Plásmidos como vectores de clonaje
Es el vector que con más frecuencia se emplea en un laboratorio. Son pequeñas moléculas de
DNA circulares de doble cadena. En la imagen podemos ver dos plásmidos . Son moléculas
pequeñas de varias kilobases. Existen en la naturaleza, algunas bacterias portan plásmidoos.
Algunas bacterias tienen su genoma y luego además una molécula de DNA extra ribosomal
que se replica también junto con el genoma. Normalmente estos plasmidos tienen información
adicional que no es imprescindible para que la batería viva pero que le viene muy bien. Por
ejemplo muchos de la resistencia a antibióticos están codificadas en plásmidoos. Las
bacterias pueden vivir sin esta resistencia, no es información imprescindible pero desde luego
le viene bien.
Esto le da la capacidad de resistir antibióticos y. Por tanto los plásmidoos son moléculas
naturales que existen en la naturaleza como tal, se replican una o varias veces antes de que se
replique la batería Y tienen beneficios como la resistencia a antibióticos. Esto es en cuanto a
los plásmídoos naturales.
Un plásmido se empezó a modificar en el laboratorio para generar los plásmídoos que se conocen hoy en día, plasmidos artificiales,
claramente muy modificados. El plásmido se usa como vector de clonaje, en prácticas vamos a usar un plásmido como vector de clonaje. Todo
lo que tiene está enfocado en que sirva para clonar.
Plásmidos como vectores de clonaje. Elementos esenciales
Los plásmídoos tienen que tener tres características esenciales para que sean útiles
para poder manejarlos como herramientas de clonaje. la primera, puesto que se tienen
que replicar, deben tener un origen de replicación. Luego tienen que tener una región en
la que podamos abrir el plásmido y meter el trozo de DNA que nos interesa, el fragmento
que queremos clonar. Esta región debe tener dianas de restricción, es decir secuencias
que son reconocidas por las enzimas de restricción para poder cortar. Normalmente las
dianas se concentran en una región pequeña, que es una región que contiene múltiples
dianas de restricción. A esta región se le denomina en inglés polylinker en castellano lo
traducimos como sitio de poli clonaje, esto no quiere decir que vayamos a hacer muchos
clonaje es, sino que tenemos muchos sitios donde podemos hacer el clonaje.
Y repito para que podamos clonar algo lo primero que tenemos que hacer es abrir el
plásmido y para ello necesitamos una diana de restricción y luego comprar una enzima
de restricción que corte. la forma de hacerlo es cortarlo, abrirlo e insertar el fragmento
de DNA que nos interesa.
Por tanto, ya hemos hablado de dos cosas que debe tener los plásmídoos como un origen de replicación, un sitio de policlonaje donde estén
múltiples dianas de restricción, antiguamente cuanto más mejor, ya que antes solo podíamos usar las dianas de restricción naturales. Si yo
quería clonar un trozo de un virus, tenía que utilizar las dianas que la naturaleza hubiera puesto en ese virus, por lo tanto cuanto más dianas
tengo más probabilidad tendría de que la que tenga el virus coincida con alguna de las dianas puestas en el polylinker.
Hay una última cosa que nos hace falta en cualquier vector, fijaros que el plásmido tiene que entrar en la bacteria.
El DNA entra en una de cada 10.000 bacterias, con una frecuencia de 10 elevado a -4. Claro, si entra en una de cada 10.000, encontramos la
bacteria que entra. hay que diseñar una estrategia que nos permita identificar solo las bacterias que contienen el plásmido, a esta estrategia
se refiere este tercer elemento. Sin esta región no podríamos seleccionar las bacterias que han incorporado el plásmido. A esta región se le
llama marcador de selección, sirven para detectar solo las bacterias que incorporen el plásmido. Esto consiste en un gen que cuando se
expresa da lugar a una proteína que confiere resistencia a un antibiótico. Las bacterias que incorporan el plásmido son capaces de expresar
esta información en forma de proteína y tiene una enzima que degrada el antibiótico y no las mata. Y por ejemplo la ampicilina, el marcador de
plásmido es resistente a la amplifilina, por lo que al poner las bacterias en presencia de Ampicilina, A las 9999 bacterias que no han
incorporado el plásmido mueren con la ampicilina y solo aquellas que tienen el plásmido resistente a la ampicilina viven. De esta
encontraremos en una placa todas las bacterias que han incorporado el plásmido. Habitualmente los marcadores de selección más frecuente
son genes que confieren resistencia a antibióticos. El más frecuente es este gen que confiere resistencia a la ampicilina.
Introducción de los plásmidos en células.
Para meter el DNA en las células ocurre con muy poca frecuencia. En el laboratorio se han desarrollado distintas estrategias para mejorar. La
más común, barata y frecuente, es, después de crecer las bacterias, meterlas en un cultivo y ponerlas en un tampón que contenga iones
como calcio o magnesio. Ponemos el DNA en contacto con las bacterias que están en cloruro calcicos o magnésico, lo ponemos en hielo Y de
repente de 0° lo llevamos a un baño de 42° en torno a uno o dos minutos, lo volvemos a llevar al hielo de manera que el calor que hemos dado
altera las propiedades de las membranas y el DNA entra. Repito con una frecuencia muy baja, de 10 elevado a -4. Pero al manejar millones de
bacterias, son tan pequeños, crecen tan rápido, que cuando trabajamos con batería lo hacemos con millones por lo que tenemos muchas
colonias que han crecido. Aunque la frecuencia es baja como hay tantas bacterias funciona.
Fijaros que aquí tenemos un eperdonf en hielo, ponemos el DNA en contacto con las
bacterias en hielo, lo metemos en un baño de agua entorno un minuto, después lo volvemos
a enfriar y lo ponemos en la placa. Con esto, lo que conseguimos es que el plásmido entre
en la bacteria ya que hemos alterado la permeabilidad en la membrana de la bacteria.
Aquellas bacterias que contienen el plásmido van a expresar el gen de resistencia que les
permite sobrevivir, las bacterias que son la mayoría que no han incorporado el plásmido
mueren en la placa de ampicilina.
