MAGÍSTER EN DIAGNÓSTICO MOLECULAR PARA SU APLICACIÓN EN EL
LABORATORIO CLÍNICO E INVESTIGACIÓN
AMPLIFICACION DE ADN POR PCR
LABORATORIO
Objetivo General:
- Aplicar la técnica de PCR para obtener amplificados de regiones específicas de diferentes genes
en distintos tipos de muestras y reconociendo las variables analíticas que influyen la técnica
de PCR.
Objetivos Específicos:
1. Realizar la detección de los genes constitutivos de β-actina y β-globina mediante la
técnica de PCR
2. Realizar la detección del virus HTLV en DNA extraído de sangre mediante la
amplificacion del gen tax
3. Realizar curva de calibración para la detección de un gen housekeeping utilizando
PCR en tiempo real
Introducción:
La reacción en cadena de la polimerasa más comúnmente conocida como PCR (Polymerase
Chain Reaction) es una de las técnicas de biología molecular más ampliamente utilizada en varios
campos de las ciencias, tanto en investigación y desarrollo como en diagnóstico. El objetivo final
de la técnica de PCR es la obtención de millones de copias idénticas entre sí e idénticas a la
secuencia inicial de un segmento definido de ADN delimitado por un par de oligonucleótidos
llamados partidores (primers). Estos partidores hibridan con una secuencia específica
denominada secuencia blanco.
Las aplicaciones de la técnica de PCR en el ámbito del laboratorio clínico son amplias aplicándose
en las áreas de hematología, microbiología, bioquímica, banco de sangre e inmunología entre
otras.
La técnica de PCR imita el proceso de replicación del ADN en los organismos eucariontes y
procariontes, obteniendo al final del proceso dos cadenas de ADN doble hebra idénticas. La PCR
por lo tanto es una replicación “in vitro” ya que llevamos al laboratorio este proceso biológico.
La técnica de PCR requiere los mismos componentes que encontramos en el proceso de
replicación del ADN in vivo, donde se necesita:
• ADN molde, necesario para la síntesis de una nueva hebra de ADN. Este ADN puede
ser doble hebra linear o circular.
• ADN polimerasa, es la enzima encargada de llevar a cabo el proceso de
polimerización de la nueva hebra de ADN a partir de una hebra molde. La enzima
más comúnmente utilizada es la Taq polimerasa.
• Desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs), son las unidades fundamentales, los
monómeros, que la ADN polimerasa va agregando uno a uno en el proceso de
polimerización de la nueva hebra de ADN.
• Mg++, cofactor de la enzima ADN polimerasa
• Partidores (Primers), que se unen a la secuencia blanco con dos funciones, primero
la unión al ADN molde para crear el segmento doble hebra necesario para la unión
de la ADN polimerasa y segundo delimitar el segmento de ADN que queremos
amplificar.
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• Buffer y sales, entregan el medio óptimo para llevar este proceso enzimático bajo
condiciones estándar.
La reacción de PCR ocurre mediante 3 pasos consecutivos:
1. Desnaturalización: Ocurre a 94°C - 96°C y permite la separación de la doble hélice en 2 hebras
sencillas, eliminación de estructuras secundarias.
2. Alineación o hibridación: entre 50-65°C. Los partidores se unen a sitios específicos en cada
hebra del ADN, la temperatura depende de la temperatura de hibridación (Tm) de los
partidores.
3. Extensión o elongación: Ocurre a 68 - 72°C, en este paso la enzima DNA polimerasa adiciona
los nucleótidos, al extremo 3´libre de los partidores, usando como molde la secuencia original.
Estos pasos se repiten entre 30 a 40 veces para lograr la amplificación del fragmento de interés.
Notas Técnicas:
• Para compensar la baja fidelidad de la Taq polimerasa se recomienda usar un número
de ciclos entre 30-40.
• La concentración de dNTPs debe ser por igual para los cuatro.
• La concentración de magnesio debe estar estandarizada y por lo general fluctúa entre
1 a 3.5 mM.
• Recuerde que los dNTPs puede unir Mg++ por lo que las concentraciones de ambos
siempre deben guardar la misma relación.
• La muestra de ADN extraído debe tener una buena pureza y calidad, para evitar el
efecto de inhibidores en la reacción de PCR y poder amplificar los fragmentos de
interés.
• La Tm de hibridación de ambos partidores debe ser similar, pudiendo variar máximo
en ±5°C para que ocurra la hibridación con el ADN de interés.
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Escuela de Tecnologia Medica
Facultad de salud
Optimización de la Reacción de la Polimerasa en Cadena (PCR)
La PCR es un poderoso método para amplificar de manera rápida secuencias específicas de ADN
in vitro, pero no existe una única condición que sea óptima para todas las reacciones de PCR,
por lo que cada reacción requiere optimización específica, incluso la replicación de un protocolo
ya optimizado debe ser optimizado a nivel local (en nuestro laboratorio) debido a las diferencias
en las condiciones de trabajo, como puede ser el equipo de amplificación de diferente marca
por ejemplo.
Si no tenemos la reacción optimizada puede ocurrir que no obtengamos la amplificación del
producto deseado, que exista amplificación de productos inespecíficos o que obtengamos una
baja eficiencia de amplificación.
La optimización de una PCR puede tomar tiempo y debe considerar varios pasos:
1. Calidad y concentración del ADN
2. Diseño y concentración de partidores
3. Concentración de Mg++
4. Concentración de dNTPs
5. Selección y elección de ADN polimerasa
6. Condiciones de reacción en el equipo (temperatura y tiempo)
7. Adición de potenciadores
La optimización de la PCR puede estar influenciada por cada uno de estos parámetros
individualmente como también por el efecto combinado interdependiente de cualquiera de
estos parámetros.
Todos los componentes del mix de PCR pueden añadirse a un tubo de libre de DNA/RNAasas en
cualquier orden excepto la Taq polimerasa la cual debe ir al final. No es necesario realizar la
mezcla sobre hielo si vamos a analizar DNA, pero si analizamos RNA se recomienda realizar la
mezcla en frío.
Las concentraciones estándar de los componentes del mix de PCR son las siguientes:
Templado ADN: 1 -1000 ng
Primers: 0.05 a 1 μM
MgCl2: 0.5 a 5 mM
dNTPs: 20 a 200 μM
Buffer PCR: 1X (1Mm Tris-HCl y 5 mM KCl)
ADN polimerasa: 0.5 a 2.5 U/50 μl (vol final)
Los productos de la reacción de PCR se analizan mediante electroforesis en gel de agarosa, cuya
concentración depende del tamaño del fragmento a analizar, donde fragmentos muy pequeños
requieren mayores concentraciones de agarosa. Al analizar el gel debemos poder ver la o las
bandas de interés de nuestra reacción.
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Parámetros para considerar en una óptima amplificación por PCR.
1. Calidad y concentración ADN: El método de extracción elegido debe proveer un ADN de
buena calidad, no degradado.
2. Diseño y concentración de partidores: EL diseño de partidores debe realizarse utilizando
un software de manera de obtener especificidad y eficiencia en la reacción. Los
partidores varían su tamaño entre 18 a 28 pb, ambos partidores deben tener
temperaturas de melting (Tm) similares, que no difieran más de 5ºC uno del otro; evitar
la complementariedad intra e intersecuencias para reducir la formación de dímeros de
partidor y deben tener un %CG entre 40 a 60%.
Una alta concentración de partidor puede resultar en la formación de dímeros y amplificación
de productos inespecíficos
1. Concentración de Mg++: Este ión es crítico para el éxito de la PCR debido a que afecta la
actividad y fidelidad de la ADN polimerasa, hibridación de los partidores y formación de
dímeros, entre otros. El exceso de Mg++ resulta en amplificación de productos
inespecíficos mientras una baja concentración de Mg++ reduce la cantidad de producto
de PCR o no ocurre el proceso de amplificación. Para optimizar la concentración de
Mg++ primero realizar una serie de reacciones de PCR a distintas concentraciones del
catión en aumento de 0.5 mM por reacción.
2. Concentración de dNTPs: hay dos tipos de presentaciones comerciales de este reactivo;
un premix de nucleótidos donde en el mix cada nucleótido tiene una concentración de
2.5 mM o soluciones de nucleótido individuales a una concentración de 10 mM. Los
dNTPs siempre debe incorporarse equimolar (cada uno de los nucleótidos debe tener la
misma concentración). Bajas concentraciones de dNTPs minimizan el error de base y
reduce la probabilidad de extender nucleótidos mal incorporados, lo cual se traduce en
un aumento de la especificidad y fidelidad de la amplificación.
3. ADN polimerasa: la enzima más usada es la Taq DNA polimerasa debido a su
termoestabilidad y procesividad. La vida media de la Taq DNA polimerasa es de 40
minutos a 95ºC, lo cual es suficiente para permanecer activa sobre 30 ciclos de
amplificación. Se utilizan concentraciones que van de 0.5 a 2.5 unidades de enzima/50
μl de reacción de PCR. Otra importante propiedad de la Taq ADN polimerasa es la
fidelidad, la cual es medida de la tasa de error. La tasa de error para la Taq ADN
polimerasa, la cual carece de actividad 3`--5` exonucleasa, es de 1 a 2 x10-5 nucleótido
errado por ciclo de amplificación.
4. Condiciones de ciclado: se debe estandarizar número de ciclos, temperatura y tiempo
de incubación de la denaturación, hibridación (annneling) y extensión del templado. El
número óptimo de ciclos de amplificación depende principalmente de la concentración
del ADN inicial. La amplificación exponencial de la PCR continua hasta el punto cuando
el producto alcanza cerca de 10-8 M, luego de esto la reacción entra en una fase lineal
donde la acumulación exponencial del producto comienza a atenuarse hasta llegar a la
fase plateau. En la mayoría de las reacciones de amplificación, esto se alcanza entre los
20 a 40 ciclos.
La optimización de la temperatura de hibridación es primordial para la amplificación del
producto de interés, esta temperatura depende del %CG del partidor, del tamaño y su
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concentración en la reacción. La temperatura de hibridación con la que se parte probando es
de 5ºC por debajo de la Tm de los partidores y luego se realiza un gradiente de temperatura
para ver a que temperatura obtengo una banda del tamaño deseado y sin amplificación de
productos inespecíficos. A mayor temperatura de reacción, mayor estrictez y especificidad.
La temperatura y tiempo de extensión también son parámetros para considerar, la
temperatura de extensión es por lo general de 72ºC y el tiempo depende de la concentración
del templado y el tamaño del producto de amplificación. El tiempo de extensión va a
depender de la procesividad de la ADN polimerasa, pero usualmente se considera que, para
un fragmento de 1000 pb, el tiempo de extensión es de 1 minuto.
En algunos casos, a pesar de haber optimizado todos los parámetros de la reacción, se siguen
obteniendo reacciones inespecíficas (Secuencias con alto %CG o estructuras secundarias), se
puede recurrir a la utilización de compuestos que potencian la amplificación. Los más
comúnmente usados son: DMSO (1-10%), glicerol (5-20%), formamida (1.25-10%), BSA (10-
100 μg/ml), sulfato de amonio (NH4)2SO4 (15-30 mM) gelatina (0.01%), detergentes no iónicos
(Tween-20 y Tritón X-100 0.05-0.1%), betaína (1-3 M) entre otros. Page Break
Controles para la Técnica de PCR
Para asegurarnos que las reacciones de amplificación están funcionando bien, se debe utilizar
controles en las reacciones, los cuales tienen distintas funciones. Los tres controles primordiales
que se deben utilizar son: Control Positivo, Control Negativo y Control Interno.
Control Positivo: Este control evalúa que los partidores y las condiciones de reacción son las
adecuadas para detectar la secuencia blanco. Se puede utilizar como control positivo una
muestra que ya se ha identificado como positiva o se puede incorporar algún oligonucleótido
sintético, para validar mi reacción.
Control Negativo: Se utiliza para descartar una contaminación de la amplificación, ya que
usualmente se utiliza agua en vez de ADN templado, por lo que no debemos obtener una
amplificación. Existen algunas variantes como:
Control negativo agua, es el más utilizado, éste evalúa si hay presencia de contaminación
(ADN exógeno) y se reemplaza la cantidad de muestra por la misma cantidad de agua
grado biología molecular.
Control negativo de blanco, éste control evalúa la especificidad de los partidores, se
reemplaza la cantidad de ADN de interés por la misma cantidad de ADN extraído de una
secuencia distinta, para la cual los partidores no tienen sitios de unión. Permite
determinar especificidad de la reacción.
Control Interno: Permite evaluar la presencia de inhibidores en la muestra y se amplifica una
secuencia distinta a la secuencia blanco pero que está contenida en el ADN. Usualmente son
genes constitutivos o “Housekeeping” o puede ser un oligonucleótido sintético que se agrega a
la mezcla de reacción. La secuencia del control interno siempre debe amplificar para validar un
resultado negativo como un verdadero negativo y no que sea un falso negativo por presencia de
inhibidores que bloqueen la amplificación de la secuencia blanco.
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DETECCIÓN DE LOS FRAGMENTOS PARA IDENTIFICACIÓN DE LOS GENES DE Β-ACTINA Y Β-
GLOBINA
El ADN humano extraído previamente en los laboratorios anteriores se utilizará para amplificar
una región de 540 pares de bases del gen de la β-actina, y una región de 268 pares de bases del
gen de la β-globina estos son genes constitutivos, para esto usted utilizará los partidores cuya
secuencia se muestra en la tabla Nº 1. La utilidad de realizar este ensayo es que al amplificar una
secuencia de un gen celular normal, que se espera que esté presente en todos los especímenes,
pueda ser utilizado como control interno. Esto tiene la ventaja que se puede comprobar la
integridad del ácido nucleico extraído al coamplificar el gen de interés (ej provirus de HTLV) y el
gen de la β- actina y/o β-globina. Al amplificar este último se puede descartar la presencia de
inhibidores de la PCR en la muestra clínica en caso de que se obtenga un resultado negativo en
la PCR del gen de interés
Es muy importante cuando se está implementando por primera vez una PCR, estandarizar la
técnica para la obtención de productos amplificados específicos, esta estandarización se realiza
principalmente para determinar la concentración adecuada de cloruro de magnesio y de
partidores, así como la temperatura de hibridación de los partidores.
RECUERDE QUE AL OPTIMIZAR UNA PCR DEBEMOS VARIAR SÓLO UN
PARÁMETRO A LA VEZ
Tabla 1. Secuencia de los partidores utilizados
Partidor Secuencia (5’ → 3’)
β-Actina F TCA TGT TTG AGA CCT TCA A
β-Actina R GTC TTT GCG GAT GTC CAC G
β-Globina F CAA CTT CAT CCA CGT TCA CC
β- Globina R GAA GAG CAA AGG ACA GGT AC
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Tabla 2. Mezcla de PCR para la amplificación del gen de β-actina y β- globina
Concentración final ul en la
Componentes …ul….X (Nº de
(en tubo) reacción
tubos)
H20 csp/20 ul
Buffer de PCR 10X 1X
MgCl2 50 mM 1.5 mM
dNTP´s 10 mM 0.2 mM
Partidor Forward 10uM 0.2 µM
Partidor Reverse 10uM 0.2 µM
Taq polimerasa 5 U/ul 1.0 U
Cantidad de ADN 100-500 ng
Volumen total (µL) 20
Tabla 3. Parámetros de amplificación en el termociclador
PCR convencional
Temperatura Tiempo
(ºC)
Denaturación inicial
95 4 min
95 30 seg
Amplificación
35 ciclos / PCR 55 30 seg
convencional
30 seg
72
Elongación
72 7 min
Enfriamiento
4
Control Negativo
Un tubo conteniendo todos los reactivos pero en ausencia de ADN, se incluye como control
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Análisis de los productos amplificados.
Se toman 10ul de cada producto de amplificación del gen de β-actina y β-globina se mezclan con
2 ul de buffer de carga. Esta mezcla se somete a electroforesis en gel de agarosa al 1.5 % que
contiene 0.5 ug /ml de bromuro de etidio. El gel se corre a 80 voltios, por 30 minutos y se analiza
en un transiluminador con luz ultravioleta. Como marcador de peso molecular se utiliza un ADN
ladder (100 pb), que se carga en otro carril y se utiliza para verificar el tamaño del fragmento
amplificado.
FRAGMENTO AMPLIFICADO Β-ACTINA 540 pb
FRAGMENTO AMPLIFICADO Β-GLOBINA 268 pb
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PCR PARA LA IDENTIFICACIÓN DE VIRUS HUMANO LINFOTRÓPICO DE CÉLULAS T HTLV I / II
El virus HTLV I esta asociado con leucemia de células T en el adulto, paraparesia espástica,
mielopatía asociada a HTLV y otras condiciones inflamatorias, pero la mayoría de las personas
infectadas permanecen asintomáticas a lo largo de su vida. HTLV II inicialmente se encontró en
un paciente con leucemia, sin embargo no existe una clara asociación de este virus con leucemia
o linfoma y se han reportado algunos casos de paraparesia espástica y mielopatía. HTLV es
endémico en África, Japón, Australia, el Caribe y América del sur.
El principal problema en el diagnóstico de laboratorio en la búsqueda de anticuerpos anti HTLV
son la gran cantidad de muestras indeterminadas que aparecen en las técnicas confirmatorias
como el western blot. La PCR es una técnica que resuelve los indeterminados ya sea al entregar
un resultado positivo o negativo amplificando o no una secuencia del virus integrado en el DNA
humano
Los partidores que se utilizan en la PCR son genéricos para el HTLV I y II cuya secuencia pertenece
al gen tax. La detección del gen del virus se realiza por una PCR anidada (nested).
Tabla 1 Secuencia de los partidores utilizados
Partidores externos Secuencia (5’ → 3’)
AV-45 GGA CGC GTT (A/G)TC (A/G)GCTC
AV-46 (G/T)GC (A/G)GAIAG (C/T)TGGTA(G/T)AGGTA
Partidores internos
AV-42 CTC CCC TCC TTC CCC AC
AV-43 CCA(G/C) (A/G)(G/T) GGT GTA IAI GTT TTG G
Ref. Vandamme, A.M. et al. (1997) Journal of Medical Virology, 52 (1):1- 7
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Tabla 2. Preparación de la mezcla de reacción de PCR partidores externos
Componentes Concentración final ul en la ul…….X (Nº de
(en tubo) reacción tubos)
H20 csp/20 ul
Buffer de PCR 10X
1X
dNTPs 10 mM
0.2 mM
MgCl2 50 mM
1.5 mM
Partidor Av 45 10uM
0.2 µM
Partidor Av 46 10uM
0.2 uM
Taq polimerasa 5U/ul 1.0 U
Cantidad de ADN
100-500 ng
Volumen total (µL) 20
Tabla 3. Parámetros de amplificación PCR con partidores externos
PCR convencional
Temperatura Tiempo
(ºC)
Denaturación inicial 95 4 min
94 30 seg
Amplificación
35 ciclos / PCR 55 30 seg
convencional
72 40 seg
Elongación 72 7 min
Enfriamiento 4
Tabla 4. Preparación de la mezcla de reacción de PCR partidores internos (nested-PCR)
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Componentes Concentración final ul en la …ul….X (Nº de
(en tubo) reacción tubos)
csp/20 ul
H20
Buffer de PCR 10X
1X
MgCl2 50 mM
1.5 mM
dNTPs 10 mM 0.2 mM
Partidor Av 42 10uM
0.25 µM
Partidor Av 4310uM
0.25 uM
Taq polimerasa 5U/ul 1.0 U
DNA
Volumen total (µl) 20
Tabla 5. Parámetros de amplificación PCR Nested en el termociclador
PCR convencional
Temperatura
Tiempo
(ºC)
Denaturación inicial
95 3 min
95 30 seg
Amplificación
25 ciclos / PCR 53 30 seg
convencional
40 seg
72
Elongación
72 5 min
Enfriamiento
4
Control Negativo
Un tubo conteniendo todos los reactivos pero en ausencia de ADN, se incluye como control.
Análisis de los productos amplificados.
Se toman 10 ul de cada producto de amplificación de la PCR-Nested y se mezclan con 2 ul de
buffer de carga. La mezcla se somete a electroforesis en gel de agarosa al 1.5 % conteniendo
0.5 ug /ml de bromuro de etidio. El gel se corre a 100 voltios, por 20 minutos y se analiza en
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un transiluminador con luz ultravioleta. Como marcador de peso molecular se utiliza un ADN
ladder (100 pb), para verificar el tamaño del fragmento amplificado.
Fragmento amplificado 219 pb
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DETERMINACIÓN DE LA EFICIENCIA DE LA REACCIÓN DE PCR EN TIEMPO REAL PARA LA
DETECCIÓN DE UN GEN HOUSEKEEPING
El PCR en tiempo real permite un análisis cinético y una cuantificación del producto amplificado
ciclo a ciclo mediante el uso de fluoróforos o sondas específicas marcadas durante la fase
exponencial, teniendo una mayor sensibilidad que el PCR convencional.
Los fluoróforos aumentan en forma considerable su emisión de fluorescencia al intercalarse en
el ADN de doble hebra. Los fluoróforos más utilizados son SYBR® Green, fluoróforo que se une
al giro menor del ADN doble hebra y cuya longitud de onda de excitación es de 494 nm y
longitud de emisión es de 524 nm y Fast EVAGreen®, que tiene una longitud de onda de
excitación de 500 nm y una longitud de onda de emisión de 530 nm. Estos tipos de fluoróforos
tienen como principal inconveniente su inespecificidad, debido a que se unen a cualquier
molécula de ADN doble hebra, pudiendo entregar valores de fluorescencia falsamente
aumentados al unirse a dímeros de partidores en la reacción de PCR. Para corregir esta
desventaja, debe tenerse especial cuidado con el diseño de partidores, y debe realizarse un paso
adicional en la PCR en tiempo real llamado curva de disociación, que consiste en denaturar el
ADN, disminuir la temperatura para favorecer la unión de las dobles hebras y volver a
denaturarlo, obteniendo una curva de recuperación de fluorescencia, que permite evaluar si el
producto amplificado es único y específico.
En forma paralela, la PCR en tiempo real incorpora en la reacción una señal de normalización
llamada referencia pasiva, que consiste en el uso de un marcador que permite normalizar la
señal emitida y corregir las diferencias de fluorescencia debidas a cambios en el volumen de las
diferentes reacciones. El ejemplo más común de ellos es el ROX, cuya longitud de onda de
excitación es de 588 nm, y de emisión 608 nm.
Es de vital importancia considerar que tanto en la PCR convencional como en la PCR en tiempo
real es necesario el uso de controles de reacción, siendo los más utilizados la amplificación de
genes constitutivos o housekeeping, que son genes que tienen una expresión constante debido
a que son requeridos para el correcto funcionamiento celular o para el mantenimiento de las
funciones metabólicas. Los genes constitutivos más usados son beta actina (ACTB), beta-globina,
Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), β-2-microglobulina (B2M), complejo
succinato deshidrogenasa (SDHA), entre otros.
Tan importante como la consideración del uso de genes control, es la determinación de la
eficiencia en la reacción de PCR en tiempo real, parámetro que nos indica la confiabilidad en la
estimación del número de copias de ADN en la reacción. La forma más común y sencilla de
cálculo de eficiencia es mediante la curva estándar, en la cual el valor de la pendiente de la recta
es utilizado en la siguiente fórmula:
La pendiente ideal es -3,32, que se correlaciona con una eficiencia de 100%. Valores de
pendientes que varíen entre -3,60 y -3,10 son considerados aceptables en PCR tiempo real,
valores que se correlacionan con una eficiencia de entre 90% a 110%, considerado como el rango
óptimo. Existen varios factores que pueden influir sobre la eficiencia, como el tamaño del
amplicón, el diseño de partidores, entre otros.
Para las reacciones de PCR en tiempo real se utilizan kits comerciales que vienen previamente
estandarizados, dejando como variables a determinar la temperatura de hibridación de los
partidores, la concentración de los partidores a utilizar y la concentración de ADN presente en
la reacción. Todas ellas afectan directamente la eficiencia de la reacción. Por lo tanto, para
determinarla debemos hacer una curva de calibración para cada variable a analizar. La curva de
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calibración se puede hacer a partir de cantidades conocidas de ADN presente en cada tubo o a
partir de diluciones seriadas 1/10, usualmente entre 10-3 hasta 10-8. La detección de un producto
único en la reacción se determina mediante una curva de disociación (o melting), al final del
PCR.
Estandarización Curva de Calibración para la detección de un gen housekeeping.
Para determinar la eficiencia de reacción de la amplificación de un gen mediante PCR en
tiempo real debemos realizar una curva de calibración, como se hace en cualquier otro
método.
Esta curva de calibración contempla la realización de diluciones seriadas del fragmento que se
quiere detectar, el cual debe haberse amplificado previamente mediante PCR convencional.
Las diluciones seriadas pueden ser de cualquier factor y se realizan como se indica en el
esquema siguiente:
En este caso, el gen que se va a amplificar para su estandarización es el gen β-2-microglobulina
(B2M), del cual ya se tiene el stock previamente amplificado.
La secuencia de los partidores que se van a utilizar se muestra en el siguiente cuadro
Secuencia de los partidores
Partidor Secuencia (5’ → 3’)
B2M-F TAGGAGGGCTGGCAACTTAG
B2M- R CTTATGCACGCTTAACTATCTTAACAA
HPRT-F TGA CAC TGG CAA AAC AAT GCA
HPRT-R GGT CCT TTT CAC CAG CAA GCT
Referencia: Kılıc, Y., Çelebiler, AC, Sakızlı, M (2014). Selecting housekeeping genes as references for the
normalization of quantitative PCR data in breast cáncer. Clin Transl Oncol. 16(2):184-90.
Para la preparación de la mezcla de reacción, a diferencia del PCR tradicional, donde Ud.
multiplica por un número más de tubos cada compuesto para hacer su mezcla de reacción acá
debe agregar 0,2. Esto quiere decir que, si tiene 5 tubos, debe multiplicar cada componente por
5,2 y no por 6. Para la reacción de amplificación, de forma arbitraria vamos a tomar 2 ul de ADN
de cada dilución. Recuerde que también debe considerar un control negativo.
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En la tabla 1 se muestra una mezcla de reactivos para un PCR en tiempo real realizado con un
agente intercalante, donde el rango de concentración de partidor es la única variable del mix de
reacción que se puede ajustar, junto con la temperatura de hibridación. En la tabla se indica el
rango de concentración de partidor que se puede utilizar.
Tabla 1. Preparación de la mezcla de reacción de PCR
Componentes Concentración/Rx Volumen/Rx Volumen Final
Agua
Mix Reacción 2X 1X
Partidor F (10 uM) 0,2 uM-0,5 uM
Partidor R (10 uM) 0,2 uM-0,5 uM
DNA 2
Volumen Total 20 ul
La amplificación para la detección del gen β-2-microglobulina (B2M) y HPRT utiliza 0,5 uM de
partidor y su temperatura de amplificación es 60°C.
Resultados Esperados.
1. Determinar la eficiencia de la reacción para el partidor.
2. Comparar resultados con datos previos
3. Determinar especificidad de la amplificación
