Tema 1.

- Metabolómica Preparativa
1.- INTRODUCCIÓN Goma Guar
2.- PROTEÓMICA Inulina
2.1.- Obtención de productos Obtenidos de algas
2.2.- Métodos de aislamiento Polisacáridos bacterianos
SANGRE/PLASMA/SUERO Almidón
2.3.- Técnicas de concentración 4.- LIPIDÓMICA
2.4.- Métodos de purificación 4.1.-Glicéridos
SEDIMENTACIÓN 4.2.-Alternativas para la obtención
CROMATOGRAFÍAS selectiva de determinados ác. grasos
Filtración en gel Lipasas
Fase reversa (RPC) Lípidos volátiles
Intercambio iónico (IEXC) Hidrodestilación
Intercambio hidrofóbico (HIC) Soxhlet
Filtración en gel (GFC) Fluidos supercríticos
Cromatografia de adsorcion en Dispersiones
cama expandida (EBA) Tensioactivos
Inmuno-eliminación Vesículas
Escalado FPLC (Fast Protein Liposomas
Liquid Cromatography) Nanosoportes
ELECTROFORESIS Extracción LL
SDS-PAGE Encapsulación
Western-blotting
IEF o enfoque isoeléctrico
Electroforesis sobre microgeles
Cromatografía fuera de gel
2.5.- Resumen
3.- GLICÓMICA
3.1.- Glicoproteínas
3.2.- Polisacáridos altamente
abundantes en la naturaleza
NSPs polisacáridos no
almidonados.
QUITINA
OTROS
Goma Garrofin
Pectinas
1.- INTRODUCCIÓN
El término -ómicas se aplica al estudio masivo de una gran cantidad de biomoléculas.
Existen dos grandes -ómicas:
-Genómica se aplica al estudio de ácidos nucleicos que intervienen en el metabolismo.
-Metabolómica se aplica a todas las moléculas distintas a los ácidos nucleicos que
intervienen en el metabolismo.
Dentro de la metabolómica encontramos: proteínas→proteómica, de lípidos→lipidómica,
de enzimas→enzinómica, etc.
Las metodologías usadas en la metabolómica abarcan un amplio conjunto de tecnologías
destinadas a:
1.- Obtener unos extractos en los cuales obtengamos el mayor número posible de moléculas
2.- Identificar cuáles son las principales biomoléculas que se encuentran dentro del extracto.
3.- Llevar a cabo unos estímulos funcionales con los extractos y con las principales
biomoléculas que constituyen cada uno de ellos, intentando establecer relaciones de estructura y
de función entre cada uno de ellos.
Por lo tanto, en el tema de metabolómica preparativa vamos a estudiar las metodologías
correspondientes al paso 1.
La preparación se divide en 3 etapas, obtención, aislamiento y purificación.
● La obtención se realiza mediante cultivos celulares, por medio de la agricultura,
acuicultura, ganadería, muestras humanas como biopsias, muestreo…
● El aislamiento cuanto más complejas tendremos en cuenta proteínas, enzimas o metabolitos
extracelulares (es decir que secrete el microorganismo o el medio de cultivo).
Normalmente se evita este tipo de situaciones, para obtener lo más sencillo. Algunos
métodos son de separación por centrifugación, tamizado o filtración, fragmentación por
cortado o molido y extracción con disolventes o asistida en las que se hace uso de
homogeneización mecánica, con ultrasonidos o microondas y el fraccionamiento con
sobrenadantes o precipitados.
● La purificación normalmente se realiza mediante cromatografía o en el caso de proteínas o
enzimas, mediante electroforesis que además permite el seguimiento del avance de la
purificación.

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 2.- PROTEÓMICA

2.1.- Obtención de productos

Los estudios se realizan a partir de cultivos celulares o de muestras biológicas relacionadas
con la agricultura, biopsias, etc. Cuanto más complejo sea el organismo que estemos considerando
y más fluctuación biológica pueda existir en cuanto su obtención será necesario hacer un estudio
más significativo. En la siguiente imagen vemos un esquema general de la obtención de productos.

Es más sencillo trabajar con enzimas ya que podemos medir su actividad y medir la
preservación de esa actividad, aunque también podemos aplicarlo a cualquier tipo de metabolito.

2.2.- Métodos de aislamiento

En cuanto a métodos de aislamiento, combinaremos distintas etapas que varían su
complejidad siendo los látex de vegetales las menos complejas, y siendo más complejas para los
microorganismos, especialmente los que producen enzimas intracelulares.
Si trabajamos con microorganismos con enzimas extracelulares, el método de aislamiento
consistirá solo en la separación; centrifugando las células y reutilizándolas para nuevos cultivos,
y el resto se lleva a la etapa de concentración. Este proceso es el más deseado, pero no puede
utilizarse en la mayoría de las proteínas.
Para el resto de proteínas se obtienen intracelularmente con los siguientes métodos:
1.- Separación: mediante centrifugación, tamizado o filtración.
2.- Fragmentación: mediante cortado, molido, extracción disolvente o extracción asistida.
Las extracciones asistidas son aplicar la homogeneización mecánica, homogeneización con ayuda
de microondas etc.
3.- Fraccionamiento: mediante sobrenadantes o precipitados.
A continuación, pasaremos a la concentración y purificación.

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 Al final es importante que todos los subproductos (S) que vayamos obteniendo en las etapas
se puedan revalorizar o reutilizar. Por ejemplo: un bioproducto primario como fármaco y un
subproducto útil para la agricultura.
En todo este proceso, las enzimas sufren un largo deterioro, que intentaremos contrarrestar,
como calor, rozamiento, agentes desnaturalizantes, reactivos que producen hidrólisis u oxidación,
pH, conformación, reactivos, proteasas... Para evitarlo aplicamos frío, etapas en reposo que
minimicen el impacto del rozamiento, regulando el pH para evitar el impacto en tejidos, etc.

SANGRE/PLASMA/SUERO

Se usa porque es muy fácil de obtener, es la muestra con mayor representación del proteoma
humano y se cree que contiene subconjuntos del proteoma tisular y xenobióticos.
Las proteínas mayoritarias dificultan la separación y purificación de las minoritarias. Por lo
que nuestro objetivo es facilitar el proceso de obtención de las proteínas objetivo evitando en lo
posible esta dificultad en el posterior estudio de las minoritarias. Un ejemplo son las biopsias, las
cuales son muy reducidas/minúsculas, por lo tanto, necesitamos obtener el máximo rendimiento
para garantizar que se puede obtener la proteína objetivo.
Estrategia:
1.- Partir de la muestra biológica, separar para trabajar con el plasma
2.- A través de una columna cromatográfica capturaremos las proteínas mayoritarias en el
seno de esa columna (mayoritarias en rojo, minoritarias en azul). Recuperaremos las minoritarias.
3.- En caso necesario: fraccionamiento cromatográfico y aplicación de electroforesis pseudo
preparativa a nivel de laboratorio. (no a nivel industrial).
4.- Separación de distintas proteínas mediante hidrólisis en condiciones estandarizadas hacia
péptidos.
5.- Con los péptidos le aplicamos una cromatografía líquida, en fase inversa o bien por
intercambio iónico para identificar a las proteínas. (Contrastando con una base de datos).
6.- Identificar los péptidos y la proteína al comparar en bases de datos.

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 Esto sirve por ejemplo para comparar la situación metabólica de un órgano a otro, o la
eficacia de un tratamiento etc.

2.3.- Técnicas de concentración

En la purificación, a medida que realizamos más etapas se va perdiendo más biomasa y
disminuye el rendimiento. Esto mismo ocurre en las cromatografías, pero en este caso aumenta su
dilución. Por lo tanto, es necesario incluir una etapa de concentración.
En esa concentración es muy útil la técnica de filtración con distintos tipos de membrana.
según el tamaño de poro distinguimos: microfiltración, ultrafiltración, nanofiltración…
A nivel de laboratorio se hace uso de la filtración convencional, que tiene el flujo
perpendicular al plano de la membrana y va colmatando la membrana a medida que se retienen las
proteínas. Sin embargo, es más eficaz cuando el flujo es tangencial a la membrana, disminuyendo
la deposición en la superficie, aumentando en consecuencia la velocidad y el rendimiento.

Una mejora en la filtración se introdujo con las membranas con un tamaño de poro
determinado y que además tienen selección mediante cargas. los poros con cargas negativas
repelen las moléculas negativas y atraen a las positivas
Otro sistema muy parecido, es en el que el poro se regula con un polímero inteligente, en el
cual, dependiendo del pH, este tendrá carga neta positiva o negativa, atrayendo o repeliendo así
las moléculas en función de su carga. Primero, se daría la imagen “a” y después la “b”.

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 Otro método adicional sería la liofilización, que consiste en eliminar el agua por
sublimación, de cualquier conjunto de extractos proteicos y acuosos en general, agua como
disolvente. Para ello hay que realizar una congelación previa y después realizar la sublimación.
Ventaja: la concentración es enorme por lo que se puede aplicar a los extractos e incluso a
muestras biológicas que contengan agua en su interior (tejidos).
Inconvenientes: el coste y la lentitud.
Ambas técnicas son escalables a nivel industrial.

2.4.- Métodos de purificación

SEDIMENTACIÓN
-Centrifugación diferencial: separación gradual de las biomoléculas con mayor masa según
el gradiente de densidad. Tiene aplicación industrial ya que permite las 10000 rpm.
-Centrifugación isopícnica: se realizan los siguientes pasos:
a) Preformación de un gradiente
b) Aplicación de la muestra
c) Separación por densidad
d) Se perfora y se recoge la muestra
El rotor (c) puede ser basculante o fijo y
con ello se separan las muestras en función de su densidad.
Ventajas: separación de extractos de proteínas según su densidad.
Inconvenientes: únicamente aplicable a nivel académico porque sólo alcanza las 400 rpm. A
mayor tamaño tengan los rotores la velocidad será menor.

CROMATOGRAFÍAS

La purificación sigue un proceso con al menos 3 cromatografías sucesivas denominadas:

● Captura o purificación inicial: el objetivo es capturar la proteína objetivo, separándola de
otras muy diferentes entre sí. En LITROS.
Son muy importantes las propiedades de velocidades de retención de la columna y la
velocidad cromatográfica para que podamos procesar una gran cantidad de mg en muestra
en el menor tiempo posible.
● Refinado o purificación intermedia: mantenemos nuestra proteína objetivo y los separamos
de otras proteínas relativamente parecidas (aún hay muchas impurezas). En MILILITROS.
Buena resolución

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 ● Limpieza o purificación final: separar la proteína objetivo de moléculas muy parecidas. En
MICROLITROS. Debemos mantener una resolución u obtener una mejor todavía y
necesitaríamos una máxima reintegración para evitar pérdidas por absorción inespecífica.
Hay distintas técnicas que se pueden combinar entre sí en este proceso, pero hay que tener
muy en cuenta que cada una tiene requerimientos específicos.

Por ejemplo, en la filtración en gel (GF), se abarcan columnas estrechas y muy altas. El
volumen que se aplica es en torno al 2%, por tanto, el volumen de muestra a aplicar es minúsculo
y en consecuencia no sería razonable aplicar una fase de captura, pero si en una fase de limpieza.
Sin embargo, en la fase de limpieza sí es útil. En el caso de la cromatografía de afinidad (AC) el
tipo de fase estacionaria que se utiliza permite procesar una gran cantidad de volumen de
inyección, siendo aplicable en la fase de captura. Por último, en el intercambio iónico (IEX) se
puede aplicar en las tres etapas, pero la misma técnica se tiene que aplicar en distintas condiciones,
cambiando el tamaño de partículas.
Tamaños según etapa:
● Captura: 90 micrómetros.
● Refinado: 30 micrómetros.
● Limpieza: 10 micrómetros.
Considerando esto, se diseñaron distintos métodos, aunque todos usan una metodología
similar:
El cromatógrafo contiene un detector de aa aromáticos a 280 nm.
Monitorizados en azul, la proteína a analizar. En rojo, la
medida de la concentración de sales en la fase móvil. Y en
sombreado gris oscuro, son los ensayos de actividad del
enzima objetivo. En los resultados intentaremos conseguir la
fracción más pura.

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 Tipos de cromatografía:

Filtración en gel

En este caso usaremos grano grueso para obtener dos fracciones gruesas: todos los
biopolímeros al principio y todas las biomoléculas al final. La ventaja principal es que podemos
concentrar en pocas fracciones cromatográficas las proteínas y los metabolitos por partes
separadas. Un inconveniente es que hay que aplicar más fases después para separar los
biopolímeros.

Fase reversa (RPC)

Partiremos de un escalón previo al gradiente donde inyectamos la muestra (rectángulo azul)

y podemos ver que antes del gradiente ya sale un pico de proteínas: las que no han sido retenidas
por la fase estacionaria. Después se aplica el gradiente de 5-40 Pv separaremos las proteínas en
función de la concentración que estemos considerando. Y luego aplicaremos un escalón de
limpieza de 2-4 niveles de columna. Se hace así para que se pueda extrapolar el proceso a distintas
columnas de otros volúmenes.

Pv: volumen-columna; Azul: separación de las proteínas; Rojo: gradiente.

Intercambio iónico (IEXC)

Podemos tener una fase estacionaria con carga neta negativa o positiva. Se supone que los
intercambios fuertes son más eficaces que los débiles, pero en la práctica hay que probar porque a
veces no ocurre esto.
Se empieza siempre con fuerza débil para
facilitar la interacción entre la muestra y la fase
estacionaria. A mayor fuerza entre los grupos
cargados de F.E. y F.M., mayor fuerza de
intercambio en el componente, aumentando la
solvatación, lo que disminuye su interacción y se
desplaza.

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 Salen antes las proteínas cargadas negativamente porque no se enlazarán con la F.E negativa,
o viceversa.
El gradiente lineal nos da idea sobre la fuerza iónica apropiada para eluir cada proteína. Para
optimizar la cromatografía, realizamos otra cromatografía con tres escalones, uno de menor fuerza
iónica que elimina moléculas no deseadas, un segundo donde sale nuestra molécula objetivo y un
tercero de alta fuerza iónica para la limpieza.
En separación de proteínas el menos eficaz gel< líquida <gas, porque disminuye el tamaño
de partícula. Es solo cromatografía analítica, no preparativa.

El pH es importante para mantener la integridad de la proteína objetivo, pero aplicaremos

variaciones dentro del intervalo de preservación con el objetivo de establecer la diferencia de
cargas óptima. En función del pH puede ocurrir que la proteína objetivo salga la última o la
primera.

Intercambio hidrofóbico (HIC)

Se parte de gran fuerza iónica, ejemplo; se parte del 100% de sulfato amónico (1 M) y a
partir de ahí disminuye. También se realiza una segunda cromatografía en 3 escalones

Filtración en gel (GFC)

No se aplica un gradiente, se aplica una elución isocrática. Tenemos partículas porosas, las
proteínas pequeñas tardarán más en salir porque atravesaran todos los poros y las de mayor tamaño
no penetrarán en el poro, resbalaran entre partículas y saldrán antes.

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 Con grano fino separaremos monómeros, dímeros y tetrámeros; y los granos gruesos solo
sirven para separar biopolímeros. Esta técnica también sirve para determinar la masa molecular de
proteínas con la ventaja de que mantiene la estructura cuaternaria de la proteína. Teóricamente
existe una relación lineal entre la Kav y log(Masa molecular), pero en la práctica es pseudo lineal.

Hay distintas opciones:

● Intercambio tampón.
● Desalado.
También sirve para el intercambio de tampones. Introducimos la muestra en tampón acetato
pH 5 y la elución de la fase móvil la llevamos en tampón fosfato pH 7. De ese modo recuperamos
la proteína objetivo en el tampón pH 7. Separa biopolímeros de biomoléculas simples, aportando
versatilidad, y con la ventaja de tener un volumen mayor de muestra.

Cromatografía de afinidad (AC)

Es más eficaz para estudiar la etapa de captura, aunque no siempre es válida. Si quisiéramos
poner a prueba un anticuerpo específico sería la mejor técnica para comprobarlo (en teoría). En la
realidad se dificulta, ya que la muestra a estudiar no está totalmente purificada.
En la práctica tenemos una F.E con un ligando incorporado, específico de la proteína objetivo
que queremos separar. Podría ser inhibidor de una enzima, proteína antigénica, etc.
Incorporamos la muestra con una mezcla de proteínas. La proteína objetivo debe ser
complementaria a la F.E para que quede retenida en la columna. Se recuperan las demás proteínas
en la primera fase y después se daría la Fase de desplazamiento.
En la fase de desplazamiento se le añade en la F.M un ligando soluble que compite con el
ligando que retiene a la proteína objetivo pudiendo recuperarla. Otra alternativa sería poner una
fase de carga determinada en la que la proteína queda enlazada a un Ag y luego, en la fase de
desplazamiento utilizar otra fase de carga con un pH distinto para disociar la unión. Es decir,
utilizaríamos dos tampones distintos: uno para la fase de carga y otro para la fase de
desplazamiento.

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 Cromatografía de adsorción en cama expandida (EBA)

Es especialmente eficaz a nivel biotecnológico. Combina filtración + cromatografía de

captura. Agiliza el proceso y por tanto disminuye el coste, favoreciendo la viabilidad de obtención
de la proteína.
-Inicialmente partimos de la fase estacionaria compactada (0). A continuación, se fluidiza
con las partículas en suspensión (1).
-Introducimos la muestra, una vez dentro las partículas objetivo se enlazarán con las que
tienen afinidad (en la FE). Y las que no se enlacen, resbalarán y abandonarán la columna (2).
-Después, se da un lavado en el que se elimina las posibles uniones inespecíficas de otras
partículas a la FE en suspensión (3).
-Se compacta la F.E (4).
-Fase de desplazamiento para recuperar la proteína objetivo (5).
Es aplicable a cualquier tipo de cromatografía: intercambio iónico, interacción hidrofóbica,
afinidad…

Inmuno-eliminación

Utilizamos una columna de afinidad que tiene incorporados 14 anticuerpos específicos a las
proteínas mayoritarias DEL PLASMA en este caso. De ese modo en la Fase de carga de la muestra,
las de mayor abundancia quedarían unidas, y recuperamos las de baja abundancia, a las cuales se
les aplicarán las fases de captura, filtración y limpieza. Este proceso se llama precaptura.
Después de recuperar las de baja abundancia, cambiamos las condiciones de ensayo y
desplazamos a las mayoritarias. Así solventamos el problema mencionado anteriormente

Escalado FPLC (Fast Protein Liquid Cromatography)

El escalado biotecnológico es muy importante para el estudio de proteínas objetivo. Como

podemos ver en el gráfico, el flujo “a” es mucho menor que en el “b”, pero la velocidad lineal de
ambos es la misma. Esto se debe a que la superficie, longitud y diámetro de las columnas son
distintas; lo que permite analizar un mayor volumen, pero con el mismo tiempo y eficacia.

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 Cromatógrafo preparativo de laboratorio (izq) a el de planta piloto (derecha).

A nivel de funcionamiento tenemos dos líneas de producción: una de funcionamiento y otra

de regeneración (in situ).

ELECTROFORESIS

Es el último método de purificación.

SDS-PAGE

Consiste en la separación de proteínas en un gel de poliacrilamida en presencia de dodecil

sulfato sódico. Las enzimas oligoméricas se van a disociar en los compuestos correspondientes.
Se podrá determinar la masa molecular de la proteína objetivo comparando con marcadores de
masa patrón de las cadenas disociadas. Para conseguir la masa de la estructura cuaternaria sin
disociar, sin filtrar se utilizará la cromatografía en gel o bien la espectrometría de masas.

Western-blotting

Western blot es una técnica de laboratorio utilizada para detectar una proteína específica
en una muestra de sangre o tejido. El método implica el uso de electroforesis en gel para separar
las proteínas de la muestra.

La detección de errores se puede mejorar mediante el uso de inmunodetección: las

proteínas separadas se transfieren del gel a la superficie de una membrana. La membrana se
expone a un anticuerpo específico contra la proteína en estudio. La unión del anticuerpo se
detecta usando un marcador radiactivo o químico. Un Western Blot se utiliza a veces para
diagnosticar enfermedades.

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 La técnica utiliza tres etapas: separación por tamaño, transferencia a un soporte sólido
(gel de celulosa) y, finalmente, visualización mediante la marcación de proteínas con el uso de
anticuerpos primarios o secundarios apropiados.

El anticuerpo primario se une a la proteína buscada y el secundario está unido al

anticuerpo primario y a una enzima.

Así, añadiendo un anticuerpo secundario que lleva una enzima podemos convertir un
millón de moléculas de sustrato en un millón de moléculas de producto. La enzima tiene que
generar un producto polimérico insoluble que se deposite en la banda donde se encuentra nuestra
proteína. Tiene que ser polimérico, insoluble y de rápida precipitación en la que se movilice a la
proteína objetivo para poder cuantificarlo.

IEF o enfoque isoeléctrico

Permite la separación de proteínas en función del gradiente pH
isoeléctrico. Es el primer paso de una electroforesis bidimensional.
En una electroforesis bidimensional se separa un conjunto de
proteínas, primero con enfoque eléctrico (cilindro), y luego en
horizontal en presencia de SDS en gel de poliacrilamida. Se separan
las proteínas o bien por tamaño o bien por movilidad electroforética,
así conseguimos una huella de la proteína del tejido o muestra de
estudio. Esta técnica puede realizarse a proteínas y péptidos de gran
tamaño.
El pH del punto isoeléctrico de la proteína objetivo podemos
calcularlo mediante una recta de calibrado (patrón).

Electroforesis sobre microgeles

Puede procesar dos geles a la vez con cualquier tipo de técnica. La muestra de 1 microlitro
se aplica con ayuda de un peine. Por capilaridad, el contenido del pocillo asciende hacia el peine,
después este se coloca sobre el soporte.

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 También lleva incorporada una cámara de
tinción/distinción, para poder facilitar este proceso. Hay
tinciones como la de azul coomassie que se pueden
realizar de forma manual y es muy rápida. La tinción de
plata es más laboriosa, ya que requiere más tiempo y
temperatura. Por tanto, utilizaremos una cámara de
tinción donde se automatizan los reactivos. La muestra
real será inferior al microlitro. (Cuanto más pequeño
mejor separación).
También permite hacer la electrotransferencia. A partir de los electroferogramas podemos
aplicarles un programa y obtener análisis.
Con azul coomassie con pH 5 isoeléctrico detectaremos todas las proteínas (Izq). Con
actividad enzimática sólo detectamos la proteína objetivo (Der).

Cromatografía fuera de gel

Para la proteómica, se utiliza mucho la

cromatografía fuera de gel que permite
recuperar las fracciones separadas mediante
electroforesis, pero a nivel de laboratorio (no es
estable en la industria). Transcurre dentro de un
gel, pero mantiene una intercomunicación con una
base líquida en unas calles donde se da el
intercambio con el líquido superior. Por tanto, al
recuperar el líquido de la superficie captamos las
distintas proteínas con respecto a la muestra.
El resultado se puede recuperar de forma
específica en condiciones equivalentes y
contrastar con el mapa peptídico de la
cromatografía bidimensional.

2.5.- Resumen
El procedimiento ideal es:
- Obtener una muestra biológica.

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 -Disponer de una columna cromatográfica que previamente haya capturado las proteínas
mayoritarias.
-Purificar las proteínas minoritarias hasta encontrar la proteína objetivo con: captura,
refinado y limpieza.
-Electroforesis fuera de gel.
-Separación de cromatografía y espectrometría de masas. (Ventaja: alta sensibilidad y
universal).
Si la muestra es simple, con pocas proteínas, se pueden hidrolizar directamente con tripsina
y, una vez pasadas a péptidos, analizarlas mediante cromatografía líquida y detección con
espectrometría de masas.
Si la muestra es más compleja separamos las proteínas con electroforesis fuera de gel,
recuperamos la proteína objetivo, y aplicamos hidrólisis con tripsina a los péptidos que la
constituyen y separación con SDS. Si es aún más compleja, después de la obtención de las
minoritarias realizaremos varias cromatografías (una vez hidrolizadas trípticamente, a la proteína
objetivo se le aplica el mismo procedimiento que a las complejas).

3.- GLICÓMICA

Es la -ómica más reciente, ya que es muy difícil su separación por el hecho de que sus
estructuras son muy parecidas entre sí. (Multitud de isómeros)

3.1.- Glicoproteínas

Las más complejas son las glicoproteínas ya que determinan la actividad biológica.
Eliminación de oligosacáridos con endoglicosidasas. Para identificar si están en la posición
N-glicosídica o la O-glicosídica.
Elementos para identificar los polisacáridos: sulfatos (regulación sanguínea), monosacáridos
que los componen, cuál es el enlace glicosídico que lo relaciona con 1-4,1-6,1-2; y cuál es la
orientación característica (alfa, beta, etc.).
-Para identificar los monosacáridos constituyentes, primero se realiza una hidrólisis con
ácido fuerte y posteriormente una derivación volátil. Se separa con cromatografía de gases (los
derivados volátiles forman multitud de fragmentos que permiten identificarlos), identificación con
espectrometría de masas pudiendo identificar glucosa, galactosa y manosa (en forma de sus
derivados en caso de cromatografía de gases). Y nos identifica isómeros. En cromatografía líquida
no sería posible ya que las moléculas isómeras tienen la misma masa molecular.

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 -El enlace 1-4, 1-6,1-2 se identifica: permetilación con CH3I → un disacárido si le metilamos
todos los OH libres y posteriormente se realiza hidrólisis ácida eliminando todos los
monosacáridos ácidos con el OH metilado excepto los involucrados en el enlace glucosídico. Con
ello lo analizamos.
-Enlace alfa/beta → con enzimas específicas alfa glicosidasas /beta glicosidasas.
Cuando se complica aún más hay que hacer uso de RMN y MS.

ENDOGLISOSIDASAS: las proteínas tienen distintas formas por evolución enzimática o

no enzimática, que afecta a la secuencia aminoacídica y a la secuencia glicosídica. Esto es
importante en farmacología, ya que varía el efecto de los medicamentos entre los distintos tipos
de pacientes.
LECTINAS O SELECTINAS: reconocen secuencias de oligosacáridos característicos en
proteínas objetivo. En cromatografías de afinidad o de inmunofluorescencia.

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 3.2.- Polisacáridos altamente abundantes en la naturaleza

NSPs polisacáridos no almidonados.

QUITINA

Presente en la naturaleza como polisacárido de soporte,

tanto en los hongos como en artrópodos. La mayor consistencia
mecánica del exoesqueleto de los artrópodos se debe a que esa
quitina se encuentra entrecruzada, es decir, además de tener las
fibras de polisacárido, tenemos un entrecruzamiento equivalente
de N-acetilglucosamina entre las fibras de polisacárido. El
componente lineal o principal es la quitina.
Se parte del exoesqueleto, se descalcifica con HCl, se
desproteiniza con sosa (de ese modo también se hidrolizan los
enlaces covalentes cruzados), se decolora con permanganato
potásico y finalmente se obtiene el polisacárido: Quitina.
A partir de la quitina se puede obtener quitosano (mediante
una desacetilación en sosa), el cuál es un polisacárido catiónico.

OTROS

● Derivados de las paredes celulares vegetales constituidas de fibras compactas de celulosa,

hemicelulosa y las fibras fermentantes denominadas pectinas.
● Las hemicelulosas: dentro de ellas destacan los xilanos
● Las pectinas: con un esqueleto predominante de ácido araquidónico, y además de eso van
a tener diversas ramificaciones de arabinosa, ramnosa, glucosa, etc.
Vamos a tener fuentes biológicas de polisacáridos con aplicaciones tecnológicas. Tenemos:
Homopolisacáridos: quitina, quitosano.
Heteropolisacáridos: xilanos, pectinas. Se caracterizan por tener una intensa variedad de
ramificaciones.

Goma Garrofín

El algarrobo contiene unas vainas con semillas, a partir de las cuales se puede obtener un
polisacárido llamado Goma Garrofín. Aplicaciones: espesante, alimentario, etc.

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 Pectinas

Los polisacáridos tienen en el esquema de producción una importante etapa de precipitación

en etanol, que es común a muchos de ellos. Además, habrá unas etapas específicas según la
estructura característica del polisacárido. Por ejemplo, las pectinas de alto y de bajo metoxilo,
dependiendo de las propiedades de cada una, serán sometidas a distintos tipos de precipitación.
Las pectinas están presentes en la corteza de una gran cantidad de frutas, pero predominan
las obtenidas de cítricos.

Goma Guar

Al igual que la goma garrofín, también es galactomananos: copolímeros de galactosa y

manosa (aromas) en distintas proporciones.

Inulina

Otro polisacárido importante a nivel industrial es la Inulina (polisacárido de reserva), la cual

está compuesta por un primer eslabón de glucosa y el resto por una cadena de fructosa.
Se puede obtener a través de achicoria, dalia (el tubérculo), alcachofa (dispersa en toda la
planta, no rentable económicamente) y la alcachofa de jerusalén (de la familia del girasol).
Cada inulina de cada planta tiene propiedades distintas y podrán ser utilizadas en un campo
u otro.

Obtenidos de algas

No solo actúan como espesantes y gelificantes, algunos actúan como anticoagulantes.

Pardas: alginatos
gelificación de calcio
Macroalgas para diferenciarlos
pueden agregarse
en
microfilamentos Rojas: carragenatos,
Gran
etapa característica de
variedad obtención con etanol,
de algas Microalgas gelificación con
unicelulares potasio para el
aunque también se carragenato Kappa
pueden agregar en
microfilamentos

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 Polisacáridos bacterianos

● La goma Xantana a partir de Xantomona.

● Goma Gelano a partir de Sphingomonas.
● Esfingano a partir de Sphingomonas.

Almidón

Su característica fundamental es que se aprovecha completamente para la obtención de

bioproductos con aplicaciones sanitarias, en agricultura...
Se hidroliza con la siguiente estrategia:
1. Endohidrolasas que corten los fragmentos grandes a más pequeños.
2. Exohidrolasas que corten de fuera a dentro.
Endohidrolasas: alfa hidrolasa (hidroliza enlaces alfa 1,4), isoamilasa o pululanasa (hidroliza
la ramificación alfa 1-6).
Exoglucosidasas: glucoamilasas o amidoglucosidasa (hidroliza eslabones individuales de
glucosa). Y la beta amilasa (hidroliza eslabones de maltosa).
Además, tenemos la ciclodextrin glucosiltransferasa. La estructura helicoidal del almidón
permite que esta enzima actúe en el rizo de curvatura de las cadenas del almidón para cortar y
enlazar.
Tiene dos etapas de catálisis:
Primero una hidrólisis de la cadena polisacarídica, y en segundo lugar la condensación del
rizo que acaba de hidrolizar.
El resultado es que genera oligosacáridos cíclicos llamados ciclodextrinas. (alfa, que
contiene 6, beta 7 y gamma 8 eslabones de glucosa respectivamente).
Por acción de las glicosilasas tendríamos dextrinas, con la combinación de las
exoglisosilasas, jarabes de glucosa y de maltosa, y con la aplicación de la ciclodextrin
glucosiltransferasa obtenemos ciclodextrinas.

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 La enzima alfa amilasa es la que más se vende en todo el mundo.
La estructura de las ciclodextrinas a nivel tridimensional
adopta una forma troncocónica con los hidroxilos primarios hacia
fuera (CH2OH, hidrofílicos), y los secundarios hidrofóbicos hacia
dentro. Esto le permite formar complejos de inclusión con
moléculas hidrofóbicas.
Tenemos una poli variedad en cuanto a las formas del
complejo: dispersidad simple (a) o doble (b). También puede
abarcar distintas zonas de la molécula (c).
Otra peculiaridad es que se encuentran en la naturaleza y se
pueden obtener con ayuda de la ciclodextrin glucosiltransferasa.
Además, partiendo de alfa, beta y gamma, se pueden introducir
derivados adicionales en los hidroxilos externos para producir
cambios en sus aplicaciones.

4.- LIPIDÓMICA

4.1.-Glicéridos
Los principales son el glicerol y los ésteres de glicerol, que se obtienen mediante una
extracción con ayuda de disolventes. El procedimiento habitual de obtención a partir de un tejido
biológico (hígado, extracto vegetal, extracto microbiano, etc.) es:
a) Homogeneización con un componente hidrofóbico.
b) Metanol-agua para favorecer el choque osmótico con el agua.
c) Cloroformo para solubilizar la parte lipídica con mayor facilidad.
d) Extracción
e) Reparto
f) Separación: a nivel analítico (cromatografía en capa fina) o a nivel preparativo
(cromatografía de adsorción).

19
 El análisis detallado de cada uno de los ácidos grasos que forman parte de él se realiza
mediante una hidrólisis de los glicéridos hacia ácidos grasos. En biomoléculas no volátiles (como
esta) es difícil hacer uso de cromatografía líquida y detección de espectrometría de masas. Los
ácidos grasos admiten un procedimiento con derivación volátil que es más sencillo. Para este
método se hidrolizan los glicéridos en presencia de una base (hidróxido sódico/ potásico) y
disuelto en metanol. Por una parte, la base hidroliza el glicérido en glicerol + ácidos grasos, y por
otra; el metanol transesterifica los ácidos grasos generando ésteres metílicos y ácidos grasos. Por
último, sí se podrían analizar con cromatografía líquida o gases-masas.
Así identificaremos los saturados, insaturados, poliinsaturados o el omega 3 si hubiese.
Los ácidos omega 3 están presentes en algunos vegetales como la chía y el lino, y en algunos
tipos de algas. Una peculiaridad es que el que se obtiene de vegetales es el α-linolénico (18C, 3
dobles enlaces). En algas tienen de 20-22C. Destacan por su importancia el EPA (Ácido
eicosapentanoico) y el DHA (ác. Docosahexaenoico).
Las ventajas de procesar Ac. Omega 3, son sus propiedades saludables. Un inconveniente es
que los dobles enlaces tienden a oxidarse formando epóxidos, hidróxidos e hidroperóxidos. Estos
metabolitos oxidados pierden sus propiedades saludables, y aumentan el estrés oxidativo celular,
el cual contribuye a aumentar el envejecimiento celular, así como a desencadenar diversas
enfermedades, y a amplificar el desarrollo de numerosas enfermedades. A mayor número de dobles
enlaces mayor probabilidad de oxidación, y por tanto mayor inestabilidad de los ácidos grasos. De
ahí que se comercialicen encapsulados en gelatina, para protegerlos contra la oxidación
espontánea.

20
 4.2.-Alternativas para la obtención selectiva de determinados ác. grasos

Lipasas

Tipos: Gástrica, pancreática, Bacillus subtilis, etc.

★ Recordemos:
Siempre que hablamos de enzimas predominan las enzimas microbianas; especialmente
bacterianas o fúngicas. En menor cantidad se usan enzimas vegetales (papaína, látex, etc.)

Distintas lipasas hidrolizan selectivamente distintos enlaces.

Lípidos volátiles

Se pueden obtener con disolventes, someterlos a reparto y después evaporar el disolvente a

vacío, y a partir de ahí concentrarlo y procesarlo.
A nivel industrial se obtienen mediante destilación
por arrastre a vapor. En este caso partimos de una
caldera de agua que genera vapor de agua que atraviesa
un alambique que está lleno de biomasa vegetal. La
corriente de vapor de agua arrastra físicamente todas las
biomoléculas. Luego se condensan en un serpentín con
refrigerante y pasan por un vaso florentino donde se
separan según su densidad. (Las menos densas flotan).
La parte menos densa constituirá el aceite esencial y la más densa el hidrolato/hidrosol/agua
floral/agua micelar.
Alta temperatura de procesado: 110- 120ºC.
Ciclo de extracción y de obtención de moléculas hidrofílicas + lipofílicas.

21
 Hidrodestilación

La biomasa se encuentra sumergida en agua líquida que se calienta y tenemos por tanto una
extracción líquido-sólido y gas-sólido. (La anterior era solo gas-sólido) De
nuevo se realiza a alta temperatura, se realiza un ciclo de extracción lo
demás es igual que antes.Soxhlet
Para esta extracción tenemos un matraz con un disolvente, un cartucho
de celulosa donde está la biomasa y una conexión que permite calentar el
matraz y evaporar el disolvente, llega a un refrigerante, donde se condensa
el disolvente, cae al cartucho con la biomasa, disuelve las biomoléculas
aumenta su nivel de líquido y con el sifón vuelven a caer. Este ciclo se
realiza varias veces.
Como extractor podemos hacer uso de agua o de cualquier otro disolvente orgánico. Con
ciclo de extracción donde obtenemos: Biomoléculas Volátiles hidrofílicas + lipofílicas o no
volátiles H/L.

Se parte del disolvente en amarillo que se calienta y se evapora, se condensa en el

refrigerante y en estado frío cae en la biomasa y se comienza a hacer la extracción. Va avanzando
la extracción, por lo que el color pasa de amarillo a verde. Cuando tiene el nivel suficiente, cae el
extracto al matraz. Se calienta haciendo ciclos sucesivos.

22
 Fluidos supercríticos

La materia tiene varios estados e interfases entre ellos.

En función de la temperatura o presión tenemos gas, sólido o
líquido. Existe un punto triple en el que coexisten las 3 fases.
También tenemos el punto crítico que corresponde a una
presión y temperaturas críticas por encima de las cuales la
materia alcanza un estado denominado fluido supercrítico.
Es un estado intermedio entre gas y líquido en el que la
materia se maneja como si fuera un líquido, aunque tenga una
viscosidad muy baja como la de un gas.
Es muy importante a nivel biotecnológico el CO2, en estado supercrítico, porque su
temperatura crítica es de 40ºC y presión crítica de 70 atm. Manteniendo esta temperatura se
deterioran poco las moléculas, y con una presión superior a 70 atm podríamos hacer un extracto
supercrítico de los metabolitos.
Son necesarios extractores de acero inoxidable y juntas de alta
presión. Después se dan unas posibles condensaciones parciales.
Conforme bajamos la temperatura se van condensando las distintas
macromoléculas. Al bajar del todo la presión, el CO2 pasa al estado
gaseoso y obtenemos un extracto sin disolvente.
Un inconveniente es que el CO2 es hidrofóbico, por lo que solo es eficaz para extraer
moléculas altamente hidrofóbicas o apolares. Si queremos obtener biomoléculas de polaridad
intermedia hay que combinar el CO2 supercrítico con etanol, aumentando la temperatura
supercrítica. En este caso se dañan fácilmente las biomoléculas y, además, el extracto se obtiene
con mezcla de etanol. Es un proceso biotecnológicamente muy caro para construir y mantener. En
la industria se usa el hexano porque es más barato.
Otras de las utilidades de los fluidos supercríticos es su capacidad para generar
nanopartículas. Si recordamos, una de las propiedades de los fluidos supercríticos es que se trabaja
con ellos de forma similar a como se haría con un líquido, pero estos fluidos presentan una alta
difusividad (componente en gas), por lo que su viscosidad es minúscula, y ello permite que,
acoplado a un nebulizador, generen nanogotas invisibles a simple vista.

23
 Para ello existen 2 estrategias:
1.- RESS (Expansión Rápida de
Disoluciones Supercríticas):
Se solubilizan los metabolitos objetivo
en el seno del CO2 supercrítico con un
componente adicional como puede ser un
biopolímero. Posteriormente se procede a
bajar la presión condensándose el CO2, se
solubiliza, y se insolubilizan las
nanopartículas, todo ellos aplicando un
nanonebulizador.
2.- SAS (utilización de fluidos supercríticos
como antisolventes):
Al principio tendremos las moléculas
solubilizadas en un disolvente apropiado e
incorporamos un agente encapsulante sobre un
biopolímero.
En este caso, las moléculas serían
hidrofílicas e insolubles en CO2 (apolar), por
tanto, al pasar una corriente de CO2 por el nanonebulizado generaría unas nanopartículas, al usar
el CO2 supercrítico como antidisolvente precipitarían. Por lo que en verde obtenemos metabolitos
hidrofílicos (polar) y en azul hidrofóbicos.
Los metabolitos hidrofílicos se encuentran en disolución (verde oscuro), acompañados de un
disolvente (verde pálido), un encapsulante (naranja) y un polímero o biopolímero (granate).
Después, se introduce CO2 (azul) que es apolar y actúa como fluido supercrítico antidisolvente
(SAS), provocando la precipitación de los metabolitos hidrofílicos encapsulados con el
encapsulante + (bio)polímero. Finalmente, se disminuye la presión y el CO2 se volatiliza como
gas, para recuperar las nanopartículas con metabolitos hidrofílicos
Este procedimiento puede llevarse a cabo con cualquier disolvente; no tiene por qué ser un
fluido supercrítico (siempre teniendo en cuenta que el fluido supercrítico va a dar lugar a
nanopartículas y el fluido líquido solo micropartículas).

Dispersiones

En el ámbito farmacológico y ambiental predominan las dispersiones, no las disoluciones.

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 En las dispersiones tenemos mezclas heterogéneas: un amplio conjunto de sistemas con una
fase minoritaria o dispersa distribuida en el seno de una fase mayoritaria o dispersante. La
distribución de las partículas minoritarias en fase dispersante da lugar a 3 sistemas:
- Monodispersos: cuando todas las partículas del mismo tamaño.
- Polidispersos: cuando tienen distinto tamaño.
- Sistemas coloidales: son aquellos cuyas partículas tienen un tamaño comprendido entre
0,01-1 μm.
Estas dispersiones tienen una tendencia a su separación eléctrica; es decir, son muy
inestables, por lo que hay que aumentar esa estabilidad.
Métodos habituales de separación:
● Floculación: agregación de partículas. Es reversible.
● Coagulación: agregación de partículas. Es irreversible.
★ Recordemos:
La coagulación se produce por la eliminación de las capas eléctricas que rodean a las
partículas coloidales con la formación de núcleos microscópicos. La floculación consiste en la
aglomeración de partículas desestabilizadas primero en microflóculos, y más tarde en
aglomerados llamados flóculos.

En estos dos métodos podemos apreciar 2 fases, una sometida a sedimentación y otra
sometida a descremado o flotación situada en la parte superior.
En el cuadro encontramos distintos tipos de dispersiones, por ejemplo, los aerosoles. En
ellos, la fase minoritaria son las cenizas y la fase mayoritaria aire; el zumo sólido-gas.
Las más importantes y utilizadas en farmacología son las
emulsiones. Tendremos una dispersión líquido-líquido (fase
minoritaria líquida inversa en el seno de otra fase mayoritaria
líquida e inmiscible en la otra). Podemos tener dispersiones O/L
(componente minoritario oleoso en el seno acuoso que es
mayoritario).
Ej: la leche, con componente minoritario glóbulos de grasa en el componente líquido agua.
La margarina sería lo opuesto: L/O.

25
 Tensioactivos

Un componente de gran utilidad para aumentar la estabilidad de las dispersiones son los
tensioactivos, que se caracterizan por ser moléculas anfifílicas (o anfipáticas) que tienen una parte
polar que es la cabeza y una parte hidrofóbica que el resto del cuerpo. Se clasifican en:
- Los tensioactivos iónicos: se caracterizan por tener una cabeza polar con carga positiva
(catiónica), negativa (aniónica) y zwitteriónica (carga positiva y negativa simultáneamente,
como por ejemplo la leucina)
- Los tensioactivos iónicos: cuya cabeza polar no tiene carga (ejemplo: el Brij)
- Sulfobetainas no detergentes: son zwitteriónicos, es decir que tienen la carga positiva y
negativa al mismo tiempo.
Sus propiedades facilitan la constitución de micelas y la estabilización de partículas en el
seno de las disoluciones. Estas propiedades son:
-Número de agregación (AN): es el número de partículas del tensioactivo que
constituyen una micela, puede determinar dividiendo la masa de micela entre la masa de
los monómeros.
-HLB balance hidrófilo lipófilo: hace referencia que lo tensioactivos HLB<7 serán
solubles en aceite y los que tengan un HLB >7 solubles en agua, por tanto, los primeros se
utilizan para emulsiones waldtraut (fase dispersante areosa) y la segunda para fase
dispersante acuosa. Los tensioactivos con HLB entre 12-20 son los elegidos para
solubilizar proteínas intrínsecas de membrana (Ejemplo: crypton).
-CMC (concentración micelar crítica): concentración a partir de la cual se agregan las
partículas de tensioactivo en la micela correspondiente. Se puede determinar con distintas
técnicas.
-Temperaturas críticas (CT). Hay distintos tipos, como la temperatura micelar crítica
que es la temperatura a partir de la cual se favorece la constitución de micelas. Otra muy
importante es el punto de nube, que es la temperatura a partir de la cual se agregan las
micelas formando unos macroagregados supramoleculares que sedimentan.
El método a usar si queremos separar proteínas intrínsecas de membrana sería el siguiente:
primero trabajamos a una temperatura inferior a la del punto de nube, donde tenemos una
dispersión uniforme, en la que proteína se va a solubilizar. A continuación, elevamos la Tª por
encima del punto de nube y se produce un reparto de fases: las micelas se agregan precipitando y
con ella precipitan las proteínas hidrofóbicas que se asocian a ella, mientras que las hidrofílicas
quedan en la superficie flotando. Después, mediante cromatografía se purifica.

26
 Una vez se ha obtenido el extracto tendríamos nuestra enzima arrastrada que podría
perjudicar la cromatografía. Por ello existen métodos para separar al tensioactivo. (Hay varias
cromatografías, diálisis, etc... Solo es necesario saber que existen, y que se debe eliminar el
tensioactivo que previamente ha permitido la solubilización de la muestra).
El último paso sería la elección del tensioactivo. En la elección es necesario conocer las
propiedades del tensioactivo que se va a utilizar. Si nuestro objetivo es solubilizar proteínas de
membrana, es necesario que el tensioactivo no absorba a 280 nm porque es la absorbancia a la que
se va a monitorizar la purificación y la actividad de las proteínas a estudiar.
También es preferible que no interfiera con la actividad enzimática de la proteína y que
permita ese reparto de fases necesario para su purificación.

Vesículas
Micelas inversas. Están constituidas por agentes tensioactivos y co-
tensioactivos, dan lugar a una micela con la estructura de la imagen. En estas
micelas los metabolitos hidrofílicos se sitúan en el interior, mientras que las colas
hidrofóbicas (apolares) se sitúan hacia fuera, hacia el disolvente. De esta manera,
podemos estudiar metabolitos o proteínas hidrofílicas que se encuentren en el seno de un
disolvente apolar, para que realicen la reacción inversa a la que realizaron en un disolvente
hidrofílico. Por ejemplo, la hidrolasa en un disolvente acuoso va a hidrolizar, pero en medio no
acuoso va a condensar.
Las micelas inversas tienen la característica de son dinámicas, es decir tienen cierta
tendencia a fusionarse unas con otras y cambiar su contenido (intercambio).

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 Una propiedad a considerar es que combinando distintos tipos de tensioactivos podemos
llegar a optimizar la dispersión a la que trabajamos e incluso trabajar con biopolímeros
inteligentes; es decir, que con un pequeño cambio en las condiciones experimentales se provoca
un gran cambio en la dispersión.
Por ejemplo, con un pequeño cambio de pH podemos pasar de una dispersión de agua en
aceite a una de aceite en agua (es decir hay intercambio de fases); lo que resulta eficaz para obtener
emulsiones definitivas en farmacología. Esto a su vez permite un descenso del tamaño de la
partícula favoreciendo su estabilización.
Emulsiones. Para la elaboración de emulsiones existen
multitud de posibilidades. Se combinan los componentes de los
tres tipos: componente hidrofílico (w), componente hidrofóbico
(O) y los tensoactivos o cotensioactivos (S). No existe una teoría
que nos indique qué emulsión vamos a obtener de las
combinaciones, sólo se sabe mediante la experimentación (ensayo
error).
Así se obtienen emulsiones de aceite en agua, fase de cristal líquido, macroemulsión,
microemulsión, nanoemulsión etc. Las empresas farmacológicas suelen indicar con un triángulo
el tipo de emulsiones que pueden conseguir.
Para obtener nanoemulsiones es necesario la incorporación de una dispersión mediante
ultrasonidos (las ondas viajan a través del líquido). En concreto se van a utilizar unas sondas fijas
(sonotrodos), que concentra la totalidad de la energía en el extremo del sonotrodo, cuyas ondas
sónicas cavitan (explosión hacia adentro). Esto provoca la ruptura de las moléculas, disminuyendo
drásticamente el tamaño dando lugar a nanopartículas. Esto se debe a la energía de las ondas
sónicas. Cuando esta energía choca contra la materia provoca excitación de los electrones, que al
relajar emiten luz (sonoluminiscencia).

Liposomas

Los liposomas son partículas de especial utilidad para la elaboración de fármacos y

medicamentos.
En este caso partimos de una serie de lípidos, en los que aplicamos un procedimiento
estandarizado de hidratación y agitación obteniendo vesículas multilaminares (MLV). Es el
equivalente a múltiples bicapas lipídicas una dentro de la otra (concéntrica). Por ejemplo, en la
imagen siguiente hay 3 bicapas. En rosa está la cabeza pola y en amarillo la cola apolar.

28
 Aplicando una extrusión, es decir, pasando esas vesículas a través de una jeringa
con un diámetro estrecho, podemos obtener vesículas unilaminares grandes (LUV).
Si después aplicamos ultrasonidos rompemos esas vesículas y pasamos a tener
vesículas unilaminares pequeñas, de nanotamaño, (SUV). Por último, realizamos una filtración en
gel, y de ella saldrán primero los metabolitos incluidos en esas vesículas y después los metabolitos
insolubles en ellas
Una utilidad de los liposomas consiste en que en el exterior de la bicapa lipídica están los
metabolitos hidrofóbicos, y en el interior de las vesículas los metabolitos hidrofílicos,
permitiéndonos utilizarlos como vehículo para la liberación de fármacos hidrofílicos e
hidrofóbicos. En muchas cremas se dice que incluyen liposomas. Esto quiere decir que los
liposomas de la crema se van a fusionar con la piel permitiendo la incorporación a la misma de los
metabolitos que transporta.
El pH ácido del estómago hace que la mayoría de los fármacos sean degradados antes de que
ejerzan su acción, por ello se suministran a través de la piel cuyo pH ronda los 5-5.5, donde va a
actuar como cosmético para la epidermis y como fármaco en la dermis.
La utilidad de los liposomas se puede potenciar incorporando a la capa lipídica elementos
que les sirva como recubrimiento para facilitar la evasión inmunitaria y le aporta dirección
selectiva.
En la imagen se muestra un equipo típico de laboratorio que permite la obtención de
liposomas y también tenemos un medidor de masas con dispersión láser dinámica. La carga de las
moléculas se mide mediante una electroforesis capilar que va a determinar su potencial de carga
Z y que está incorporada al equipo.
Si todas las nanopartículas tienen carga negativa habrá una repulsión entre ellas que facilitará
la estabilización de la dispersión. En cambio, si todas tienen carga neta positiva también habrá
repulsión y se estabiliza, mientras que, si no tienen carga, las moléculas tienden a agregarse e
inestabilizar la dispersión. De ahí la importancia de que las nanopartículas estén uniformemente
cargadas. En ocasiones se les añaden tensioactivos catiónicos como SDS (carga negativa),
biopolímeros como alginatos (carga negativa) o polisacáridos como el tosilato (carga positiva).

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 Se pueden combinar los liposomas y las emulsiones con la obtención de nanopartículas.
También se pueden mezclar otras técnicas.

Nanosoportes

Los nanosoportes son elementos adicionales que se incorporan al liposoma para facilitar la
evasión del sistema inmunitario. Pueden ser:
-Micelas convencionales: vamos a hablar en concreto de liposomas
cuando esté constituida bicapa lipídicas (3 tipos que hemos visto antes).
-Niosomas: cuando utilizamos tensioactivos no iónicos.
-Transferosomas: cuando se combinan distintos tipos de agentes
superficiales para estabilizar la emulsión.
-Etosomas: partículas de etanol que se encuentran en un medio
hidrofóbico.
Además, también podemos tener partículas con
encapsidación matricial, donde tenemos los analitos (punto
rojo) está distribuido aleatoriamente por toda la nanopartícula, o
bien nanopartículas nucleares, donde los metabolitos activos
están en el núcleo de la nanopartícula y tienen un recubrimiento
a modo de piel como protección.
Inicialmente se desarrolló como polímeros sintéticos y ahora se utilizan biopolímeros que
son menos tóxicos, biodegradables, etc.

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 Estas nanopartículas se utilizan como vehículos para la administración de fármacos; no sólo
por la vía intravenosa, en cuyo caso es necesario el empleo de protectores que le permitan evadir
el sistema inmune, sino también a través de la piel, utilizando equipos de electroporación que le
permitan su incorporación, primero a través de la epidermis y después a la dermis, donde pasa a
los capilares.
Esto solo para fármacos. Para cosméticos es necesario que tenga un efecto local, solo en la
epidermis. No tienen que atravesar la dermis porque causan efectos anómalos en el organismo.

Extracción L/L
El sobrenadante obtenido en la extracción S/L podemos someterlo a
una extracción L/L, en los que se emplean distintos sistemas. Para ello,
colocamos nuestra muestra a través de un dispositivo en pequeñas gotas las
cuales atraviesan dos disolventes: uno más denso (ej: el agua) y otro menos
denso (ej: hexano). El resultado es que al final las biomoléculas se separan
según su polaridad en el disolvente más denso o menos denso. Si fuera
cloroformo sería al revés, estaría debajo del agua.

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 En estos sistemas también hay una escalada hacia columnas
industriales. Nuevamente vamos a colocar nuestra muestra entrando
en un disolvente, que a su vez se va a poner en contacto con otro
disolvente, normalmente en contracorriente; para que los
metabolitos se distribuyen entre ambos disolventes: entra un
disolvente pesado por arriba y otro más ligero por abajo en
contracorriente, y así se facilita la distribución de los 2 metabolitos.
Los disolventes entran en un flujo laminar e interaccionan con los
elementos fijos y móviles de la columna.
En la imagen de arriba vemos una columna impulsada que
interacciona con los elementos móviles para aumentar la superficie
de contacto de ambos disolventes y los metabolitos se distribuyen
de forma equivalente.
En las columnas estáticas (imagen de la izquierda), la fase
ligera entra por abajo y sale por arriba, y la fase pesada del revés.
Hay unos surtidores por arriba. Ambos disolventes van cayendo y
resbalando por bandejas laterales y centrales. A efectos prácticos la
muestra se va distribuyendo por todas las bandejas, contacta un
disolvente con otro, y así se distribuye el metabolito de forma
equivalente.
En otro ejemplo similar al anterior tenemos unas bandejas en
el lado lateral, pegadas al contactor que son fijas, y otras bandejas
situadas en los centros que son giratorias. Al girar van renovando la
superficie de contacto y así favorecen la reparación del metabolito
en 2 fases. Se da una distribución líquido-líquido en la columna de
intercambio.
Tenemos que tener en cuenta que cada fabricante intenta
optimizar estos procesos de extracción líquido-líquido. Para ello se
incluye un refinamiento posterior, donde utilizamos por ejemplo la
destilación fraccionada.
Por ejemplo, cuando tenemos aceites esenciales con 100
metabolitos volátiles; estas muestras se colocan en columnas que
mediante destilación por arrastre de vapor o hidrodestilación
podemos destilar metabolitos volátiles y aislarlos. Este sería un ejemplo de refinamiento posterior.

32
Encapsulación
Es otro método empleado para recubrir los ácidos grasos omega 3, los cuales se caracterizan
por presentar un creciente número de dobles enlaces, los cuales resultan beneficiosos para el
organismo, pero que son altamente inestables.
En los ácidos grasos a mayor número de dobles enlaces mayor inestabilidad para ello se
protegen mediante la encapsidación en gelatina, en maltodextrinas, etc.
Para producir cápsulas primero se incorporan los metabolitos en su interior y se cubren con
una cubierta. Normalmente se emplean polímeros (proteínas, polisacáridos, polímeros
sintéticos…) aunque la tendencia actual es que sean biopolímeros, para que puedan ser degradados
en nuestro organismo sin ser dañinos para nuestro propio metabolismo.
Las cápsulas van a actuar como soporte para ingredientes alimentarios, vehículos para
cosméticos, etc.
Las ventajas de la encapsulación se resumen en que se protege la integridad del metabolito
y al mismo tiempo se facilita la liberación gradual en el intestino o el estómago en caso de vía oral
o en otras partes, como el plasma por vía intravenosa.
Hay múltiples utilidades de las cápsulas en el mundo farmacológico y cosmético. Tenemos
2 tipos de cápsulas:
- Cápsulas matriciales: en ella los metabolitos están igualmente distribuidos en el conjunto
de la cápsula.
- Cápsulas nucleares: metabolitos altamente concentrados en el interior de la cápsula y
rodeados de una cubierta considerable en el proceso de formación.
Hay una variante en la que se presenta una encapsidación doble.
En la imagen superior podemos
observar una encapsidación simple que
tienen en su interior metabolitos. Pueden ser
matriciales o nucleadas. En la imagen
inferior tenemos gotas que tienen un interior
rojo y un exterior transparente.
Las gotas simples se producen porque hay un nebulizador simple que va cortando las gotas
en nanogotas, microgotas y miligotas.
En la imagen inferior en la que vemos una zona interna roja y una externa transparente, se
debe a que hay doble nebulizador anidado: un nebulizador interno que genera una cápsula de color
rojo en cuyo interior ya esta los metabolitos, y además, esta cápsula está rodeada por un cápsula
externa incolora formada por el nebulizador externo.

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 Por ejemplo, podemos tener unos metabolitos encapsulados en una cápsula interna de
alginato (polímero cargado negativamente) y una cápsula externa de quitosano (polímero cargado
positivamente). Estas dos cargas hacen que se estabilice la cápsula conjunta y como externamente
tendrá carga negativa, se repelerán unas cápsulas con otras evitando así la agregación.
EQUIPOS DE ENCAPSIDACIÓN
El primer equipo que vamos a ver se denomina nano nebulizador y se
utiliza cuando tenemos muestras de muy bajas viscosidad y que, por tanto,
se pueden fragmentar en gotículas muy pequeñas. Las cápsulas son de muy
pequeño tamaño (del orden nanométrico) y para ello tenemos un nebulizador
por ultrasonido y un extracto líquido de muy baja viscosidad, que se
aproxima al fluido supercrítico.
En la imagen de la derecha está el siguiente nivel de equipo que nos daría microcápsulas y a
la derecha está otro que nos daría cápsulas de tamaño milimétricos.

La tecnología que se utiliza para obtener cápsulas nanométricas y micrométricas se

denomina secado por nebulización y la que genera partículas milimétricas se origina por
perdurado por vibración. Ambos métodos son utilizados en la industria farmacológica,
cosmética y alimentaria.
La técnica de secado por nebulización consta de la serie de
elementos que aparecen en la diapositiva.
1.- Se introduce la muestra que se mezcla con el disolvente.
2.- Atraviesa el nebulizador, el cual está sometido a una corriente
de aire caliente. Entra el aire frío ((1) azul) y se calienta en el módulo
naranja.
3.- Al encontrarnos con que el nebulizador (2) fragmenta el
líquido y llega el aire caliente ((3) rojo), este aire va a evaporar el disolvente, de manera que nos
quedamos con las partículas sólidas, las cuales sedimentan por gravedad.
4.- El aire al avanzar por la columna, se enfría (4) y se vuelve a condensar el disolvente, el
cual se reutiliza.

34
 Además, si tenemos partículas cargadas, las podemos obtener por atracción electrostática
(5). En (5) tenemos un electrodo con carga neta negativa colocado abajo, de manera que las
partículas cargadas positivamente se quedan pegadas a este electrodo. Por el contrario, si el
metabolito está combinado con alginato u otra sustancia cargada negativamente, se une al cátodo
y así separamos los metabolitos.
Hay que regular la temperatura para evitar que se deteriore la muestra. Un ejemplo sería el
siguiente: la temperatura de secado podría empezar a 100 grados al principio del nebulizador y
bajar a 80 ºC al salir del nebulizador. Pero si el proceso dura poco (2 segundos) los metabolitos no
se deterioran. Si el disolvente es agua debemos calentarlo a 100ºC como mínimo. Si en lugar de
agua tenemos las partículas en etanol se evapora más rápidamente. Después este disolvente se
condensa y lo recuperamos.
Como resultado esta técnica va a tener 2 grandes ventajas: la primera es que no
contaminamos el ambiente, se evitan multas por contaminación ambiental, y la segunda es que
ahorramos económicamente ya que reutilizamos el disolvente.
También, para evitar la oxidación de los metabolitos,
en lugar de secar con aire secamos con nitrógeno. Para ello
hay un generador de nitrógeno en el cual a partir del aire
obtenemos nitrógeno purificado. Otro mecanismo es
controlar la temperatura para que no sea excesivamente
alta y así conservar la partícula. En la siguiente imagen,
vemos el equipo anterior pero sometido a un medio inerte
con nitrógeno. Otra posibilidad es que combinemos el nitrógeno con CO2. Esta combinación es
todavía menos oxidante.
En cualquier caso, las nanopartículas y micropartículas que se obtienen tienen una cierta
polidispersidad. Dentro las nanopartículas son de 10-100 nanómetros; en las micropartículas de 1
a 100 micrómetros. Habría que medir el tamaño de cada partícula mediante la dispersión láser
dinámica.
Garantizamos la inercia, como ya hemos dicho antes, con gas libre de oxígeno e incluso
podemos aplicar condiciones estériles dentro del tubo secado obteniendo nanopartículas y
micropartículas estériles para fármacos, farmacosméticos etc.
En farmacosmética, la esterilización se consigue por una parte con algunos instrumentos
específicos que manejan los extractos de metabolitos, y por otra parte con las salas blancas. En las
salas blancas tendríamos el equivalente a una cabina de flujo laminar en una habitación, con una
presión de aire desde arriba hacia abajo, de manera que si abrimos una puerta el aire limpio salga

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al pasillo, en lugar de entrar el aire sucio. Luego tendríamos un segundo nivel de presión desde el
pasillo al recibidor, y por último tendríamos un tercer nivel de presión desde el recibidor hacia
donde se cambia el personal, que sería en otra sala esterilizada.
Para obtener nanopartículas se necesita una viscosidad menor de 20 cps. La viscosidad del
agua es 1 cps. Si es superior a esa no se pueden obtener partículas de tamaño nanométrico con el
nanonebulizador.
En la siguiente diapositiva se representa un nebulizador que genera microcápsulas.
Volvemos a tener unos componentes similares al nebulizador que genera nanopartículas.
Tenemos la muestra disuelta y la pasamos por un nebulizador
que rompe la columna líquida en micropartículas. A continuación,
entra un corriente de aire de secado; primero fría, luego se calienta y
seca el disolvente en el separador ciclónico (6) de las micropartículas,
las cuales debido a que son micropartículas sólidas sedimentan por
gravedad (no hace falta aplicar corriente eléctrica, y al final del
dispositivo el disolvente se vuelve a condensar y se reutiliza.
Nuevamente, para evitar la oxidación de los metabolitos se recomienda utilizar nitrógeno o
nitrógeno + CO2 en lugar de aire y controlar el proceso de secado para que sea rápido y a una
temperatura adecuada que no dañe a los metabolitos.
El proceso se puede regular optimizando varias constantes. En el cuadro se muestran todas.
Las más importantes son las que tienen la flecha azul gruesa.

Para obtener las microcápsulas requerimos que la viscosidad sea menor de 300 cps.
Las micropartículas se utilizan para encapsular fármacos que se utilizan en aerosoles, como
el asma.
Estos procesos se pueden escalar a nivel industrial, con los secadores industriales.

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 Por último, vamos a estudiar los equipos que producen milipartículas. En este caso, la
tecnología de trabajo que se utiliza es el perdurado por vibración, que es una vibración
concentrada. En vez de dar cápsulas matriciales nos produce cápsulas nucleadas. Tenemos los
metabolitos en el núcleo de la cápsula y una envuelta polimérica en el exterior. En la imagen vemos
representado el proceso. En este caso podemos obtener milipartículas secas, húmedas (cuando se
proyectan las partículas sobre un disolvente de gelificación*) o estériles (el conjunto del tubo se
puede esterilizar obteniendo milipartículas estériles).
*Ejemplo: si tenemos los metabolitos en cloruro sódico y debajo hay cloruro de potasio, el
metabolito pasaría a este último y gelificaría.

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