TEMA 8- MÉTODOS DE SECUENCIACIÓN DE ÁCIDOS
NUCLEICOS
1. La secuenciación de los ácidos nucleicos
Proceso de determinación de la secuencia de nucleótidos que componen una molécula de
ADN o ARN y que se representa por las iniciales de las BN que portan.
En el caso de una molécula monocatenaria se transcribe como una cadena de letras que se
inicia en el extremo 5’ y finaliza en el 3’. En el caso de moléculas de ADN bicatenario se
transcribe sólo la secuencia de la cadena 5’- 3’, puesto que la secuencia 3’- 5’ es la
complementaria.
1.1. Métodos enzimáticos de terminación en cadena
Son métodos enzimáticos basados en reacciones de polimerización de cadenas
complementarias a la que se quiere secuenciar.
A la mezcla se añade didesoxinucleótidos trifosfato (ddNTP) que son desoxinucleótidos
que carecen del grupo 3’- OH necesario para formar un nuevo enlace fosfodiéster. Cuando
los ddNTP se incorporan a una cadena de ADN en crecimiento actúan, por tanto, como
terminadores de cadena y detienen la síntesis. El original diseñado por Sanger para ADN
monocatenario consta de 4 fases:
I. Reacciones de polimerización
La muestra se divide en 4 alícuotas para la realización de 4 reacciones de
polimerización, una por cada BN. Cada tubo de reacción contiene: hebra molde de
ADN, un cebador marcado con 32P en 5’ y en el 3’ el complementario de la hebra
molde, ADN polimerasa, los 4 dNTP y 1 de los 4 ddNTP que marca la especificidad
de cada reacción, se encuentra en una concentración mucho menor que los dNTP,
200 veces menor aprox.
Durante la reacción, la ADN pol. extiende el cebador marcado, sintetizando una
cadena de ADN complementaria de la hebra molde, hasta que, por azar, incorpora
un ddNTP, lo que detiene la elongación.
La cantidad de ADN, la proporción de ddNTP respecto a los dNTP y las
condiciones garantiza la síntesis de todos los fragmentos posibles en cada tubo de
reacción. Todos los fragmentos están marcados radiactivamente por el marcaje del
cebador.
II. Electroforesis en gel
Las cadenas de nueva síntesis se separan de las hebras molde mediante
desnaturalización por calor y se someten a electroforesis de alta resolución en gel de
poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes. En estas condiciones, los
fragmentos marcados se separan por tamaño con una resolución de un solo
nucleótido.
Los productos de las cuatro reacciones se corren en paralelo en calles adyacentes del
mismo gel.
III. Autorradiografía del gel
Proporciona en las 4 calles del gel un patrón de bandas oscuras, correspondientes a
los distintos fragmentos producidos en las reacciones de polimerización.
IV. Análisis de la autorradiografía
En cada calle, el último nucleótido (posición 3’) del fragmento que representa cada
banda es el ddNTP que se añadió en el tubo correspondiente. En consecuencia, se
puede determinar la secuencia completa según el orden escalonado de las bandas en
las 4 calles del gel, realizando la lectura de abajo arriba de la autorradiografía (los
fragmentos más cortos migran más rápidamente que los largos).
Hay que tener en cuenta que la secuencia se lee directamente de la autorradiografía
correspondiente a la cadena de nueva síntesis en dirección 5’- 3’, por lo que la
secuencia de la hebra molde será la complementaria e irá en sentido contrario a la
leída.
2. Secuenciación automática de 1ª generación
Se basa en el método enzimático de terminación en cadena de Sanger y en el uso de cuatro
fluoróforos como marcadores. Se utilizan instrumentos automáticos, los secuenciadores
automáticos de 1ª generación, en los que se automatizan las fases de la electroforesis (en gel
o capilar), la detección de las bandas fluorescentes y el análisis de los resultados. Las
reacciones de polimerización se realizan fuera del secuenciador.
Secuenciadores automáticos
Aparatos automáticos capaces de analizar la mezcla de fragmentos obtenida en una
reacción de secuenciación enzimática para obtener la secuencia correspondiente. Se
compone de:
● Sistema de electroforesis para separar por tamaño los fragmentos fluorescentes
generados en la reacción de secuenciación, con un poder de resolución de un
nucleótido. Es decir, es capaz de separar fragmentos cuyo tamaño difiere en un solo
nucleótido.
● Sistema de detección de las bandas fluorescentes generadas por cada fragmento
marcado.
● Software que traduce la información recogida por el detector en gráficos de
secuencia.
2.1. Reacciones de polimerización. PCR
El proceso que limita la eficiencia de la secuenciación Sanger son las reacciones de
polimerización. En este sentido, el desarrollo de las técnicas de PCR y su incorporación al
método han contribuido a aumentar su eficacia considerablemente.
En lugar de reacciones de polimerización con una ADN polimerasa convencional no
termoestable del método originario de Sanger, se realizan PCR de secuenciación con un
único cebador. La PCR proporciona 2 grandes ventajas:
● Se requiere mucha menor cantidad del ADN que se pretende secuenciar.
● Se puede secuenciar a partir de una mezcla compleja de moléculas de ADN
bicatenario.
Se pueden realizar dos PCR consecutivas y acopladas:
● La 1ª una PCR convencional de amplificación, con un par de cebadores, para
amplificar el fragmento de ADN que queremos secuenciar. NO es necesario.
● La 2ª una PCR de secuenciación, con uno solo de los cebadores empleados en la
anterior, que utiliza como ADN molde los amplicones de la 1ª PCR. SIEMPRE se
hace. La PCR de secuenciación puede ser de dos tipos, dependiendo de cómo se
introduzca el marcaje fluorescente en los fragmentos polimerizados: secuenciación
por terminador fluorescente o secuenciación con cebador fluorescente.
I. Secuenciación por terminador fluorescente
Se realiza una única PCR (un solo tubo), donde se marcan los cuatro ddNTP, cada
uno con un fluoróforo distinto (el cebador que se utiliza sin marcar) y se añade al
tubo los 4 ddNTP marcados en la proporción adecuada respecto a los dNTP sin
marcar.
Al finalizar la PCR, el tubo contiene una mezcla de todos los fragmentos posibles
marcados con los 4 fluoróforos distintos, dependiendo del ddNTP situado en el 3’.
El producto se carga directamente en el secuenciador y es el método más utilizado.
2.2. Fases automatizadas en secuenciador
I. Electroforesis
Los instrumentos de secuenciación automatizada de 1ª generación se diferencian
según el sistema de electroforesis que emplean. Estos pueden ser:
● En gel: utilizan geles planos de poliacrilamida ultrafinos (< 200 microm de
grosor), en los que se pueden cargar hasta 96 muestras distintas. La velocidad
de lectura depende del grosor del gel y de las condiciones de electroforesis,
siendo normal una velocidad de 200 bases por hora y por muestra.
● Capilar: utilizan capilares de sílice fundida con un diámetro entre 10 y 200
microm que contienen un polímero como soporte para la electroforesis. Las
de mayor capacidad tienen 96 capilares, una velocidad de lectura alrededor de
500 bases por hora y posibilidad de varias recargas automáticas.
II. Detección
Se sitúa en la porción inferior del gel o del capilar y consiste en un láser que excita el
fluoróforo y un sistema de detección con varios canales para poder detectar distintos
fluoróforos.
Cuando un fragmento de ADN marcado alcanza la ventana de lectura del sistema de
detección, el láser excita el fluoróforo que emite fluorescencia de una longitud de
onda determinada, la cual es captada por el detector y es reflejada como un pico de
fluorescencia de un color determinado en una gráfica denominada electroferograma.
A - verde T - rojo G - negro C - azul
III. Interpretación de los resultados
Dado que la secuenciación automática posibilita secuenciar moléculas bicatenarias,
la interpretación de los resultados va a depender del cebador utilizado en la PCR de
secuenciación:
● Si es forward, la secuencia obtenida en el secuenciador coincide con la de la
cadena 5’- 3’ de la molécula bicatenaria que estamos secuenciando, y por
tanto, con la secuencia que representa esta molécula.
● Si es reverse, la secuencia obtenida en el secuenciados es la complementaria y
en sentido inverso de la secuencia 5’- 3’ que representa la molécula que se
secuencia (al igual que en el método Sanger).
3. Secuenciación automática de 2ª generación: secuenciación masiva o NGS
Plataforma automática para la secuenciación de genomas completos individuales basada
en diferentes tecnologías que permiten obtener resultados en poco tiempo y bajo coste.
Consta de tres fases: Preparación del ADN molde, reacción de secuenciación y análisis de
los datos.
3.1. Preparación del ADN molde
Al final, los diferentes ADN molde se inmovilizan sobre una superficie sólida o soporte
separados físicamente unos de otros, lo que permite realizar cientos de miles o millones de
reacciones de secuenciación simultáneas. Los pasos son:
● Fragmentación al azar del genoma por métodos
físicos o enzimáticos.
● Enriquecimiento (opcional) para seleccionar las
regiones de interés que se quieren secuenciar.
esto puede conseguirse de dos formas
➔ Captura por hibridación en fase sólida,
mediante microarrays con
oligonucleótidos complementarios de las
regiones que se quieren secuenciar.
➔ Mediante PCR múltiplex con cebadores
específicos de las regiones que se quieren
secuenciar.
● Unión a los extremos de cada fragmento de dos adaptadores universales. De esta
manera se obtiene una biblioteca de fragmentos con extremos universales, que
puede ser amplificada en su totalidad con un solo juego de cebadores
complementarios de los adaptadores.
● Selección de los fragmentos de la biblioteca que tienen el tamaño adecuado para la
posterior reacción de secuenciación (200-500 pb) y amplificación clonal de estos
para asegurarse un mejor rendimiento en la secuenciación. Con esta estrategia se
pretende aumentar el número de copias de cada fragmento sin que se mezclen unos
con otros; es decir, obtener clones de cada fragmento. Hay dos métodos basados en
PCR: PCR en emulsión y la PCR en fase sólida o PCR puente.
I. PCR en fase sólida o PCR puente
Se realiza sobre una superficie a la que se fijan ambos
cebadores universales con una alta densidad.
1. Los fragmentos de la biblioteca de tamaño adecuado se
desnaturalizan y las cadenas individuales se anclan también a
la superficie en una proporción que garantice cierto
distanciamiento entre ellas. Cada cadena de ADN molde
queda, por lo tanto, rodeada de múltiples cebadores
universales.
2. El conjunto se inunda con una mezcla de PCR sin primers
(están fijos sobre la superficie) y se inicia el proceso de
amplificación. En cada ciclo de PCR:
● En la fase de hibridación, el adaptador del
extremo libre de cada fragmento de ADN molde hibrida con
el cebador universal complementario más próximo, formado un puente sobre
la superficie.
● En la fase de extensión, se sintetiza una nueva cadena complementaria.
● Durante la fase de desnaturalización del siguiente ciclo, ambas cadenas se
separan, permaneciendo ancladas a la superficie y muy próximas físicamente.
El resultado final es la generación de clusters o clones de cada uno de los fragmentos
de la biblioteca de partida, cada uno de ellos con miles de copias idénticas agrupadas
en un espacio inferior a 1 microm de diámetro. Con esta tecnología se pueden
generar alrededor de 10 a la 7 clusters por centímetro cuadrado de superficie.
3.2. Reacción de secuenciación y análisis de datos
Existen varias tecnologías que permiten realizar millones de reacciones individuales
simultáneas y registrar los datos originados en cada una de ellas. Los 3 métodos más
utilizados tienen como características comunes que son cíclicos y no electroforéticos. Son la
terminación reversible cíclica, la pirosecuenciación y la secuenciación ion torrent.
I. Terminación reversible cíclica
El método de terminación reversible cíclica se basa en la utilización de dNTP
marcados con un fluoróforo y bloqueados para impedir que se puedan unir más
nucleótidos, por lo que actúan como terminadores de cadena. Cada uno se marca
con un fluoróforo distinto. Además, la unión con el fluoróforo y el agente
bloqueante son reversibles, de manera que al eliminarlos el nucleótido revierte a su
estructura normal y permite la incorporación de nuevos nucleótidos a la cadena en
crecimiento.
La reacción se inicia uniendo uno de los cebadores universales al extremo libre de los
fragmentos de ADN molde inmovilizados. A continuación, se desarrollan ciclos de
tres fase:
● Incorporación de un terminador reversible marcado: el soporte se inunda con
una solución de ADN polimerasa y los cuatro dNTP marcados y
bloqueados. La ADN polimerasa se une al híbrido ADN molde/cebador e
incorpora el primer nucleótido de la nueva cadena (no puede continuar
polimerizando porque el nucleótido está bloqueando).
● Lectura de la fluorescencia del soporte: se lavan los dNTP no incorporados, se
excita el soporte con un láser y se registra la fluorescencia emitida en cada
punto del soporte, que coincide con la posición ocupada por cada cluster de
ADN molde y que será del color correspondiente al fluoróforo que porta el
nucleótido incorporado. Tras cada lectura se obtiene una matriz de puntos
de cuatro colores (un punto por cada cluster de ADN molde presente en la
placa).
● Eliminación del fluoróforo y del agente bloqueante mediante una reacción
química: de esta manera, en el siguiente ciclo se puede incorporar un nuevo
nucleótido a la cadena.
La lectura de los colores de las sucesivas matrices en cada punto permite descifrar la
secuencia de cada uno de los millones de fragmentos presentes en la placa.
La ingente cantidad de datos generada por los secuenciadores de 2ª generación es
analizada mediante programas potentes que son capaces de ordenar todas las
secuencias con base en repeticiones y solapamientos hasta alcanzar la secuencia
completa del genoma del individuo del que se obtuvo el ADN de partida.
4. Secuenciación de 3ª generación
Plataformas automáticas diseñadas para secuenciar moléculas únicas de ADN sin
necesidad de amplificación clonal previa, como ocurre con los de 2ª generación.
4.1. Secuenciación por nanoporos
Método de secuenciación en tiempo real sin reacción de polimerización y sin marcajes,
basado en [Link] biosensor consta de una membrana bicapa, resistente
eléctricamente y sometida a cierto voltaje, atravesada por un nanoporo proteico con un
microelectrodo.
Por el nanoporo fluye de manera continuada una corriente iónica que genera una
corriente eléctrica basal detectada por el electrodo. Cualquier molécula que atraviese el
nanoporo provoca una alteración en la corriente basal, cuya magnitud es característica de la
molécula en cuestión, lo que permite identificarla.
Para secuenciar una molécula de ADN, basta con hacer pasar una de las cadenas por el
nanoporo.
Cada base produce una señal característica, por lo que la secuenciación se produce
simultáneamente al paso de la molécula por el nanoporo. Es un método muy rápido y la
tecnología empleada se puede miniaturizar, abriendo las puertas a los secuenciadores
portátiles y de bolsillo.
Tema 5
