PRÁCTICA XIII.
ANÁLISIS ELECTROFORÉTICO DE PROTEÍNAS EN GELES DE
POLIACRILAMIDA.
OBJETIVO: El objetivo de esta práctica es aprender los principios de la electroforesis de proteínas
en geles de poliacrilamida.
Procedimiento:
Concentración de proteínas:
1. Agregue 100 µl de cada uno de los distintos extractos proteicos en tubos previamente rotulados.
2. Agregue a cada tubo 2 volúmenes de sulfato de amonio saturado.
3. Mezcle suavemente e incube en hielo por 30 minutos.
4. Centrifugue a máxima velocidad por 10 minutos a 4oC.
5. Elimine el sobrenadante completamente y resuspenda el botón en 50 µl de agua estéril. Almacene
las muestras a -20oC hasta su uso.
Preparación del gel:
Nota: La acrilamida es una potente neurotoxina. Utilice guantes y mascarilla, trabaje en la cámara
de extracción.
A continuación, se describe la preparación de 5 ml de gel de separación al 12% y 2.5 ml de gel de
montaje al 4%. La cantidad de mezcla a preparar se puede ajustar de acuerdo al tamaño del aparato
de electroforesis que se va a usar.
1. Limpie bien todos los vidrios y otros accesorios del aparato de electroforesis y ensámblelo.
2. Prepare la mezcla para el gel de separación mezclando en orden los siguientes reactivos, sin
causar burbujas:
Agua 2000 µl
Mezcla de acrilamida 40% 1500 µl
1,5 M Tris pH 8,8 1250 µl
10% SDS 50 µl
3. Tenga a mano el persulfato de amonio al 10% y el TEMED, así como el aparato de
electroforesis ensamblado (sin el peine).
4. A la mezcla anterior agregue rápidamente 50 µl de Persulfato de amonio y 3 µl de TEMED.
Mezcle bien, pero sin producir burbujas.
5. Inmediatamente y con cuidado succione la mezcla con la jeringa (sin aguja) y luego comience a
chorrear el gel en el aparato de electroforesis. Chorree solamente un 75% de la capacidad
dejando espacio para el gel de montaje.
6. Antes de que la acrilamida polimerice, agregue isobutanol hasta llenar el resto del espacio. De
esta manera se forma una superficie homogénea.
7. Mientras el gel de separación polimeriza (15-20 minutos), prepare el gel de montaje mezclando
en orden los siguientes reactivos:
Agua 1813 µl
Mezcla de acrilamida 40% 312 µl
0,5 M Tris pH 6,8 310 µl
10% SDS 25 µl
8. Elimine el isobutanol del gel de separación polimerizado vertiéndolo hacia abajo. Agregue agua
para eliminar el resto del isobutanol y luego elimine el agua lo más que se pueda.
9. Agregue a la mezcla del gel de montaje 25 µl de persulfato de amonio y 1.5 µl de TEMED,
mezcle bien sin producir burbujas.
10. Inmediatamente succione la mezcla con una jeringa y termine de llenar el espacio libre sobre el
gel de separación. Llene hasta la misma superficie.
11. Antes de que el gel polimerice, coloque el peine evitando las burbujas.
12. Deje que el gel de montaje polimerice por 20 minutos.
13. Coloque el ensamblaje del gel en el aparato de electroforesis respectivo y llene los tanques con
solución de corrida.
14. Saque el peine y limpie los pozos con solución de corrida usando una jeringa con aguja.
15. Tome 15 µl del extracto de proteínas y agréguele 5 µl de buffer de carga. Colóquelos por 2
minutos en agua hirviendo y cargue las muestras en el gel. Cargue además el marcador
molecular (5 µl).
16. Corra el gel a 100 voltios por 1,5 horas o hasta que el azul de bromofenol llegue a la parte
inferior del gel.
Tinción del gel:
1. Una vez realizada la electroforesis, elimine la solución de corrida del tanque, desensamble el
aparato y separe los vidrios con cuidado para que el gel quede adherido a uno de los vidrios.
2. Coloque el gel (tratando que se suelte del vidrio) en una bandeja y cúbralo completamente con
solución de tinción. Tiña el gel bajo agitación por 20 a 30 minutos.
3. Elimine la solución de tinción y sustitúyala por solución de lavado. Destiña el gel por 30 minutos
con agitación.
4. Repita el paso 3 hasta que se observen las bandas con buen contraste.
5. Saque el gel y colóquelo sobre un vidrio limpio para su observación.
