BIOLOGÍA MOLECULAR EN EL LABORATORIO

GUÍA DIDÁCTICA
Modalidad del curso: Online.

A continuación, se detallarán los pasos a seguir para la realización de este curso:

 Una vez finalizada la lectura del curso, se contestarán a las preguntas tipo test
en la plantilla de Word suministrada.
 Debe superar con igual o superior la nota de 70%, de no ser así volverá a repetir
el examen y deberá enviarlo de nuevo.
 Durante la realización del curso siempre podrá resolver dudas tanto por e-mail
que aparece al final de cada página o llamando al teléfono que aparece en el
pie de página.

Horas lectivas:
 Este curso consta de 125 horas de formación online.
 Tiene un máximo de 1 año para realizarlo.
 Un mes después de su realización, recibirá un email con el diploma acreditando
que ha superado con éxito dicho curso.

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UNIDAD 1: HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS.
1. Concepto.
2. Bases teóricas de la hibridación.
3. Hibridación.
4. Sondas de ADN.
5. sondas de ARN.
6. Marcadores y sus tipos.
7. Métodos de marcaje.
8. Fases de hibridación.
UNIDAD 2: TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN.
1. Soporte en medio sólido.
2. En medio líquido.
3. In situ.
4. Dot Blot.
5. Southern blot.
6. Nother blot.
7. Microrrays.
8. Técnica captura de hibrido.
UNIDAD 3: LAS TÉCNICAS DE PCR.
1. Definición de la PCR.
2. Proceso de la PCR y sus fases.
3. Aplicaciones de la PCR.
4. Ventajas y desventajas.

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UNIDAD 1: HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS.

1. CONCEPTO.
La hibridación de ácidos nucleicos consiste en la unión de dos moléculas
monocatenarias de ácidos nucleicos, por la complementariedad de su secuencia de
bases nitrogenadas, originando una molécula hibrida bicatenaria.
La hibridación es un proceso de construcción artificial de ácidos nucleicos bicatenarios,
pueden ser dos cadenas de ADN, dos cadenas de ARN o una cadena de ADN y otra de
ARN.
Las técnicas de hibridación permiten detectar secuencias concretas de ácidos
nucleicos.
Dentro de esto hablaremos de dos conceptos:
 Secuencia diana: es la secuencia concreta de bases nitrogenadas que se
pretende detectar en la muestra problema.
 La sonda: es la cadena de nucleótidos cuya secuencia de bases nitrogenadas es
complementaria a la secuencia diana.
Tras un proceso de hibridación adecuado se formara una estructura bicatenaria
híbrida, constituida por la sonda y la secuencia diana, que podrá ser detectada gracias
al marcaje que se ha incorporado a la sonda.
Hay diferentes tipos de técnicas de hibridación que destaca por:
 El tipo de ácido nucleico que se pretende detectar.
 El tipo de sonda que se va a utilizar.
 El tipo de marcaje de la sonda.
 El medio o soporte (sólido, líquido o in situ) en que se realiza la hibridación.

2. BASES TEÓRICAS DE LA HIBRIDACIÓN.

Se basa en dos fenómenos:
 Desnaturalización.
 Renaturalización.

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 Desnaturalización.
Propiedad del ADN consistente en la
separación de las dos cadenas de una
molécula bicatenaria por ruptura de los
puentes de hidrógeno entre las bases
nitrogenadas complementarias.

La desnaturalización se consigue aumentando la temperatura o aumentando el pH (pH

alcalino).
Aumentando la temperatura para producir la desnaturalizar el ADN obtenemos una
curva que se denomina curva de fusión.
La curva de fusión del ADN se divide en 3 zonas:
– Zona 1: Es un tramo recto, sin
pendiente, a esta temperatura el
100% de la molécula de ADN es
bicatenaria puesto que no se produce
temperatura suficiente para que se
separen.

– Zona 2: Vemos una pendiente debido a que a medida que vamos

aumentando la temperatura, se va separando cada vez más la molécula de
ADN, en esta zona aparece el 100% de la molécula desnaturalizada.
– Zona 3: vemos de nuevo una recta sin pendiente puesto que por mucho
que aumentemos la temperatura ya se encuentra desnaturalizada en la
molécula al completo.

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 Hay que tener en cuenta también la
temperatura de fusión.
La temperatura de fusión (Tm) de una
molécula bicatenaria de ADN es la
temperatura a la cual la
desnaturalización es del 50%

El factor que más influye en la Tm es la proporción de pares GC (Guanina-citosina).

En consecuencia, cuanto mayor sea la proporción de pares GC en una molécula, mayor
será el número de puentes de hidrogeno que hay que romper para desnaturalizarla y
por tanto mayor energía en forma de calor habrá que suministrar para separar las dos
cadenas. A mayor porcentaje de GC, mayor Tm es decir necesitamos más temperatura.
Renaturalizacion
La renaturalización es el proceso por el cual las dos cadenas de una molécula de ADN
completamente separadas mediante desnaturalización térmica vuelven a reasociarse
al bajar la temperatura, hasta formar la doble hélice original.
En una solución que contiene ADN totalmente desnaturalizado, para que dos cadenas
complementarias se reasocien tiene que producirse un choque aleatorio entre ambas.
Cuanto mayor sea la concentración de ADN mayor probabilidad de que las dos cadenas
complementarias se encuentren y por lo tanto mayor velocidad de renaturalización.
Una vez que las dos cadenas complementarias se encuentran, la reasociación se
produce en dos fases:
1. Fase de nucleación: es una fase lenta en la que secuencias cortas de bases
complementarias se aparean por formación de puentes de hidrógeno.
2. Fase de “cierre en cremallera”: es una fase rápida en la que se produce el cierre
de las secuencias vecinas originando la doble hélice.
A diferencia de la desnaturalización, el único factor del que depende la velocidad de
renaturalización es de la “complejidad del genoma”.
Definimos complejidad del genoma como la suma total de la longitud en pares de
bases de todas las secuencias diferentes presentes en el genoma:

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 – En organismos procariotas es decir bacterias, que prácticamente no tienen
secuencias repetidas, se asume que la complejidad de su genoma coincide con su
tamaño en pares de bases.
– En organismos eucariotas, en cambio, contienen secuencias únicas y secuencias
altamente repetidas. Para calcular la complejidad de estos genomas se suma una
vez la longitud de cada secuencia repetida más la longitud de las secuencias
únicas.

3. HIBRIDACIÓN.
El hibrido sonda/secuencia diana tiene las mismas propiedades que una molécula
bicatenaria de ADN en cuanto a desnaturalización y renaturalización.
Las sondas usadas reconocen regiones de ADN o ARN de secuencia única y sigue un
proceso de hibridación similar a la renaturalización.
Factores que influyen en la hibridación
Son todos aquellos factores que pueden modificar la Tm de un híbrido. Estos son:
– La fuerza iónica: Cuanto mayor es la concentración de iones positivos en el
medio más energía hay que aportar en forma de calor al medio para
desnaturalizar al híbrido (aumenta la Tm).
– Agentes desnaturalizantes: Algunos agentes químicos desestabilizan los puentes
de hidrogeno entre bases complementarias, facilitando su ruptura, por lo tanto si
se añaden compuestos la Tm disminuye.

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 – Porcentaje de bases no complementarias: una sonda puede unirse a secuencias
parecidas a la diana que tengan algunas bases distintas. A mayor número de
mismatch (bases no complementarias) menor Tm.
Tipos de sondas en la hibridación.
Las sondas pueden ser bicatenarias o monocatenarias y su tamaño puede oscilar entre
el de pequeños oligonucleótidos y grandes moléculas de miles de nucleótidos.
Características de las sondas:
• La especificidad de una sonda es la capacidad que tiene dicha sonda para
discriminar la secuencia diana con la que tiene que hibridar. En general se
considera que el tamaño mínimo de la secuencia de una sonda para que sea
específica es de 16 pb.
• La sensibilidad es la probabilidad de detectar cantidades mínimas del hibrido
sonda-diana. Está relacionado con el número de moléculas marcadoras que
admite la sonda.
Según su naturaleza pueden ser: Sondas de ADN, sondas de ARN o sintéticas.

4. SONDAS DE ADN
Son las más utilizadas porque son fáciles de obtener en grandes cantidades y
presentan versatilidad en cuanto a marcajes. Según el proceso de obtención pueden
ser:
• De síntesis química.
• De ADN recombinante.
• De PCR.
Sondas de ADN del tipo síntesis química.
Se obtienen de manera automatizada por condensación química añadiendo nucleótido
a nucleótido. Son cadenas monocatenarias. Solo se pueden sintetizar cadenas
pequeñas siendo lo habitual entre 40 y 50 nucleótidos.
 Ventajas: Al ser monocatenarias no requieren desnaturalización por calor. Y su
tamaño reducido permite que penetre en los tejidos.
 Inconvenientes: baja sensibilidad debido a su reducido tamaño.

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Sondas de ADN recombinante.
Estas sondas se caracterizan por: Ser bicatenarias. Lo que requiere de
desnaturalización como paso previo a la hibridación con la secuencia diana. Tener un
gran tamaño. Esto admite gran cantidad de moléculas marcadoras, por lo tanto mayor
especificidad y mayor sensibilidad.
Se obtienen de la siguiente manera:
1. El fragmento de ADN que queremos utilizar como sonda se introduce en un
plásmido bacteriano.
2. El Plásmido “recombinante” se introduce en una bacteria y se cultiva en el
medio adecuado.
3. Posteriormente se extrae el plásmido amplificado y se emplea entero como
sonda o se corta el fragmento de interés con enzimas de restricción.
Sondas de ADN de PCR
La obtención de sondas de ADN mediante PCR consiste en amplificar el fragmento que
nos interesa como sonda mediante la reacción en cadena de la polimerasa. Este
método implica conocer las secuencias que ocupan los extremos del fragmento que
querernos amplificar. Se caracterizan por:
 Ser bicatenarias.
 Tener un tamaño intermedio.

5. SONDAS DE ARN.
Son fragmentos pequeños de ARN utilizados como sondas capaces de hibridar con
ADN.
 Suelen tener un tamaño intermedio (cientos de bases).
 También se llaman ribosondas.
 Son siempre monocatenarios.
 Tienen como principal inconveniente que son muy sensibles a cualquier
contaminación dada la omnipresencia de ARNasas.
Las sondas empleadas en técnicas de hibridación deben estar marcadas para poder
detectar el hibrido formado con la secuencia diana.

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El marcaje es el procedimiento de marcar la sonda utilizada en las técnicas de
hibridación con la finalidad de poder visualizar los resultados.

6. MARCADORES Y SUS TIPOS.

El tipo de marcador utilizado condiciona el método de detección del hibrido. Podemos
clasificar los marcadores según que permitan o no la detección directa del hibrido.
Así tenemos:
• Marcadores que posibilitan la detección directa del hibrido.
– Isótopos radiactivos.
– Fluorocromos.
• Marcadores que requieren métodos indirectos de revelado en varios pasos.
– Haptenos.
Isótopos radiactivos
Los isotopos radiactivos son elementos químicos con capacidad de emitir radiaciones.
Los más utilizados son el fósforo-32 y el tritio.
El marcaje en la sonda se produce introduciendo nucleótidos radiactivos que contienen
alguno de estos isotopos. Con el marcaje radiactivo se consigue gran sensibilidad pero
requiere instalaciones adecuadas y personal entrenado. Posteriormente podemos
detectar el marcaje radiactivo con una película de rayos X.
Fluorocromos.
Son compuestos químicos que emiten luz al ser
excitados con luz ultravioleta. Los más conocidos
pertenecen a la familia de las Cianinas.
El empleo con varias sondas marcadas con diferentes
fluorocromos permiten detectar simultáneamente
varias secuencias diana. La detección del marcaje en
este caso se lleva a cabo mediante un microscopio de
fluorescencia.
Haptenos
Los haptenos son moléculas de pequeño tamaño, se parecen mucho a los
fluorocromos ya que no alteran la especificidad de la sonda.

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 A diferencia de los
anteriores no se pueden
detectar directamente, por
lo que requiere pasos de
revelado intermedio
utilizando métodos
inmunológicos.
El principal problema de estas sondas es que su sensibilidad es menor que el de las
sondas radiactivas, muchas veces requieren métodos de amplificación.

7. MÉTODOS DE MARCAJE.
Destacan:
• Desplazamiento de mella.
• Cebado al azar.
• Marcaje terminal.
• Marcaje por PCR.
Desplazamiento en mella
Se utiliza para marcar sondas de ADN bicatenario. Se procede incubando el trozo de
ADN (sonda).
Con los siguientes elementos:
• ADNasa
• ADN polimerasa
• Mezclas de dNTPs unidos a un isótopo radiactivo
Se incuban a 15º C donde tienen lugar los siguientes procesos:
Procesos durante la incubación
1. La ADNasa rompe los enlaces nucleotídicos entre dos nucleótidos
consecutivos al azar en ambas cadenas de la sonda, produciendo “mellas”.
2. La ADN polimerasa intenta reparar gracias a su actividad exonucleasa
incorporando los nucleótidos del medio.
3. Estos nucleótidos al estar marcados van creando la sonda (ADN) unida a
moléculas que posteriormente son detectables.

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 Cebado al azar
En este caso, la sonda se incuba con:
• Una mezcla de todos los oligonucleótidos posibles de 6 bases.
• ADN polimerasa que carece de actividad exonucleasa.
• dNTPs marcados.
La reacción de marcaje se produce en varias fases:
1. Desnaturalización de la sonda.
2. Unión de los oligonucleótidos a las cadenas de la sonda al azar. La presencia
de todas las combinaciones garantizan la unión al azar de estos oligos por
complementariedad en múltiples zonas de las cadenas de la sonda.
3. Los oligonucleótidos unidos a la sonda actúan como cebadores para que la
polimerasa sintetice cadenas de ADN complementarias a la cadena que actual
como molde incorporando los dNTPs marcados.

Marcaje terminal
En el marcaje terminal se emplea una enzima desoxinucleotidil transferasa terminal
(TdT) que es una polimerasa capaz de incorporar nucleótidos a los extremos 3´libres
de la cadenas bicatenarias de la sonda.
Se produce la incubación con la sonda, la TdT y dNTPs marcados que pasaran a
formar parte de la cola de las cadenas de ADN.
Marcaje por PCR
El marcaje de sondas por PCR se realiza mediante una PCR normal en el que los
dNTPs que utilizan para que trabajen la polimerasas están marcados
radiactivamente. La cadena de nueva síntesis estará marcada radiactivamente.

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 Purificación de la sonda
Una vez marcada la sonda, conviene eliminar el exceso de nucleótidos no
incorporados presentes en el medio de reacción. La purificación de la sonda
consiste en la eliminación de los nucleótidos libres marcados para evitar ruido de
fondo o interferencias en los resultados de las técnicas de hibridación. Los dos
métodos más usados para la purificación de las sondas son la cromatografía de
exclusión por tamaño y la cromatografía de adsorción.

8. FASES DE HIBRIDACIÓN.
Todas las técnicas de hibridación se pueden dividir en cuatro fases genéricas:
1. Preparación de la muestra y soporte (prehibridación).
2. Hibridación.
3. Lavado post-hibridación.
4. Detección del hibrido.
1. Fase de pre-hibridación.
Es la fase de preparación de la muestra y soporte.
Según la técnica se puede desarrollar en múltiples
pasos.

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2. Fase de hibridación.
En esta fase se produce la formación del hibrido sonda/secuencia diana, y es
importante tener en cuenta:
• La temperatura optima de hibridación: esta temperatura es estándar,
normalmente 37 °C, 43 °C o 65 °C.
• Normalmente suele acompañarse la solución con citrato de sodio concentrado,
el cual aporta a esta fase una alta concentración de cationes monovalentes.
• Durante esta fase también se forman algunos híbridos imperfectos, resultantes
de la unión de la sonda a secuencias parecidas a la diana (mismatch < 15%).
3. Lavado Post-hibridación.
Esta es una fase crítica donde el objetivo es mantener los híbridos sonda/secuencia
diana y eliminar los híbridos imperfectos con secuencias parecidas a la diana.
Se realiza sometiendo a lavados bajo determinadas temperaturas, fuerzas iónicas y
agentes desnaturalizantes.
4. Detección del hibrido.
La última fase consiste en detectar los híbridos
específicos gracias al marcaje de la sonda.
Dependiendo de cuál sea el marcador utilizado,
variará el método de detección.

Marcaje radiactivo
Normalmente se emplea en técnicas de hibridación sobre soporte. La detección se
realiza mediante autorradiografía. Se coloca una placa de rayos X sobre el soporte para
que la emisión radiactiva del marcador la impresione. Tras el revelado de la placa, la
positividad de la hibridación se observa como marcas oscuras.
Fluorocromos
Normalmente se emplean en técnicas de hibridación in situ. Finalizada la técnica, las
preparaciones se llevan al microscopio de fluorescencia donde, al ser excitadas con

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una longitud de onda adecuada se produce la correspondiente emisión fluorescente
del marcador que permite la visualización.
Haptenos
Se usan en todo tipo de técnicas. La detección se realiza con el uso de anticuerpos
marcados. Se utiliza un anticuerpo antihapteno marcado con un fluorocromo, con lo
que su posterior visualización es con un microscopio de fluorescencia. En algunas
ocasiones se utiliza una enzima capaz de degradar el hapteno marcado a la sonda, el
producto es un producto coloreado que puede ser detectado.

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UNIDAD 2: TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN.

1. SOPORTE EN MEDIO SOLIDO.

Las técnicas de hibridación de soporte
sólido se caracterizan porque una de
las dos moléculas implicadas, la
secuencia o la sonda se inmoviliza
sobre un soporte solido previo a la
hibridación.
Lo habitual es fijar al soporte la
muestra que contiene la secuencia
diana e incubar posteriormente con la
sonda marcada para formar el
hibrido.
En esta metodología se basa las técnicas de Dot blot, Southern blot y Northem blot.

2. SOPORTE EN MEDIO LÍQUIDO.

En las técnicas de hibridación en medio
líquido, el hibrido sonda/secuencia diana
se forma en una disolución,
normalmente pocillos de una placa
microtiter, y posteriormente se fija a la
pared del pocillo para proceder a su
detección.
Una de las características de estas técnicas es que no se marca ni la sonda ni la
muestra. El híbrido se detecta por métodos indirectos más o menos complejos. Estas
técnicas se han especializados en la detección fundamentalmente de virus. Las más
importantes son la técnica de captura de hibrido y la técnica de ADN ramificado.

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3. IN SITU.
Las técnicas de hibridación in situ (ISH en inglés) permiten detectar y localizar
secuencias de ácidos nucleicos sobre cromosomas metafásicos, células y tejidos.
Las técnicas de hibridación in situ son las técnicas en las que la hibridación de los
ácidos nucleicos se realiza directamente sobre extensiones citológicas o secreciones de
tejido y el resultado se analiza microscópicamente.
Dependiendo del marcador empleado se diferencian dos tipos de ISH:

Hibridación in situ fluorescente

(FISH) las sondas se marcan con
fluorocromos por lo que se
requiere de un microscopio de
fluorescencia.

Hibridación in situ cromogénica

(CISH): Las sondas se marcan
con haptenos. Los híbridos se
detectan por anticuerpos
unidos a una sustancia
coloreada que se visualiza con
un microscopio normal.

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4. DOT BLOT.
Es una técnica de hibridación simple que utiliza membranas de nitrocelulosa como
soporte sólido y que permite detectar secuencias de ADN o ARN en una mezcla
compleja. Es la forma más simple de hibridación. Sobre la membrana se coloca una
gota de la muestra por ejemplo ADN purificado.
La técnica se lleva a cabo incubando secuencialmente la membrana con los reactivos
de inmersión en cubetas. Formado por los siguientes pasos:
1. Aplicación de la muestra al soporte Primero se desnaturaliza el ADN.
Posteriormente se carga cada una en un determinado pocillo y se le
aplica vacío por lo que el ADN queda retenido en la membrana mientras
que todos los reactivos desembocan en la cámara recolectora.
Terminado el proceso se desmonta el sistema de vacío y se lava la
membrana.
2. Prehibridación
Las membranas se incuban con una solución que va a servir para
bloquear las posibles uniones inespecíficas de la sonda a la membrana y
solo se una de manera específica a la secuencia diana.

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 3. Hibridación.
Se desnaturaliza la sonda en el caso
de que esta sea bicatenaria, se
retira la solución de prehibridación y
pasa a incubarse la membrana con
una solución que contiene la sonda
recién desnaturalizada. Este proceso
de incubación dura de 4 a 24 horas.

4. Lavado posthibridación.
Lo habitual es hacer dos o tres lavados con soluciones en las que se
aumentan progresivamente las condiciones de fuerza iónica y
temperatura de lavado. Con esto se consiguen eliminar los híbridos
imperfectos.
5. Detección del hibrido
En esta técnica suelen utilizarse el marcaje radiactivo y los haptenos.
Marcado radiactivo: Si la sonda empleada está marcada
radiactivamente, finalizado el último lavado post-hibridación la
membrana se puede secar y se revela mediante exposición
autorradiográfica, colocando una placa radiográfica encima y
manteniendo el conjunto en oscuridad durante horas-días.
6. Marcado con haptenos: Si la sonda empleada está marcada con
haptenos a continuación de los lavador se incuba con anticuerpos que
se unan a al antígeno (hapteno) y puede ser posteriormente detectado
normalmente mediante un microscopio de fluorescencia y fluorocromo
asociado al anticuerpo.

5. SOUTHERN BLOT.
Técnica de hibridación que permite identificar fragmentos de ADN separados por
electroforesis en gel y transferidos a una membrana de nitrocelulosa.

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Se realiza unos pasos para este procedimiento:
1. Digestión enzimática. Se realiza con una o varias enzimas de restricción. Su
objetivo es trocear el ADN de partida en fragmentos de diferentes tamaños lo
cual aporta información sobre el tamaño de los fragmentos que contiene la
secuencia diana.
2. Electroforesis en gel. El ADN digerido se somete a una electroforesis en gel de
agarosa para separar los fragmentos producidos según tamaño.
3. Transferencia del ADN a la membrana. Es un paso clave en el que se obtiene
una réplica exacta del patrón de bandas de ADN sobre una membrana de
nitrocelulosa. Consta de varios pasos:
 Desnaturalización. Antes de transferir a la membrana hay que
desnaturalizar para que puedan hibridar con la sonda, se lleva a
cabo lavando el gel con hidróxido sódico.
 Transferencia: lo más habitual es que ocurra por un proceso de
capilaridad con diferentes compuestos absorbentes.

4. Hibridación: Se realiza de manera similar a la descrita en el dot blot. Incubando

la membrana con los distintos reactivos dentro de una bolsa con cierre
hermético.

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  Previo a la hibridación se bloquea la membrana con ADN de esperma
de salmón para evitar uniones inespecíficas de la sonda a la
membrana.
 Finalmente se realizan varios lavados de posthibridación para
eliminar los híbridos imperfectos.
5. Revelado: el revelado de la sonda,
como esta suele estar marcada con
isotopos se realiza mediante una
autorradiografía de rayos X, de manera
que aparecerá una mancha oscura en
los puntos de la membrana en que se
localicen los híbridos sonda/secuencia
diana. Aplicaciones de esta tecnica.
Entre las principales aplicaciones
destacan :

– La elaboración de huellas genéticas.

– El estudio de mutaciones estructurales (translocaciones, deleciones
inserciones, inversiones).
– La detección de secuencias adquiridas.

6. NOTHER BLOT.
El northern blot es una técnica de hibridación que permite detectar moléculas de ARN
separadas por electroforesis en gel y transferidas a una membrana de nitrocelulosa. Es
decir, es una técnica similar al southern blot, pero optimizada para estudiar ARN.

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Diferencias con el southern blot
1. No se requiere digestión enzimática previa con enzimas de restricción.
2. La electroforesis se realiza en condiciones desnaturalizantes, ya que las
moléculas de ARN en solución tienen a adquirir estructuras complejas por
apareamientos lo que dificulta su migración en el gel. Esto se consigue
añadiendo formaldehído como sustancia desnaturalizante antes de vargar el
gel.
3. No es necesario el paso de desnaturalización antes de la transferencia del gel a
la membrana.

7. MICRORRAYS.
Los chips de ADN se conocen como
microarrays, y son conjuntos o
colecciones de fragmentos de ADN
sonda distintitos fijados a una superficie
sólida que puede ser vidrio, plástico o
silicio. Las sondas ancladas en el biochip
no están marcadas. Se marca con
fluorocromos la muestra que se va a
estudiar.

La lectura del resultado obtenido tras la hibridación requiere de tecnología

fluorescente y de un potente software de análisis. Para fabricar un microarray
debemos seguir los siguientes pasos:
1. Marcaje de la muestra: como la sonda no está marcada hay que marcar
la muestra con un fluorocromo. Para ello aíslo en vez de ADN su
correspondiente ARNm, y después lo retrotranscribo utilizando
nucleótidos marcados. Esta molécula se llama ADNc.
2. Hibridación: se deposita la muestra sobre los diferentes pocillos y se
lava para eliminar como siempre los híbridos imperfectos.

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 3. Lectura del microarray: utilizando un láser que emite una determinada
longitud de onda (igual que un microscopio de fluorescencia)
4. Análisis de los resultados: se realiza mediante un software específico.

8. TÉCNICA CAPTURA DE HIBRIDO.

La técnica captura de hibrido
se basa en la formación de
híbridos ARN/ADN que serán
reconocidos o capturados por
anticuerpos específicos.

Si la secuencia diana es ADN, la sonda será de ARN y si es de ARN, la sonda será de

ADN. La captura del Hibrido ARN/ADN se produce mediante anticuerpos específicos
que reconocen estos heteroduplex. Se usa para detección del VPH.

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UNIDAD 3: LAS TÉCNICAS DE PCR.

1. DEFINICIÓN DE LA PCR.
Es una técnica que permite replica entre cientos de miles y millones de veces, en el
transcurrir de pocas horas e in vitro, una región específica de ADN Al simular la forma
en cómo se replica al ADN de forma natural.
Por lo general, la PCR es una técnica común y normalmente indispensable en
laboratorios de investigación médica y biológica para una gran variedad de
aplicaciones.
Surgieron 2 preguntas:
– ¿Cómo conseguir que en cada ciclo de replicación la técnica únicamente se
copie el fragmento que nos interesa, entre una mezcla compleja de ADN? Con
CEBADORES.
– ¿Cómo conseguir que no se produzca la inactivación de la ADN polimerasa por
la temperatura elevada que es necesaria en la fase de desnaturalización del
ADN molde? Con Taq POLIMERASA.
Los cebadores
Son oligonucleótidos monocatenarios con una longitud entre 18 y 30 pares de bases
cuya secuencia es complementaria a los extremos del fragmento de ADN que
queremos amplificar.
Como la polimerasa necesita la cadena de doble hélice para empezar a trabajar, esa
porción la aporta los primers cuando se unen a su secuencia complementaria.
Un juego de cebadores, por lo tanto, define y delimita la región diana de una molécula
de ADN que se amplificará y será la comprendida entre ambos.
Taq polimerasa
Para que la ADN polimerasa pueda sintetizar cadenas nuevas de ADN es necesario que
el ADN molde sea monocatenario. Esto hace que cada ciclo de la PCR tenga que
comenzar por una fase de desnaturalización por calor, lo que supone un problema
para las ADN polimerasas convencionales. Esta dificultad se superaba al principio
añadiendo enzima nueva en cada ciclo, lo que la convertía en una técnica costosa y

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larga El hecho que posibilitó el desarrollo espectacular de la PCR fue el descubrimiento
de las ADN polimerasas termoestables aisladas de un grupo de bacterias extremófilas
que tenían actividad polimerasa a altas temperaturas.
Los componentes necesarios
en la pcr son: Cebadores and
polimerasa nucleotidos y and
molde.

2. PROCESO DE LA PCR Y SUS FASES.

Se puede resumir de la siguiente forma: partiendo de un ADN molde, una enzima (la
ADN Polimerasa) incorpora nucleótidos complementarios a partir de la zona de doble
cadena originada por la unión de los cebadores al molde. El proceso se da en tres
fases: Desnaturalización, alineamiento extensión y elongación final.
Desnaturalización.
Mediante un calentamiento a
94°C, el ADN de doble cadena
logra que sus cadenas se separen
o desnaturalicen. Se rompen
puentes de hidrogeno. Las bases
nitrogenadas quedan expuestas.

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Alineamiento
Es el proceso en el que los
primers o cebadores se unen al
ADN. Ocurre cuando la mezcla es
enfriada hasta 55°C.

En este momento, dentro del tubo de reacción, todo el ADN está en forma de cadena
simple, menos las dos pequeñas regiones en las cuales los primeros de 20 pares de
bases se ligarán a los dos lados de la secuencia de AND.

Poliremación

La temperatura se eleva entonces hasta 72°C y la Taq polimerasa comienza a sintetizar

un nuevo ADN, comenzando por las regiones en doble cadena, en donde cada uno de
los primers se unió al molde de la muestra de ADN. La Taq polimerasa promueve la
síntesis de ADN apenas en la región de doble cadena. La síntesis ocurre a una tasa de
aproximadamente 20 nucleótidos por segundo, y en un minuto es sintetizada una
nueva copia del fragmento que se quiere analizar.
Elongación final
Es común que al finalizar todos los ciclos se realice un último alargamiento por 5 min. a
72ºC, para asegurarse que todos los productos de amplificación estén completamente
terminados y tengan, por ende, exactamente la misma longitud.

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3. APLICACIONES DE LA PCR.
Detección de enfermedades hereditarias
Cada gen en estudio puede ser amplificado fácilmente por PCR, con los cebadores
adecuados, y luego ser secuenciado, para así determinar si un individuo porta alguna
mutación que explica la presencia de una enfermedad o su aparición en el futuro, la
que puede ser heredada a sus hijos.
Huella digital genética
Es una técnica forense que permite identificar a una persona comparando su DNA con
el de una muestra obtenida, por ejemplo, de la escena de un crimen.
Como la muestra puede ser muy escasa, la PCR permite aumentar la cantidad de DNA
amplificando ciertos segmentos polimórficos (variables en la población), para luego
poder compararlos.
Test de paternidad
Amplificando por PCR fragmentos polimórficos de DNA de la madre, del niño y de él o
los presuntos padres, y separándolo mediante electroforesis, se puede visualizar una
serie de segmentos que tiene el niño, que debe compartir con la madre y padre
biológicos.

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4. VENTAJAS Y DESVENTAJAS.
Ventajas:
– La PCR permite clonar ADN en pocas horas, utilizando equipos relativamente
poco sofisticados.
– Una reacción de PCR típica consiste en 30 ciclos de desnaturalización, síntesis y
reasociación.
– Cada ciclo dura típicamente de 3 a 5 minutos y se utiliza un termociclador que
lleva unmicroprocesador para programar los cambios de temperaturas y el
número de ciclos deseado.
– La PCR puede amplificar secuencias a partir de cantidades ínfimas de ADN diana,
incluso a partir de ADN contenido en una sola célula.
– La elevada sensibilidad ha permitido:
o Desarrollo de nuevos métodos para el estudio de la patogénesis
molecular.
o La aparición de numerosas aplicaciones (ciencia forense, diagnóstico,
estudios de paleontología molecular, etc) donde las muestras pueden
contener muy pocas células.
– La PCR permite la amplificación de secuencias específicas de material que
contiene ADN muy degradado, o incluido en un medio que hace problemática su
purificación convencional.

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 – Esto hace que el método resulte muy adecuado para estudios de antropología y
paleontología molecular, degradado, o incluido en un medio que hace
problemática su purificación convencional.
– El método se ha empleado con éxito también para la amplificación de ADN de
muestras de tejidos fijadas con formol, lo cual ha tenido importantes
aplicaciones en patología molecular.
Desventajas:
– Disponer de alguna información previa sobre la propia secuencia a amplificar.
– La región de interés ya debió haber sido parcialmente caracterizada, a menudo
mediante la aplicación de métodos de clonación basados en sistemas celulares.
– Una desventaja clara de la PCR como método de clonación de ADN ha sido el
tamaño de las secuencias de ADN que permite clonar.
– Los fragmentos pequeños se amplifican muy fácilmente, pero conforme aumenta
su tamaño es más difícil obtener una amplificación eficiente.
– La clonación del ADN en células pasa por la replicación del ADN in vivo, proceso
asociado a una gran fidelidad de copiado debido a la existencia, en la célula, de
mecanismos de lectura y corrección de errores.
– Sin embargo, cuando el ADN se replica in vitro la tasa de errores cometidos
durante el copiado se dispara.
– Hay peligro de contaminarse con otro ADN incluso puede ser del mismo
investigador u otro.

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 BIBLIOGRAFIA
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regulation/biotechnology/a/polymerase-chain-reaction-pcr
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bookid=1473&sectionid=102743956#1118679815
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resumen-evolucion-tecnicas-citogenetica-genetica-S1138359310003199
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