Separaciones analíticas Separaciones analíticas
Para la mayoría de los análisis se debe pensar en cómo tratar a las especies químicas externas
que atenúan la señal del analito o que producen una señal que es indistinguible de la señal del
analito. Una sustancia que afecta una señal analítica se denomina interferencia o interferente.
Se pueden utilizar varios métodos para manejar las interferencias en los procedimientos
analíticos. Las separaciones aíslan el analito de los componentes potencialmente
interferentes. Las separaciones pueden ser completas o parciales. En el proceso de
separación, el material es trasportado mientras sus componentes se redistribuyen en el
espacio. La separación siempre requiere energía.
Las metas de la separación analítica suelen ser eliminar o reducir las interferencias a fin de
obtener información analítica cuantitativa a partir de mezclas complejas.
En técnicas como la cromatografía se obtiene información cuantitativa casi de manera
simultánea a la separación. En otros procedimientos, la etapa de separación es distinta e
independiente de la etapa de medición que le sigue.
Separaciones cromatográficas Tipos de cromatografías: interacción soluto - fase estacionaria
La cromatografía es un método ampliamente utilizado para la separación, identificación y La cromatografía se divide en varias categorías en función del mecanismo de interacción del
determinación de los componentes químicos de mezclas complejas. soluto con la fase estacionaria:
Todos los métodos cromatográficos tienen en común el uso de una fase estacionaria y el de
una fase móvil. Los componentes de una mezcla son llevados a través de la fase estacionaria ➢ Cromatografía de adsorción:
por la fase móvil, y la separación se basa sobre las diferencias de las velocidades de migración
entre los componentes de la fase móvil. Usa una fase estacionaria sólida y una fase
móvil líquida o gaseosa. El soluto se adsorbe
en la superficie de las partículas sólidas.
La fase estacionaria en cromatografía es aquella que está fija en su lugar, ya sea dentro de una Cuanto más fuertemente se adsorbe un soluto,
columna o sobre una superficie plana. más lentamente atraviesa la columna.
La fase móvil en cromatografía es aquella que se mueve sobre la fase estacionaria o a través
de ésta acarreando con ella la mezcla de analitos. La fase móvil puede ser un gas o un líquido.
Tipos de cromatografías: interacción soluto - fase estacionaria Tipos de cromatografías: interacción soluto - fase estacionaria
➢ Cromatografía de reparto: ➢ Cromatografía de intercambio iónico:
Utiliza una fase estacionaria líquida, en forma de una fina película de alto punto de ebullición En este tipo de cromatografía existen aniones
sobre la superficie de un soporte sólido, que en cromatografía de gases es, típicamente, la y cationes covalentemente unidos a la fase
cara interna de una columna de cromatografía de sílice. El soluto está en equilibrio entre el estacionaria sólida, que por lo general es una
líquido estacionario y la fase móvil, que es en cromatografía de gases el gas que fluye. resina. Los iones en disolución de carga
opuesta son atraídos a la fase estacionaria
por fuerzas electrostáticas. La fase móvil es
un líquido.
Tipos de cromatografías: interacción soluto - fase estacionaria Tipos de cromatografías: interacción soluto - fase estacionaria
➢ Cromatografía de exclusión molecular: ➢ Cromatografía de afinidad:
También llamada cromatografía de filtración Esta forma de cromatografía, que es la más selectiva, emplea interacciones específicas entre
por gel o de permeación por gel, separa una clase de moléculas de soluto y una segunda molécula que está unida covalentemente
moléculas por su tamaño. Las moléculas de (inmovilizada) en la fase estacionaria.
mayor tamaño pasan más rápidamente que
las de menor tamaño. La fase móvil líquida o Por ejemplo, la molécula inmovilizada
gaseosa pasa a través del gel poroso. Los podría ser un anticuerpo unido a una
poros son bastante pequeños para excluir a proteína determinada. Si se pasa a
los solutos grandes, pero no a los pequeños. través de la columna una mezcla que
Las moléculas grandes pasan de largo sin contiene un millar de proteínas, sólo
entrar en los poros. Las moléculas pequeñas la proteína que reacciona con el
tardan más tiempo en pasar a través de la anticuerpo se fija a la columna.
columna porque penetran dentro del gel, y Después de lavar los demás solutos de
por consiguiente deben atravesar más la columna, se libera la proteína
volumen antes de abandonar la columna. deseada modificando el pH o la fuerza
iónica.
Clasificación general de los métodos cromatográficos Tipos de cromatografía según sus fases: gas - líquido
Los métodos cromatográficos son de dos tipos básicos: Cromatografía gas - líquido:
➢ En la cromatografía en columna, la fase estacionaria se mantiene dentro de un tubo ➢ Fase móvil: utiliza un gas inerte (como helio o nitrógeno). Este gas transporta los
delgado, y la fase móvil es forzada a través del tubo mediante presión o gravedad. componentes de la muestra a través de la columna.
➢ En la cromatografía plana, la fase estacionaria está sostenida sobre una placa plana o en
los poros de un papel, y la fase móvil se mueve a través de la fase estacionaria por ➢ Fase estacionaria: es un líquido de alta viscosidad, inmovilizado o adsorbido sobre una
capilaridad o por la influencia de la gravedad. superficie sólida (como sílice o un polímero), que recubre el interior de la columna capilar
o se fija en partículas dentro de la columna empacada.
➢ Mecanismo de separación: la separación se basa principalmente en la volatilidad de los
compuestos y su interacción con la fase estacionaria. Los compuestos más volátiles (con
puntos de ebullición bajos) eluyen más rápido.
➢ Aplicaciones y tipo de muestras: ideal para la separación de compuestos volátiles y
termoestables, como hidrocarburos, solventes, y ciertos compuestos orgánicos. Es muy
común en análisis de muestras gaseosas o con componentes de bajo peso molecular.
Tipos de cromatografía según sus fases: líquido - líquido Tipos de cromatografía según sus fases: líquido - sólido
Cromatografía líquido - líquido: Cromatografía líquido - sólido:
➢ Fase móvil: usa un líquido como fase móvil, el cual puede ser un solvente orgánico o una ➢ Fase móvil: usa un líquido como fase móvil, el cual puede ser un solvente orgánico o una
mezcla de solventes acuosos u orgánicos. mezcla de solventes acuosos u orgánicos.
➢ Fase estacionaria: también es líquida, pero está en equilibrio con la fase móvil líquida. Esto ➢ Fase estacionaria: utiliza una fase estacionaria sólida, como sílica o alúmina. La fase móvil
genera una situación de partición entre dos fases líquidas (generalmente no miscibles) líquida se mueve a través de este sólido, y los compuestos interactúan con su superficie
donde los solutos se distribuyen según su solubilidad en cada fase. mediante mecanismos de adsorción.
➢ Mecanismo de separación: la separación depende de la solubilidad diferencial de los ➢ Mecanismo de separación: la separación se realiza mediante adsorción. Los compuestos se
compuestos en las dos fases líquidas. Las moléculas que son más solubles en la fase adsorben en la superficie de la fase estacionaria sólida, y su retención depende de la
estacionaria pasarán más tiempo en ella y eluirán más lentamente. fuerza de sus interacciones químicas con esta superficie (fuerzas de Van der Waals, enlaces
de hidrógeno, o interacciones dipolo-dipolo).
➢ Aplicaciones y tipo de muestras: principalmente para separar compuestos no volátiles y
termolábiles, como compuestos biológicos y ciertos compuestos orgánicos de mayor ➢ Aplicaciones y tipo de muestras: se utiliza frecuentemente para separar mezclas complejas
tamaño. También es útil para análisis en sistemas acuosos o en matrices complejas. de moléculas que se adsorben a la fase estacionaria, como en la separación de pigmentos,
lípidos, y compuestos aromáticos.
Cromatografía de elución en columna Cromatografía de elución en columna
Elución: proceso en el que los solutos son lavados a través de una fase estacionaria mediante 3) La elución ocurre posteriormente al forzar los componentes de la muestra a través de la
el movimiento de una fase sólida. La fase móvil que sale de la columna se denomina eluido. columna por medio de la adición continua de una fase móvil nueva.
4) Con la primera introducción de la fase móvil nueva (eluyente), la porción de la muestra
Eluyente: es un disolvente utilizado para acarrear los componentes de una mezcla a través de contenida en la fase móvil se mueve hacia abajo de la columna, donde ocurre una
una fase estacionaria. partición aún mayor entre la fase móvil y la fase estacionaria.
La columna consiste en un tubo de calibre estrecho que está empacado con un sólido inerte 5) Adiciones posteriores de disolvente acarrean a las moléculas de soluto hacia abajo por la
finamente dividido que sostiene la fase estacionaria en su superficie. La fase móvil ocupa los columna en una serie de transferencias continuas entre las dos fases.
espacios abiertos entre las partículas del empaque.
6) Debido a que el movimiento del disolvente puede ocurrir solo en la fase móvil, la
1) Inicialmente, una disolución de la muestra que contiene una mezcla de A y B en la fase velocidad promedio a la que migra un soluto depende de la fracción de tiempo que pasa
móvil es introducida en la cabeza de la columna como porción estrecha. en dicha fase. Esta fracción es pequeña para solutos que son retenidos fuertemente por
la fase estacionaria y grande cuando la retención en la fase móvil es más probable.
2) Los dos componentes A y B se distribuyen entre la fase móvil y la fase estacionaria.
7) Las diferencias de velocidad resultantes provocan que los componentes de una mezcla se
separen en bandas o zonas a lo largo de la longitud de la columna.
Cromatografía de elución en columna Cromatogramas
El aislamiento de las especies químicas Si un detector que responde a la concentración de soluto se coloca al final de la columna
separadas se consigue haciendo pasar durante una elución y su señal se grafica en función del tiempo (o del volumen de la fase
una cantidad suficiente de fase móvil a móvil añadida), se obtienen una serie de picos. Dicha gráfica, se denominada cromatograma.
través de la columna para conseguir que
las bandas individuales pasen hasta el
Los cromatogramas son útiles para los análisis tanto cualitativos como cuantitativos. Las
final (sean eluidas de la columna),
donde pueden ser recolectadas o posiciones del máximo de los picos en el eje que representa al tiempo pueden ser utilizadas
detectadas. para identificar los componentes de la muestra. Las áreas debajo de los picos proporcionan
una medida cuantitativa de la cantidad de cada especie química en la muestra.
Métodos para mejorar el desempeño de la columna Velocidades de migración de los solutos
Diversas variables químicas o físicas ejercen una influencia sobre las velocidades de La efectividad de una columna cromatográfica en la separación de dos solutos depende en
separación de las bandas y del ensanchamiento de éstas. Se pueden realizar separaciones parte de las velocidades relativas a las que las dos especies químicas son eluidas. Estas
mejoradas al controlar estas variables, con el fin de poder lograr: velocidades, a su vez, están determinadas por las relaciones de las concentraciones de soluto
en cada una de las dos fases.
1) Incremento de la velocidad de separación de las
bandas. ➢ Constante de distribución (Ks): la constante de distribución para un soluto en una
cromatografía es igual a la relación de su concentración molar en la fase estacionaria con
2) Disminución de la velocidad de ensanchamiento su concentración molar en la fase móvil.
de las bandas.
𝐂𝐄
𝐊𝐬 =
𝐂𝐌
a) Cromatograma original con picos superpuestos.
b) Mejora conseguida por un incremento en la La constante de distribución es constante en un intervalo amplio de concertaciones del soluto,
separación de las bandas. eso significa que CE es directamente proporcional a CM.
c) Mejora conseguida por una disminución en los anchos
de las bandas.
Velocidades de migración de los solutos Velocidades de migración de los solutos
➢ Tiempo de retención (tR): es el tiempo entre la inyección de la muestra y la aparición de un ➢ Factor de retención (kR): esta relacionado con la velocidad a la que el soluto migra a través
pico de soluto en el detector de una columna cromatográfica. de la columna. Es la cantidad de tiempo que un soluto pasa en la fase estacionaria en
relación con el tiempo que pasa en la fase móvil.
𝐭𝐑 = 𝐭𝐌 + 𝐭𝐄
𝐭𝐑 − 𝐭𝐌 𝐭𝐄
𝐤𝐑 = =
𝐭𝐌 𝐭𝐌
Donde,
• tM es el tiempo muerto, tiempo que le toma ➢ Factor de selectividad (α): se define como la relación entre la constante de distribución del
a una especie química no retenida atravesar soluto retenido con más fuerza (B) y la constante de distribución del soluto retenido con
una columna cromatográfica. Todos los menos fuerza (A).
componentes pasan por lo menos esta
𝐊𝐁
cantidad de tiempo en la fase móvil. 𝛂=
𝐊𝐀
• tE es el tiempo que pasa el analito retenido
en la fase estacionaria. El factor de selectividad para dos analitos en una columna brinda una medida de cuan bien
van a ser separados estos dos analitos en dicha columna.
Ensanchamiento de banda y eficiencia de la columna Ensanchamiento de banda y eficiencia de la columna
La eficiencia de una columna cromatográfica se ve afectada por la cantidad de Dos términos se utilizan ampliamente como medidas cuantitativas de la eficiencia de una
ensanchamiento de banda que ocurre a medida que un compuesto pasa por la columna. columna cromatográfica:
• La altura de plato, H.
Ensanchamiento de banda: fenómeno que se produce cuando la banda de la muestra se
• El número de platos o cantidad teórica de platos, N.
distorsiona y se ensancha al pasar por los componentes del sistema cromatográfico antes de
llegar al detector.
Los dos están relacionados por la ecuación:
𝐋
𝐍=
𝐇
donde L es la longitud (generalmente en centímetros) del relleno de la columna.
La eficiencia de la columna cromatográfica se incrementa a medida que el número de platos
N aumenta y conforme la altura del plato H se reduce.
Ensanchamiento de banda y eficiencia de la columna Ensanchamiento de banda y eficiencia de la columna
Número de platos tóricos (N): indica la capacidad de ¿De donde provienen los conceptos de plato y altura de plato?
una columna para retener de manera diferencial los
solutos. Un mayor número de platos teóricos El origen de los términos “altura de plato” y “cantidad de platos teóricos” proviene de uno de
significa una mayor retención, lo que implica una los primeros estudios teóricos realizados donde trataron a una columna cromatográfica como
mayor permanencia y más niveles separativos. si fuera similar a una columna de destilación que estuviera constituida por numerosas capas
angostas, o platos, distintos pero contiguos, a las que denominaron platos teóricos. Se suponía
que en cada plato se establecía el equilibrio de la especie entre las fases móvil y
Altura de plato (H): parámetro que describe la estacionaria. El descenso del soluto por la columna se trataba entonces como una
eficiencia de una columna cromatográfica. transferencia por etapas de fase móvil equilibrada de un plato al siguiente.
Representa la longitud de la columna necesaria para
un "plato teórico", una sección de la columna en la Sin embargo, el modelo de platos no explica adecuadamente el ensanchamiento de banda
que se asume que el equilibrio de partición entre la debido al supuesto básico de que las condiciones de equilibrio prevalecen a lo largo de toda la
fase móvil y la fase estacionaria es completo. Cuanto columna, y no es así, ya que en una columna cromatográfica el estado es dinámico, las fases se
menor sea la altura de plato, mayor es la eficiencia transfieren una a la otra lo suficientemente rápido para evitar que haya equilibrio.
de la columna.
Ensanchamiento de banda y eficiencia de la columna Variables que afectan a la eficiencia de la columna
Determinación del número de platos en una columna: El ensanchamiento de banda refleja una pérdida en la eficiencia de la columna. Cuanto más
lenta sea la velocidad de los procesos de transferencia de masas que ocurren mientras un
El número de platos teóricos (N) y la altura del plato (H) son ampliamente utilizados en la soluto migra a través de la columna, tanto más ancha será la banda que sale de la columna.
bibliografía química y por los fabricantes de instrumentos como una medida del desempeño
de una columna.
La siguiente figura muestra como se puede determinar N a partir de un cromatograma. Se
mide el tiempo de retención de un pico tR y el ancho del pico en su base W (en unidades de
tiempo).
𝟐
𝐭𝐑
𝐍 = 𝟏𝟔
𝐖
Resolución de la columna cromatográfica Resolución de la columna cromatográfica
La resolución (Rs) de una columna nos indica cuan separadas están dos bandas en relación con
su anchura. La resolución proporciona una medida cuantitativa de la capacidad de la
columna para separar dos componentes A y B.
La resolución de cada columna se define como:
𝟐(𝐭 𝐑𝐁 − 𝐭 𝐑𝐀 )
𝐑𝐬 =
𝐖𝐀 + 𝐖𝐁
La resolución para una fase estacionaria dada puede mejorarse alargando la columna, y por lo
tanto, incrementando el número de platos. Sin embargo, los platos añadidos producen un
aumento en el tiempo para separar los componentes.
Resolución de la columna cromatográfica Resolución de la columna cromatográfica
MÉTODOS PARA MEJORAR LA RESOLUCIÓN DE DOS SUSTANCIAS EN UNA COLUMNA: 2) Variación en el factor de retención:
1) Variación en la altura de plato: Comúnmente, una separación se puede mejorar de manera significativa mediante la
manipulación del factor de retención. El aumento en el factor de retención por lo general
La resolución de una columna mejora a medida que el número de platos aumenta, sin mejora la resolución.
embargo, aumentar el número de platos no tiene ningún efecto en términos de tiempo, a
menos que el aumento se consiga reduciendo la altura de plato y no aumentando la longitud 3) Variación en el factor de selectividad:
de la columna.
Se debe buscar un medio para incrementar el factor de selectividad mientras el factor de
Los métodos para minimizar la altura de plato incluyen: variación se mantiene en condiciones óptimas. Hay cuatro opciones disponibles:
• La reducción del tamaño de la partícula del material de empacamiento • Cambiar la composición de la fase móvil.
• El diámetro de la columna. • Modificar la temperatura de la columna.
• El grosor de la película líquida. • Variar la composición de la fase estacionaria.
• La optimización de la velocidad del flujo de la fase móvil. • Utilizar efectos químicos especiales.
El proceso de separación en cromatografía de gases El proceso de separación en cromatografía de gases
En cromatografía de gases se hace pasar el analito en forma gaseosa a través de la columna, Diagrama esquemático de un cromatógrafo de gases:
arrastrado por una fase móvil gaseosa (normalmente He, N2 o H2), llamada gas portador.
• En la cromatografía gas-líquido de reparto, la fase estacionaria es un líquido no volátil que
recubre la pared interior de una columna o un soporte sólido.
• En la cromatografía gas-sólido de adsorción, el analito se adsorbe directamente sobre las
partículas sólidas de la fase estacionaria.
La muestra de un líquido volátil o de un gas se inyecta a través de un septo (diafragma de
silicona) en un inyector caliente, en cuyo interior se evapora rápidamente. El vapor es
arrastrado a través de la columna por el gas portador. La columna debe estar lo
suficientemente caliente para que los analitos alcancen una presión de vapor adecuada y
eluyan en un tiempo razonable. Los analitos después de separados llegan al detector, cuya
respuesta aparece en la pantalla de un ordenador o en un registrador.
El proceso de separación en cromatografía de gases Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)
En la inmensa mayoría de los análisis se utilizan columnas tubulares abiertas, largas y ➢ La cromatografía de líquidos es importante porque la mayoría de los compuestos no son
estrechas como soporte y como protección contra la humedad atmosférica, por donde circula suficientemente volátiles para que se les pueda aplicar la cromatografía de gases.
el gas portador y la muestra.
➢ La cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) utiliza una presión elevada para
➢ Columna tubular abierta de pared forzar al disolvente a que pase por una columna que contiene partículas muy finas,
recubierta: la fase estacionaria líquida consiguiendo así separaciones de gran resolución.
recubre el interior de la columna.
➢ La HPLC se basa en los mismos principios que la cromatografía líquida convencional, pero
➢ Columnas tubular abierta recubiertas de con una fase estacionaria que es resistente a elevadas presiones. Esto permite separar los
soporte: la fase estacionaria líquida recubre componentes de una mezcla de forma rápida y con gran resolución.
a un soporte sólido, que se encuentra unido
a la pared interior de la columna. ➢ La HPLC es una técnica analítica que permite separar, identificar, cuantificar y purificar
mezclas complejas de sustancias.
➢ Columna tubular abierta de capa porosa: la
pared interior está recubierta de una fase
estacionaria sólida.
Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)
El funcionamiento de la HPLC es el siguiente: El equipo de HPLC consta de un sistema de suministro de disolvente, una válvula de inyección
de muestra, una columna de alta presión, un detector y un ordenador para controlar el equipo
1. Se inyecta la muestra en una columna, que es la fase estacionaria. y visualizar los resultados.
2. La fase móvil, que actúa como portador de la muestra, circula en contacto con la fase
estacionaria, y es impulsada con una bomba de alta presión.
3. Los componentes de la muestra se separan debido a las interacciones químicas que
tienen con las fases.
4. Cada componente interactúa de forma ligeramente diferente con el material adsorbente
de la columna, lo que produce velocidades de flujo variables para cada componente.
5. Cada componente de la muestra eluye de la columna con un tiempo diferente, lo que
permite separarlos.
