CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA PRESIÓN (HPLC)

Jack Kirkland (izq.) con Glen Wallace frente a un HPLC “casero” HPLC Waters GPC-100 (1963)

●
Es la técnica de separación con mayor difusión y las más empleada en la
industria.
●
Gran cantidad de modelos, configuraciones y aplicaciones especiales.
●
Permite analizar cualquier sustancia en solución.
 Según Naturaleza de la Fase Estacionaria
●
Papel
●
Capa Delgada (TLC)
●
Columna por gravedad
●
HPLC

Según Interacción con la Fase Estacionaria

●
Interacción Química
●
Adsorción
●
Fase Ligada (NP-LC y RP-LC)
●
Intercambio Iónico (IEC)
●
Interacción Física (tamaño molecular)
●
Filtración por geles
●
Permeación por geles

Según la Cantidad de Muestra Analizada

●
Preparativa
●
Analítica
 CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA

Método Técnica Fase estacionaria Tipo de equilibrio

Líquido adsorbido sobre un
Reparto Distribución entre líquidos
sólido
Adsorción Sólido Adsorción
CL
Intercambio iónico Resina de Intercambio Iónico Intercambio iónico
Exclusión por Líquido en intersticios de un
Distribución/Exclusión
tamaños sólido polimérico

10 cm
Cromatografía Líquida de Alta Presión
Brazo automático
Circulación de Muestras a analizar
fluidos Inyector
Válvula

solventes

detector

bomba solvente B
bomba solvente A
columna

Fase móvil
descarte colector de fracciones
viales de fracciones

Mixer
Válvula
Desgasificador
bombas de alta presión Bomba de purga

●
Muy habitual en determinaciones cuantitativas.
●
Permite modificar la composición de la fase móvil a medida que transcurre la
separación.
●
Pueden emplearse múltiples columnas y detectores en serie para optimizar la
separación/detección.
●
Las muestras deben ser líquidas (ó solubles) y filtrarse < 0,45μm (0,2 μm para muestras
complejas)
Fase móvil:

1. Pureza.
2. Baja Absorción UV a Longitudes de
Onda Críticas: proveen ruidos bajos
de fondo y estabilidad en la línea
base sin puntos máximos extraños.
3. Baja Fluorescencia: prevee
sensibilidad máxima con detección
de fluorescencia. 1
4. Bajos residuos después de la 2
Evaporización: prevee vida de
columna larga y permite la
recolección de componentes puros
3
de la muestra.
5. Contenido de Agua Reducido y
4
Controlado: prevee separaciones 5
reproducibles, especialmente para
aplicaciones para aplicaciones de
fases normales.

Los solventes o soluciones que se emplean en HPLC

deben filtrarse y desgasificarse previo a su utilización .
La solución muestra debe ser
soluble en la fase móvil.

Los gradientes de
concentración deben
seleccionarse entre solventes
compatibles.

La selección de solvente
impacta en la perfomance y la
vida útil de la columna.
 Sistema de bombeo:

●
Los caudales para cromatografía analítica
varían entre 0,2 -3 ml/min y puede llegar a 15
ml/min en HPLC preparativa.
●
Presiones de hasta 500 bar
●
Bombas “reciprocantes”.
●
Para elución con gradientes la mezcla puede Bomba de desplazamiento positivo
realizarse a alta o baja presión.

PRESIÓN
BOMBA A
BOMBA B

TIEMPO
Sistema empleado para mantener homogéneo el caudal

●
Mezcla a baja presión ●
Mezcla a alta presión
●
Permite hasta 4 solventes ●
Permite hasta 2 solventes
●
Mayor tiempo muerto de ●
Menor tiempo muerto de
bombeo bombeo
●
Formación de burbujas con ●
Mayor reproducibilidad de
alguna mezclas bombeo
 De De
bo la bo la
Sistema de inyección: mb
a loop
mb
a
loop

MANUAL.
Válvula de seis vías.
Volumen de inyección fijo (loop)
5-100 μl
Gran reproducibilidad. CARGA (baja presión)
INYECCION

AUTOMATICA.
Volumen de inyección variable 1-50 μl
La reproducibilidad debe verificarse.
Inyector manual tipo Rheodyne
La linealidad no es buena

PURGA CARGA INYECCIÓN

Fase estacionaria:
Columnas

Consumo de solventes Sensibilidad relativa Comparación id

La resolución cromatográfica de
Altura de plato teórico

acuerdo al tamaño de partícula

del relleno.

Sistemas actuales incrementan la

resolución disminuyendo el
consumo de solventes

Velocidad lineal (cm/s)

Sistema de detección: UV-Visible – longitud de onda fija
Sistema de detección: UV-Visible / Arreglo de diodos (UV-DAD)

Detalle de celda de flujo:

Lámpara VIS

Lente acromático
s
diodo
lo de
Lámpara UV Celda de Arreg
flujo

Filtro de Ho

Elemento
dispersivo

Ampliamente difundido.

Se obtiene un cromatograma de tres

dimensiones:
1) tiempo (min.)
2) absorbancia (UA)
3) longitud de onda, λ (nm)
tie
mp
o Permite “identificar” compuestos
m)
λ (n

Evaluación de impurezas
Sistema de detección: Indice de Refracción Fase móvil Otra cosa

Lámpara de W

Lente colimador
Detector
Filtro de vidrio
Intercambiador de calor

n1 n1
Lente colimador

Celda de flujo
Detector universal
Muy sensible a cambios en la temperatura y
Espejo al flujo pulsante de las bombas
Exclusivamente para elución ISOCRÁTICA
Demora varias horas en estabilizar
Baja sensibilidad
 Detector de Fluorescencia:
Elución de la a columna
●
Ciertos compuestos orgánicos pueden Monocromador
de EXCITACIÓN Celda de flujo
emitir una fracción de la luz absorbida a
otra longitud de onda (λexcitación ǂ λemisión).
Fuente
●
Son extremadamente sensibles y de luz salida

específicos. Monocromador
de EMISIÓN
●
Derivatización con grupos fluoróforos.
Detector

Detector de Conductividad:
●
Especialmente empleado para
Detector cromatografía iónica.
●
La corriente que se detecta depende de
Electrodos
las especies iónicas y de la concentración.
●
Si se emplean gradientes, la fuerza iónica
Fase móvil
debe permanecer constante.
Sistema de detección: Relación señal / Ruido (SNR)

●
Se debe lograr una determinada relación señal/ruido
para asegurar la estabilidad del sistema cromatográfico.

●
Limite de detección (LOD) : es la concentración del
SEÑAL analito que producirá una relación señal/ruido de 3.

●
Límite de cuantificación (LOQ): cantidad más pequeña
de un analito que se pueda cuantificar confiablemente.
Suele considerarse 3,3 x LOD:

LOQ= 3,3xLOD
RUIDO
Detector de Masas:

●
Son los más sensibles, selectivos y
costosos.
●
Poseen gran versatilidad.
●
Mayor desarrollo en los últimos 10 años.
●
Requiere experiencia previa en la
operación.
Espectro MSMS

Digestión Purificación Análisis MS

Separación
Espectro MSMS (biblioteca)
 Espectro de masas:

●
Permite obtener información de la
estructura química de la muestra.

●
Debido a los re-ordenamientos los
espectros son muy específicos.

●
Variedad de analizadores.

●
El espectro se obtiene en tiempo
real.

●
Puede discrimnar ciertos isómeros
orgánicos.
Detección múltiple:

UV-signal

248/411
241/394

270/388

247/504
302/420
WL
WL
WL
Fluorescence

WL
WL
PAH's extracted from soil;
Sup.LC-PAH 150x4.6mm;
Solv.: H2O/CH3OH= 10:90

Flecainide in
Serum

UV signal

FL signal

Therapeutic concentration: 1.8mg/l, 20ul injected

UV and fluorescence signal
 Buenas prácticas:
ESTABILIDAD del equipo/detector
Reactivos y material de calidad adecuada.
Registros de funcionamiento, control de
columnas.