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INTRODUCCIÓN.
La biotecnología comprende una variedad de técnicas avanzadas para el análisis y manipulación
genética, permitiendo obtener resultados consistentes según los objetivos del estudio. Con el paso de los
años, los avances tecnológicos y el desarrollo de programas informáticos han facilitado enormemente
estas tareas. Entre las herramientas disponibles, destacan aquellas para el diseño de primers, como
Primer3Plus, que permite diseñar primers específicos en tamaño y secuencia para el templado de
cadenas de DNA o RNA de interés. Estos primers luego pueden evaluarse mediante programas como
NetPrimer (de PREMIER Biosoft) para determinar sus características fisicoquímicas, asegurando que
sean viables, no formen dímeros y se unan correctamente al blanco deseado. Además, la herramienta
BLAST del NCBI permite verificar la especificidad de los primers frente a bases de datos genómicas,
asegurando que estén dirigidos a los genes de interés. Este conjunto de procedimientos brinda al
investigador una mayor confianza y probabilidad de éxito en la obtención de los genes deseados.
Figura 1.-En la labor de la PCR, durante la hibridación se requieren primers específicos para el
aislamiento de la secuencia de DNA de interés para su posterior elongación (labbox, 2022).
En el momento que planteamos la línea de nuestra investigación seleccionamos los organismos que
usaremos para obtener el gen o los genes de interés, pudiendo definir previamente el gen así como su
función específica y encontrarlo en una base de datos. La búsqueda de información sobre las pares de
bases que contiene un organismo se vuelve esencial para definir sus partes. Para esto utilizamos la base
de información NCBI. Es un recurso central utilizado por todas las principales bases de datos
públicas de secuencias en la Colaboración Internacional de Bases de Datos de Secuencias de
Nucleótidos (INSDC) la taxonomía del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI)
desempeña un papel vital en la estructuración de la comunicación relativa a todas las formas de
vida en la Tierra. La asociación de los nombres correctos de los organismos con los datos genéticos
y genómicos es fundamental para casi todos los aspectos de la investigación biomédica, agrícola y
ecológica (Conral et.al., 2020).
En relación con NCBI como fuente de información verídica, la información obtenida se puede insertar
en programas como Snapgene que nos permite estructurar el DNA e identificar elementos funcionales a
lo largo de la secuencia de ADN de un gen o genoma, dándole así un significado a las secuencias.
Además de otras funciones como menciona (Leyton Mercado, 2024) “SnapGene es una herramienta
rápida y precisa capaz de diseñar y simular procedimientos de clonación con una precisión increíble.
Gracias a sus funciones es posible detectar errores antes de que sucedan, garantizando la integridad de
las construcciones genéticas desde el inicio del proyecto”.
Es así que en esta práctica se pone a prueba la confiabilidad y certeza de estos sistemas en la búsqueda
de información sobre los genes y pb procedentes de los organismos seleccionados Chlamydomonas
reinhardtii y Pseudomonas fluorescenses, dándole sentido a estas secuencias con Snapgene y diseñando
lo oligonucleótidos que permitirán la tarea de templado teniendo una especificidad optima con el fin de
obtener amplicones.
METODOLOGÍA
Uso de bases de datos de secuencias biológicas.
-Obtención de la secuencia del gen de interés a partir de un número de acceso.
Se ingresó a la página del NCBI: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/search/. Se colocó en la barra de
búsqueda el número de acceso: D90206.1 (Chamydomonas reinhardtii), en la ventana abierta con la
información de la secuencia se seleccionó la opción Fasta y se procedió a descargar la secuencia en este
mismo formato.
.-Obtención de la secuencia del gen de interés a partir del nombre del gen y el organismo.
Se ingresó a la página del NCBI: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/search/. Se colocó en la barra de
búsqueda acdS Pseudomonas fluorescens y se dio en buscar, se pasó del apartado de Genomes a
nucleotide y se buscó el documento que menciono el nombre del organismo y gen elegido, se descargó
las secuencias codificantes y las secuencias completas en formato FASTA.
Análisis y anotación de secuencias.
-Abrir secuencias de interés en SnapGene.
Se descargó SnapGene y se cargó el archivo FASTA de Chamydomonas reinhardtii con la
especificación de doublé stranted-linear. Se cambió la presentación de map a sequence..
-Identificación de las pates del gen en la secuencia nucleotídica.
Se ingresó a la página del NCBI: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/search/ y se buscó el gen de anhidrasa
carbónica de Chamydomonas reinhardtii. Este se ingresó en SnapGene, en Edit >>Find >>Find DNA
sequence. Se abrió una ventana en la parte inferior de la pantalla. En esa ventana se va a pegó la
secuencia del Exón 1 y después se da click en NEXT. La secuencia buscada se marcó en amarillo y se
seleccionó, después se anotó la secuencia, se fue a Feactures >>Add feature. Se abrió una nueva
ventana. Se anotaron las siguientes partes: mRNA, AGCGGCTGGC element, CAAT_signal y
TATA_box.
Diseño de oligos para amplificar el gen CAH1 de Chlamydomonas reinhardtii
Se ingresó a la página de Primer3Plus:
https://www.bioinformatics.nl/cgibin/primer3plus/primer3plus.cgi. En la ventana principal (Main) En
Upload sequence file, se seleccionó el archivo CAH1 gen de Chlamydomonas reinhardtii.fasta y se
cargó el documento. Se llenó la Sequence id y en el espacio blanco apareció la secuencia. Se seleccionó
las opciones Pick left primer y Pick right primer, se modificó el tamaño de la secuencia a aislar en
350pb así el programa nos arrojó nuevos pares de oligos diseñados. El programa nos arrojó tres posibles
combinaciones que posteriormente se evaluaron.
-Evaluación fisicoquímica de los oligos diseñados.
Se ingresó a la página https://www.premierbiosoft.com/netprimer/. Se colocó el nombre y descripción
de los oligos, se colocó la secuencia de los oligos F y R obtenidos de Primer3Plus. El sistema nos arroja
automáticamente las características fisicoquímicas de los oligos.
-Evaluación de la especificidad de los oligos diseñados.
Se ingresó a la página de BLAST del NCBI https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi se seleccionó la
opción de Nucleotide BLAST. En este momento se abrió una ventana y en el rectángulo blanco se
ingresó el blanco la secuencia del oligo foward del par seleccionado. Se colocó nombre al trabajo: gen
CAH1, y se seleccionó al organismo: Chlamydomonas reinhardtii (taxid:3055). Se dio click en la
operación blast. Después de unos minutos se observó en la lista de resultados el gen de interés.
Todo este conjunto de operaciones se desarrolló de la misma forma para Pesudomonas fluorecsences.
RESULTADOS
Se estableció el gen y organismo de interés para obtener su producto de PCR deseado. Para esto
primeramente se obtuvo la información del genoma donde se encontraba la secuencia del gen CHA1
Chlamydomonas reinharditti, información obtenida de NCBI.
a) b)
Imagen1.- a) Búsqueda realizada con el código de acceso D90206.1 en el motor de búsqueda
del NCBI, b) Información sobre la procedencia del gen, no. de exones, secuencias
codificantes, tamaño en pb del gen, etc.
Dando un enfoque diferente a la búsqueda de datos se decidió buscar por medio del NOMBRE del
organismo y su gen acdS Pseudomonas fluorescens.
Imagen 2.-La búsqueda efectivamente nos arroja la información acerca del gen la procedencia del gen,
no. de exones, secuencias codificantes, tamaño en pb del gen, etc.
Para darle un significado a la secuencia genética de Chlamydomonas reinharditii se trabajó con
SnapGene, marcando de manera consistente los siguientes puntos:
Para su fácil demostración se muestra la secuencia marcada en forma Map:
Imagen 3.Gen de CHA1 de Chlamydomonas reinharditii con las secciones marcadas: exones
(naranja), GC_señal (Azul claro), CAAT_señal (lavanda) y Caja_TATA (rosa). Las palabras en
color blanco de la parte superior señalan la serie de enzimas de restricción que pueden
ejecutar la acción de corte, diferentes enzimas para cada sección.
Para la tarea posterior de PCR se diseñó oligonucleótidos en la herramienta Primer3Plus siguiendo una
serie de configuraciones donde el tamaño del amplicón se estableció de 300-500pb.
Imagen 4.-Primer3Plus arrojo una
a) serie de secuencias de
oligonucleótidos (primers) que
pueden ser viables. El orden en que
estos son mostrados refleja la
viabilidad y especificidad que
presentaran en el proceso. Para este
caso el orden es a>b>c.
El sistema nos ofrece algunos datos
que especifican su unión tanto de lado
b) izquierdo 5´ y derecho 3´asi como su
tamaño que puede variar en función
de los primers.
c)
Se evaluó las características fisicoquímicas en NetPrimer del primer seleccionado (a) con el fin de
conocer las magnitudes de energía que determinan si la unión del primer a la cadena de DNA seria
sólida, eficaz y eficiente.
Imagen 5.-Se insertó la secuencia “a” en el programa agregando las correspondientes etiquetas.
Imagen 5.1.-El programa nos arroja los datos para el primer Left and Right. Cabe mencionar que este
sistema nos muestra datos más específicos que Primer3Plus, como el echo de que existen variaciones
pequeñas en la cantidad de energía requerida para cada unión de los primers, su Tm y el porcentaje
GC%.
Conociendo la información pertinente para decidir el uso de estos primers se realizó un BLAST (Basic
Local Alignment Search Tool) para realizar un análisis funcional.
Imagen 6.-Verificación de la funcionalidad de los oligonucleótidos con una base de datos conocida
(BLAST) en NCB.
Confirmando así que para el caso del par de primers generados en Primer3Plus con el fin de formar un
producto de 307 pb de tamaño, presentan características fisicoquímicas óptimas y están verificados para
una funcionalidad persistente disminuyendo el grado de error
DISEÑO DE OLIGONUCLEÓTIDOS PARA PSEUDOMONAS FLUORESCENS
Para este proceso se resumió de manera apropiada los resultados, distintos puntos fueron explicados
anteriormente.
Imagen 7.-Par de primers seleccionados que el sistema arroja como los más óptimos.
Imagen 8.-Evaluació fisicoquímica del par de oligonucleótidos diseñados, no presentan casi ninguna
variación en sus característica respecto la serie Left y Right.
Imagen 9.-Verificación de los primers tras su BLAST en la página de NCBI determinando que son
viables para su creación y posterior utilización en la actividad de PCR.
DISCUSIÓN
El diseño de primers es una parte sustancial dentro de los ensayos de PCR, el mismo es aplicado en la
caracterización de microorganismos, secuenciación, cuantificación, etc. Esta tarea resulta precisa para
nuestro trabajo en el laboratorio, indistintamente del área de empleo de la cual tuviera fin como la
agronomía, medicina, investigación, criminología entre otras áreas.
Antes del diseño de primers resulta esencial contar con una base de datos genómica amplia y segura
que para este ensayo fue NCBI (National Center of Biotecnology Information) la cual nos ofreció las
secuencias precisas así como lo menciona (Rodríguez et.al., 2015): En el diseño de cebadores y sondas
a
partir de una región específica de un gen común, primero se deben seleccionar todas las secuencias
conocidas en las bases de datos públicas y luego alinearlas para encontrar regiones conservadas. Esto
puede suponer una actividad que consume mucho tiempo si no está automatizada. Además, aunque
los cebadores y las sondas parecen generar resultados aceptables al principio, muchos cebadores
caseros a menudo no cumplen con su especificidad, eficiencia de amplificación, reproducibilidad y
sensibilidad.
El programa Snapgene permitió darle un sentido coherente a la secuencia del gen CHA1 de
Chlamydomonas reinharditii separando las diferentes secciones del gen y como se demostró poder
