo del caso): la formación de ATP, la
formación de NADPH + H+, la ruptura de la molécula de agua, etc., ocasionando
trastornos que llevarán a la planta, tarde o temprano, a la muerte. De esta manera se
han diseñado substancias que al regarse sobre la planta, interrumpen el flujo de
electrones en cualquiera de las siguientes formas.

1. Inhibidores del transporte de electrones. En este caso el compuesto actúa mediante

la inactivación de uno o más acarreadores de electrones.
2. Agentes que impiden la formación de ATP. Dentro de este grupo los compuestos
pueden actuar; separando el transporte de electrones de la fotofosforilación (es
decir, continúa el transporte de electrones pero no se forma ATP y la energía se
desperdicia en forma de calor) impidiendo directamente la formación de ATP, o un
tercer caso, haciendo ambas cosas a la vez.
3. Aceptores de electrones. Estos compuestos compiten con algunos compuestos de la
cadena transportadora de electrones y los reciben en su lugar, por lo que se
reducen.

2. Objetivos

 Evaluar la cadena transportadora de electrones en mitocondria de levaduras a

través de cambios en el pH.
 Evaluar la cadena transportadora de electrones en cloroplastos de espinaca en
presencia de fenantrolina y el la importancia de la luz en el flujo de electrones.

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3. Procedimiento:

Parte 1: CTE en mitocondrias de levaduras.

1. Rotule 3 matraces Erlenmeyer con los siguientes nombres: control, DNP y azida.

2. Para la reacción control:

a. 5 mL de levadura (200 mg/mL) + 40 mL agua destilada.
b. Medir el pH 3 veces en con intervalos de 3 minutos (pH basal)
c. Adicionar 5 mL glucosa 10%, agitar y medir pH (tiempo 0)
d. Determinar el pH cada 5 minutos 4 veces, y luego cada 10 minutos 2 veces más.

3. Para la reacción DNP:

a. 5 mL de levadura (200 mg/mL) + 40 mL agua destilada.
b. Añadir por decantación (sin agitar) 0.2 mL de DPN 40 mM. Medir el pH 3 veces
en con intervalos de 3 minutos (pH basal)
c. Esperar 5 minutos y repetir paso 3 y 4 del control.

4. Para la reacción azida:

a. 5 mL de levadura (200 mg/mL) + 40 mL agua destilada.
b. Añadir por decantación (sin agitar) 0.2 mL de Azida 400 mM. Medir el pH 3 veces
con intervalos de 3 minutos (pH basal)
c. Esperar 5 minutos y repetir paso 3 y 4 del control.

5. Registre los datos en la siguiente tabla:

pH
Tiempo (min)
Glucosa DNP Azida
0
5
10
15
20
30
40

6. Registrar los datos en la tabla

7. Hacer una gráfica de cada experimento pH v/s tiempo
8. Analizar el significado de los cambios de pH en cuanto a la CTE y la sintesis de ATP,
en presencia del DNP y la azida respecto del control con glucosa

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 Parte 2: CTE en cloroplastos de espinacas

1. Aislamiento de los Cloroplastos.

a. Muela en un mortero 5 g de hojas con 30 mL de sacarosa 0.5 M.
b. Filtre con la gasa para quitar los restos más grandes.
c. Centrifugue la solución a 2500 rpm durante 10 minutos y deseche el
sobrenadante (los cloroplastos están en el fondo).
d. Resuspenda el precipitado o residuo con los cloroplastos con 10 mL de buffer
fosfato frío.
e. Coloque los tubos con los cloroplastos en hielo hasta que los use en el siguiente
paso.

2. Efecto del DCPIP y fenantrolina en el transporte de electrones

Rotule los tubos como se indica en siguiente tabla:

Cantidad de reactivo para conformar la mezcla de reacción (mL)

Reactivo
Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3
Cloroplastos aislados 2 2 2
DCPIP 3 3 3
Fenantrolina 0 0 3
Buffer fosfato 5 5 2
Volumen total 10 10 10

a. Cubra el tubo 1 con papel aluminio para evitar que la luz incida en el, de tal
manera que no se realice transporte de electrones. Los tubos 2 y 3 déjelos
expuestos a la luz.
b. Coloque los 3 tubos en un vaso precipitado con agua suficiente para cubrirlos y
acerque todo a la lámpara encendida.
c. Espere 15-20 minutos y compare las coloraciones de los tubos.
d. Describa y compare sus resultados.

4. Bibliografía

 Peña A. Studies on the mechanism of K+ transport in yeast. Arch Biochem Biophys.

1975; 167:397-409.
 Machlis, C. y Torrey, G.J. 1956. Plants in Action. Freeman, San Francisco. Truelove,
B. (Ed.) 1977. Research Methods in Weed Science. Southern Weed Science Society,
Auburn University, Auburn, Alabama.
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