TEMA 2.

- METABOLÓMICA
ESTRUCTURAL
Índice
1. Introducción ...................................................................................................................... 1
2. GC: Cromatografía de gases .............................................................................................. 3
2.1.- Accesorios ......................................................................................................................... 5
2.2.- Análisis de datos ............................................................................................................... 5
3.- Cromatografía líquida de alta resolución ...................................................................... 5
3.1.- Detectores de cromatografía LC-MSD .............................................................................. 9
3.2.- LC-MSD: Bases de Datos ................................................................................................. 11
3.3.- Selección de métodos ..................................................................................................... 12
4.- Metabolómica dirigida o no dirigida ........................................................................... 13
5.- Estructura/función: QSAR ........................................................................................... 14
6.- LADMET ....................................................................................................................... 16
7.- Estudios QSAR ................................................................ ¡Error! Marcador no definido.
7.1.- Diseño de nuevos fármacos ............................................... ¡Error! Marcador no definido.
7.2.- Optimización de fármacos: Descriptores estructurales ..... ¡Error! Marcador no definido.
7.3.- Optimización de fármacos: Relaciones QSAR .................... ¡Error! Marcador no definido.
7.4.- Optimización de fármacos: Ensayos clínicos................................................................... 16
1. Introducción
Para el estudio metabolómico de una muestra se realiza un proceso que consta
de tres fases: metabolómica preparativa (ya dada), metabolómica estructural y
metabolómica funcional. El proceso de trabajo de una muestra consta de:

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 En este tema vamos a estudiar conceptos relacionados con la estructura de extractos
que podemos obtener (metabolómica estructural).
Cuanto mejor sea el trabajo que realizamos en metabólica preparativa mejor será el
resultado que estudiaremos en metabólica estructural; si cometemos un gran error a nivel
de metabolómica preparativa todo lo que venga después será erróneo.
Los tipos de estudio que se pueden llevar a cabo son:
1.- Estudio del perfilado (morado): con este tipo de estudio lo que queremos
averiguar es el tipo de metabolitos presente en nuestra muestra biológica: humana,
vegetal, bacteriana o microbiana. Según el tipo de molécula que buscamos aplicaremos
unos tipos de técnicas u otros. De manera que, si queremos aislar moléculas volátiles,
utilizaremos la cromatografía de gases; y si queremos metabolitos no volátiles,
utilizaremos la cromatografía líquida.
2.- Estudio de identificación (azul): ya tenemos una idea de si son glúcidos,
lípidos, etc. Entramos en el estudio de identificación de los metabolitos. De esta manera,
si tenemos metabolitos volátiles o derivados volátiles, combinaremos cromatografía de
gases-masas. Ocasionalmente, cuando ya tengamos algún metabolito puro, podemos
confirmar su estructura mediante resonancia magnética nuclear.
• Ventajas de la RMN: es la técnica más potente para identificar la estructura de
cualquier metabolito.
• Inconvenientes: la muestra tiene que estar pura y en altas concentraciones.
Este tipo de estudio será singular: no siempre vamos a poder unificar el metabolito.
Normalmente trabajamos con extractos, es decir, trabajaremos con un conjunto de
metabolitos que vamos a tratar de identificar a través del menor número de pruebas
posibles. De ahí la utilidad de la cromatografía gas-masa para identificar muchos
metabolitos simultáneamente.
3.- Estudios de validación (verde): ya hemos estudiado el tipo de metabolito que
estamos utilizando o que hay en nuestra muestra. También hemos identificado nuestro
metabolito de interés. A continuación, queremos validar cuáles son los principales
metabolitos que caracterizan esa muestra en particular (tejido, órgano…). Es decir, se usa
para establecer los principales metabolitos que forman la muestra biológica. De los 1000
metabolitos que hay en una muestra hay unos metabolitos que serán de abundancia alta,
otros de abundancia media y la gran mayoría estarán en la línea base del cromatograma.
La inmensa mayoría de metabolitos de las rutas metabólicas que hemos estudiado se
encuentra en la línea base porque están participando en producción de energía. Sin
embargo, los metabolitos del metabolismo secundario aparecen en picos enormes, porque
no están implicados en estas rutas. Sus funciones son específicas, como por ejemplo de
protección, por lo que no requiere su síntesis constante. Se evalúa si son representativos
de un órgano, tejido, etc.

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 Es importante el uso de técnicas estadísticas multilaminares para saber si la
concentración del metabolito es significativamente diferente entre una muestra y otra, y
confirmar si realmente hay diferencia entre ellos. También nos va a permitir identificar el
conjunto de metabolitos de cada órgano, tejido, planta, algas medicinales, etc. y
comprobar si hay diferencias entre unos y otros o si, por el contrario, se puede reagrupar.
Los estudios 2 y 3 se combinan con análisis estadísticos.
4.- Interpretación (rojo): con la gran complejidad de la biodiversidad de los
metabolitos, tendremos proteínas con distintos orígenes que realizan funciones similares
y estudiaremos la relación que existe entre los individuos que los presentan. También
podemos caracterizar distintos metabolitos que elabora el organismo de una persona
enferma, y hacer un tratamiento clínico acorde con la patología de la persona.
A partir de esta interpretación, intentaremos encontrar aplicaciones
biotecnológicas, preferentemente individualizadas hacia cada persona (medicina
dirigida).

2. GC: Cromatografía de gases

Estudiando metabolitos volátiles o derivados volátiles utilizaremos cromatografía
de gases acoplada a espectrofotometría de masa. Estos equipos trabajan 24 horas/día.
Tenemos 2 programas de control. Uno de ellos controla el programa y almacena los datos,
y el otro componente es un analizador, que nos va a permitir que simultáneamente a la
realización del cromatograma, vayamos analizando los picos que aparecen. El coste del
equipo es muy caro.
El cromatógrafo de gases se compone
de un horno central en el que se encuentra
la columna capilar, hueca por dentro y con
una fase estacionaria adherida a la pared.
Tiene una longitud de entre 10-30 o 60
metros. La presión es la misma. A través
del inyector se introducirá la muestra
líquida. Hay dos accesorios para poder
inyectar la muestra dependiendo de si son
mezclas gaseosas, mezclas sólidas, etc. A continuación, actúa un gas impulsor que
arrastra la muestra. A medida que vayan saliendo, irán pasando por el detector de
espectrometría de masas, que va fragmentando el metabolito y estos van a construir un
espectro de masas. La suma de todos los espectros se integrará, se representará el pico, y
luego en el análisis de datos al marcar el pico en el cromatograma, aparecerá debajo su
espectro de masas.
El gas impulsor o portador puede ser helio (He); pero
sus reservas son muy escasas, aunque se sigue utilizando en
procesos de RMN. El hidrógeno (H2) es la mejor opción para
la cromatografía de gases, ya que se obtiene por electrólisis

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y proporciona una mejor resolución. Otra opción es usar gas nitrógeno (N2), pero es la
peor. 2 𝐻2 𝑂 (𝑙) → 2 𝐻2 (𝑔) + 𝑂2

La inyección se realiza con un automuestreador que cuenta con diversos

accesorios para inyectar muestras líquidas, gaseosas o sólidas.
La separación se produce en el seno de la columna que puede tener una F.E. polar
o apolar.
La F.E polar es apropiada para la separación de metabolitos relativamente polares
como los ésteres metílicos o ácidos grasos. Serían columnas WAX que contienen
polietilenglicol unido a la F.E.
Para metabolitos apolares (hidrocarburos, compuestos aromáticos, etc.) se utiliza
una FE derivados de polidimetilsiloxano (apolar).
En el seno del horno hay un gradiente de temperatura, inicialmente lineal desde 60-
270 ºC en el caso de la apolar o bien de 60-300 ºC en el caso de la polar, ya que resisten
más la temperatura.
La detección se realiza acoplada a espectroscopia de masas con ionizador de
impacto electrónico y analizador de cuadrupolo simple. Este equipo está estandarizada a
nivel internacional.
1.- Modo Scan o barrido. Es el modo a
emplear en análisis cualitativo para la identificación
de compuestos por búsqueda en biblioteca de
espectros, aunque también puede utilizarse para
análisis cuantitativos. Puede usarse junto a la
técnica TIC (Total Ion Chromatogram), un cromatograma creado a partir de la suma de
todos los picos originados en un espectrómetro de masas. Cuando llega una biomolécula,
la fragmenta y detecta todos los fragmentos posibles y los registra en un cromatograma
con recuento total de iones, TIC.
2.- El modo SIN. Es un modo de monitorización individual de iones. En este caso le
indicamos al cromatógrafo que detecte un solo ion específico del metabolito, es decir, le
indica en qué porción se encuentra este ion específico. En este caso obtenemos un
cromatograma de iones extraídos que busca donde hay un ion específico para identificar
y cuantificar, en vez de ver todos los metabolitos a la vez. En modo SIM el MSD es un
detector muy sensible y selectivo. Es el modo que hay que emplear para análisis
cuantitativo de trazas de compuestos conocidos. Puede trabajar junto con EIC (Extracted
Ion Chromatogram), un cromatograma que corresponde a una determinada masa o ion
extraída del barrido.
Para obtener el gas se parte de agua, después se produce el intercambio iónico y se
obtiene el agua de laboratorio de tipo I. A partir del agua ionizada alimentamos
manualmente un generador de hidrógeno y mediante electrólisis nos produce H2 y O2. El
oxígeno se desecha y el hidrógeno se canaliza dentro de la columna.

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 2.1.- Accesorios
Para la cromatografía de gases son recomendables los frascos encapsulados que se
cierran manualmente con tenazas o con los encapsuladores eléctricos.
Las alternativas a los frascos de encapsulación son: frascos de rosca y frascos más
grandes para espacio de cabeza (en este caso la aguja de inyección no inyecta líquido,
inyecta vapor para muestras de origen aromático).
Un accesorio especialmente importante son los insertos que son
tubos estrechos que se colocan en el interior de los frascos y al tener un
diámetro estrecho eleva la muestra para facilitar su inyección. Es muy
útil en caso de muestras escasas (biopsias) o caras (aceites esenciales).

2.2.- Análisis de datos

El análisis de datos se realiza contrastando con las bases de datos con el NIST
(Instituto Nacional de Estándares de Estados Unidos), Wiley o AMDIS. Este último
permite hacer la deconvolución de espectros múltiples.
El programa de control se llama MS Search. Realiza un contraste entre el espectro
de masas experimental y el espectro almacenado en la base de datos. También genera una
tabla de fiabilidad. Después, se puede confirmar la identificación mediante el uso de otras
estrategias como la medida de tiempo de índice de retención lineal y con estándares
comerciales. También puede usarse un programa adicional llamado AMDIS que permite
hacer la deconvolución:
Tenemos 3 componentes puros: azul, rojo y verde.
Cuando veamos un pico muy ancho es posible que
contenga varios picos superpuestos. Podemos tener un
pico mixto (negro) que es la suma de los otros tres. En
esa situación, se analiza el pico con el software AMDIS,
y lo que hace es que lo descompone en los tres
metabolitos que lo forman. A este proceso se lo conoce
como deconvolución.

3.- Cromatografía líquida de alta resolución

En el caso de metabolitos líquidos pasaremos a analizar por HPLC (hasta 400 bares)
o ultraHPLC (>400 bares). Está constituida por módulos y tiene dos componentes de la
FM: un componente más polar y otro más apolar. Para trabajar con componentes polares
podemos utilizar agua y metanol o mejor agua y acetonitrilo. Para trabajar con
componentes muy apolares podemos usar como componente A el acetonitrilo y como B
el tetrahidrofolato. De esta manera, generaríamos un gradiente creciente de B, es decir,
de apolaridad creciente que nos permitiría separar los metabolitos correspondientes.

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 Los disolventes deben estar previamente desgasificados, ya que trabajamos a una
presión muy alta. Para alcanzar las presiones de 400 bares la columna líquida tiene que
ser compacta, ya que el en caso de que tenga burbujas se va a comprimir y descomprimir,
no pudiendo mantener la presión estable, y generando burbujas que alterarían el flujo
dentro de la columna y se distorsiona el cromatograma. Por ello, lo que hacemos es
microfiltrar la fase móvil mediante vacío: se pasa el líquido por una capa porosa y a
medida que va saliendo y va succionando el air y, por tanto, cae el líquido libre de aire
dentro del recipiente. Además, el cromatógrafo contiene un desgasificador de ultrasonido
que refina la desgasificación; pero por sí solo no puede desgasificar. Es necesario una
etapa previa de filtración.
También tenemos bombas A y B que controlan el flujo del disolvente. Después,
tenemos un muestreador que nos permite tomar muestras o inyectarlas 24 horas al día.
Después tenemos el compartimento de columnas, algunas más largas o más cortas, donde
regulamos la temperatura para disminuir la contrapresión. Podemos aumentar la
temperatura para disminuir la viscosidad y a su vez la contrapresión. Por último, tenemos
un detector de absorbancia, fluorescencia, espectroscopia de masa, etc. Ocasionalmente,
podemos acoplar después del detector un módulo fraccionador que recupere las
fracciones, para realizar otros estudios como el de absorbancia UV-VIS.
Se ha comprobado que el descenso del tamaño de la
partícula ha permitido la mejora de la resolución entre picos
contiguos, ya que, a menor tamaño, menor altura de los platos
teóricos y mayor resolución entre picos contiguos.
Es muy importante la configuración de las columnas.
Los avances tecnológicos han permitido contrastar dos tipos de columnas:
• Columnas que contienen partículas
totalmente porosas: la FE ocupa la
totalidad de las partículas.
• Columnas que contienen partículas
nucleares: tenemos un núcleo inerte
y compacto que está recubierto por la
fase estacionaria conformando una
corona esférica.
La diferencia entre ambas es su diferente comportamiento, que se ve reflejada por
la ecuación de van Deemter, que optimiza la altura equivalente de placa teórica: a menor
altura de los platos teóricos, mayor número platos teóricos en una misma columna.

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 Con una columna esférica tendríamos los
tres componentes de la ecuación (difusión
longitudinal, difusión de remolino y la difusión
por componente de masa). Al aplicar una partícula
nucleada disminuye la difusión en remolino
(componente Y), disminuye la difusión
longitudinal (violeta) y también disminuye
drásticamente la difusión por componente de masa
(componente azul) de la ecuación. Por lo que las
partículas nucleares recubiertas con la FE mejoran
la resolución, obteniendo mejores cromatogramas,
y también disminuye la intrapresión.
La F.E. puede ser apolar o polares, aunque
predomina las polares entre ellas las C18.
Para separar metabolitos polares tenemos la
fase estacionaria tipo HILIC. En este caso, el
gradiente de componente b (acetonitrilo) sería
descendente. En fase estacionaria apolar el
gradiente sería creciente.
Hay más fases estacionarias:

Es importante el control de la presión. Este aumento de presión se puede compensar

utilizando partículas nucleadas en lugar de partículas porosas. Esto nos permitirá poder
realizar una HLCP (600 bares).
La resolución a su vez depende de tres factores:

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 •El número de placas teóricas (en verde), se puede aumentar primero
disminuyendo el tamaño de la partícula y segundo aumentando la longitud de la
columna para mejorar la separación de los analitos. Estos dos factores conllevan un
aumento de la contrapresión, para disminuir sería conveniente aumentar la temperatura
para disminuir la viscosidad.
• K (azul): es un parámetro asociado al flujo y
pendiente del gradiente. En general si la pendiente del
gradiente baja se separarán más los picos, pero también
se ensanchan. Si aumenta la velocidad de flujo también se separan más, pero se
ensancharán. En resumen, si aumenta K se separan los picos, pero se ven más anchos.
Es útil entre 5 y 10. Aumenta hasta un límite, a partir del cual no aumenta más
(saturación). Por ejemplo, el acetonitrilo es mejor que el metanol porque nos permite
aumentar la temperatura y es capaz de solubilizar vitaminas. Podemos decir que dos
picos están bien separados si la R= 1,5. Si es menor de ese valor, hay un acoplamiento
en los picos.
• Factor de selectividad (rojo). Mejora el proceso considerablemente, consiste en
elegir la fase móvil apropiada, según el metabolito que estemos estudiando. Podemos
utilizar agua como componente A y acetonitrilo como componente B, aunque
normalmente ofrece mejores resultados el acetonitrilo/etanol, porque no absorben en
el ultravioleta. Además, en caso de subir la temperatura el etanol se evapora a los 25ºC,
pero el acetonitrilo no requiere más temperatura por lo que es el que mejores resultados
da. Para trabajar con metabolitos apolares (para separar vitaminas liposolubles, A, E,
K…) utilizaremos como componente A acetonitrilo y como componente B el
tetrahidrofolato.
Los parámetros de control se calculan experimentalmente.
El parámetro experimental resolución se puede calcular como la
diferencia entre los tiempos de resolución dividido entre la suma
de las anchuras/2.
Se considera que dos picos están bien resueltos, totalmente separados, cuando la
resolución es igual a 1,5. Cuando su valor es inferior a 1,5; ya existe una superposición.

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 3.1.- Detectores de cromatografía LC-MSD
El detector más universal es el detector de espectroscopía de masas, pero tiene un
coste enorme, por lo que no se puede utilizar en los grupos de investigación; sólo en
grandes equipos de investigación centrales. Nosotros en el laboratorio optimizamos la
separación mediante el empleo de una FE y una FM, y utilizando un detector de los
disponibles a nivel de investigación como el detector de absorbancia y fluorescencia; una
vez que hemos optimizado la separación lo llevamos a los centros de investigación
centrales. Ellos nos dan los cromatogramas y nosotros lo analizamos mediante un
software.
Método de ionización en el caso detección con espectroscopía de masa

RECORDEMOS
Un espectrofotómetro de masas está compuesto por un ionizador, un analizador
y detector, pero son el analizador y el ionizador los principales componentes que nos
permiten distinguir entre un espectrofotómetro de masa u otros.

En cromatografía de gases la ionización tiene lugar por impacto electrónico;

mientras que en cromatografía líquida tiene lugar por electronebulización (electrospray)
o bien ionización MALDI.
1.- La electronebulización (ESI): en estos
métodos se emplea el electrospray que convierte la
columna líquida en minúsculas gotas y después se
aplica un campo eléctrico extenso que ioniza los
metabolitos, dando lugar a iones que se percibe el
detector de masa. Cuando la muestra incide sobre
una estructura genera un corriente eléctrica que es
proporcional a la concentración del ion.
2.- La ionización MALDI: se opera mezclando una disolución de la muestra con
una sustancia matriz que se encuentra en mucha mayor proporción que la muestra
(10000:1). La mezcla se deposita en un dispositivo
portamuestras y, tras la evaporación del disolvente,
los cristales de la mezcla muestra-matriz, se irradian
con un haz láser de elevada potencia (106 Wcm–2) y
de pulsos cortos durante algunos nanosegundos. Estos
liberan e ionizan las moléculas de la muestra y la
matriz, manteniéndolas en fase gaseosa.
La clave del éxito del MALDI, se debe a que la
matriz es capaz de absorber gran cantidad de energía
a la longitud de onda del láser y posteriormente sufre una relajación, cediendo la energía
emitida a las moléculas de la muestra de una forma controlada, de manera que permite
la desorción de las moléculas quedando como iones intactos en fase gaseosa. Se utilizan

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diferentes tipos de matrices dependiendo de las aplicaciones y de la naturaleza del
analito: matrices orgánicas sólidas y líquidas, líquidos iónicos y materiales inorgánicos.
Esta técnica nos permite llegar hasta la cuarta cifra decimal.
En ambos casos se utiliza un detector
de tiempo de vuelo (TOF). Una vez
generados los fragmentos, estos llegan a un
cilindro vertical y son impulsados hacia arriba
hacia un reflector, que los empuja y chocan
contra una superficie. La distancia en la que se
separan los metabolitos nos va a permitir
detectar hasta 4 cifras decimales de precisión
en la masa del elemento. Así podemos determinar la masa exacta de un analito.
Existen otras variaciones con sistemas de nanofluidos que se diferencia en el tipo
de gestión de la columna, pero los más relevantes son la del tipo triple cuadrupolo
(QqQ).
Partimos de la técnica de ionización por electrospray. Los fragmentos iónicos se
separan en un primer analizador tipo cuadrupolo, pero hay una división reducida. Por
ejemplo, si tenemos un ion positivo y 4 cilindros negativos, el ion va a pasar por el centro.
Podemos seleccionar un metabolito (normalmente el más importante) y en el cuadrupolo
central combinado con una corriente de gas de N2 o Ar. Lo que va a suceder es una
colisión entre estos gases impulsores y el fragmento que hemos seleccionado, provocando
una fragmentación adicional (masa-masa). A continuación, pasan por un segundo
cuadrupolo y finalmente llega al detector. La Q hace referencia a que el cuadrupolo inicial
y el final son analizadores, y el central (q) es ionizador.

Tanto Q1 como Q3 están controlados por potenciales de corriente continua (dc) y

radiofrecuencia (rf) y su función es la fragmentación y detección de masa. Por otro lado,
la celda de colisión, q, sólo está sujeta al potencial de RF. Esto permite que todos los
iones que fueron seleccionados pasen a través de ella.
QqQ es un analizador útil para metabolitos que se parecen mucho entre sí (como es
el caso de los eicosanoides: prostaglandinas, leucotrienos...).

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 Con otro tipo de ionizador podemos hacer
ionizaciones sucesivas, y a cada una de ellas hacerle un
espectro de masas. Por ejemplo, primero hacemos el
espectro de la partícula verde, después sufre una segunda
ionización; y tenemos el espectro de masas rojo. Al
fragmento de mayor tamaño lo sometemos a una tercera
ionización en masas y después al componente más grande
le hacemos otra ionización, manera que se va obtener mucha información detalla de la
composición de dicho metabolito.
La cromatografía de gases combinada a la espectroscopía de masa es muy buena
porque nos permite identificar una gran cantidad de componentes con facilidad. Esto es
más difícil con cromatografía líquida pues se generan menos fragmentos.
En la práctica, muchas veces se suelen combinar sistemas de detección:

• ESI-TOF
• MALDI-TOF
• ESI-Nano
• ESI-SQ, ESI-QqQ MS2: permite un acoplamiento masas-masas.
• ESI-IT, MSn

3.2.- LC-MSD: Bases de Datos

La identificación automática no es buena, por lo que hay que hacer uso de la
manual. Aunque es un proceso más lento se obtienen mejores resultados. En el caso de la
cromatografía líquida se usa otro programa distinto. En este caso la identificación es
moderadamente buena refinando con la manual. La identificación cualitativa automática
tampoco es fiable; de ahí a que se tenga que obtener de forma manual.
La diferencia reside en que en el caso de la cromatografía de gases marcamos en la
ventana del TIC en el pico. En el caso de la cromatografía líquida (LC) tenemos una
ionización débil, suave de electronebulización o electrospray. Obtenemos muy pocos
fragmentos que aportan muy poca información estructural. Entre ellos el que más destaca
es el ion molecular, es decir, todo el metabolito menos un electrón y, por tanto, tendrá
carga neta positiva. La masa de ese ion molecular = a la masa del metabolito completo.
(La masa de un ion es despreciable con respecto a la del metabolito).
En la CL la estrategia no consiste en marcar en un pico y que nos presente el
espectro, sino a la inversa. Introducimos la masa exacta del metabolito que buscamos y
le decimos al programa de análisis de datos que nos busque en el conjunto del
cromatograma si este metabolito se encuentra o no.
Sistemática de trabajo a seguir para NGP:
1. Se prepara un extracto.
2. Se microfiltra, en microfrascos de tapón en rosca (son metabolitos no volátiles).

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 3. Se realiza una prueba en cromatografía para optimizar la separación de los
metabolitos con el detector de absorbancia/ fluorescencia.
4. Se lleva la muestra al servicio central, y allí nos ofrecen una detección
complementaria más potente. Combina: dos analizadores, un cuadrupolo
simple, y otro Q-tof; que aumenta la sensibilidad. También tenemos qTrap
(trampa iónica).

La ventaja de estos métodos es su alta sensibilidad. Inconvenientes altos costes.

Estas técnicas sirven para todos los metabolitos. Los más difíciles de identificar son
los glicósidos derivados de la N-Glicosilación y de la O-glicosilación de las proteínas.
Cuando no son válidos los resultados en espectrometría de masas, se utiliza RMN; y una
previa purificación de las muestras (se hace un computarizado para que se obtenga mayor
señal).
Otras alternativas serían ir haciendo hidrólisis con proteasas, glicosilasas; y a partir
de ahí, ir obteniendo fracción peptídica, glucídica. En este punto, ya se aplicaría
espectroscopía de masas o combinada con cuadrupolo simple o de trampa iónica. Y
después se combina la información para determinar los glicopéptidos característicos de
los epítopos de determinados antígenos o en cualquier interacción proteína-ligando.
La cuantificación: como siempre se realiza una recta de calibrado.
Determinamos la concentración y repetimos el proceso tres veces, y con ello, hacemos la
media, desviación estándar, etc. Finalmente, se realizan las pruebas estadísticas
convenientes.

3.3.- Selección de métodos

• Para metabolitos volátiles y predominantemente apolares se puede determinar por
cromatografía de gases con detección de espectroscopía de masas.
• Para determinar metabolitos no volátiles y muy polares, hay que usar
obligatoriamente cromatografía líquido-masas.

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 • A los metabolitos intermedios con polaridad y volatilidad intermedia se les puede
aplicar cualquiera de las dos técnicas para su estudio, o también contamos con
la posibilidad de obtener derivados volátiles.

En los casos que tengamos la masa exacta idéntica hay que volverlos volátiles de
forma obligatoria (Por ejemplo:C6H12O6). Por gases-masas hacemos fragmentación
múltiple. Con estas técnicas se pueden realizar estudios de deconvolución para separar
picos mixtos en simples.
Provocando la ionización, puede ser en modo positivo o negativo. En positivo se
hace uso de FM en ácido fórmico y en negativo se usa acetato amónico o formiato
amónico.

4.- Metabolómica dirigida o no dirigida

La selección/combinación de métodos va a depender de si estamos trabajando en
metabolómica dirigida o no dirigida.
Denominamos metabolómica dirigida a la investigación específica de un
metabolito que ya conocemos de antemano. Queremos determinar unos metabolitos
marcadores de cada órgano o bien de fármacos. Por ejemplo, el objeto de nuestro estudio
son 10 marcadores de cualquier metabolito.
La metabolómica no dirigida, va dirigida a la búsqueda de todos los metabolitos
posibles de nuestra muestra biológica, ya que no sabemos a priori cuáles son los
metabolitos que caracterizan nuestra muestra. No sabemos si hay diferencia significativa
o no entre los distintos órganos (nos lo inventamos). Analizamos todos y después se
estudia con métodos estadísticos qué metabolitos son los más importantes.
Se aplica todo el proceso (preparativo, estructural y funcional):

Cuando hacemos un estudio no dirigido necesitamos realizar primero estudios de

cribado en los que cribamos toda la muestra y vemos qué hay.

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 Los estudios de confirmación son para la metabolómica dirigida: quiero confirmar
si están ese metabolito y sus derivados. Además de identificación cualitativa global
destinado al conjunto o específica del metabolito objetivo, ambos llevan a métodos de
cuantificación.
Aunque los fabricantes
indiquen que sus productos
sirven para todo, esto no es así.
Realmente el analizador triple
cuadrupolo se utiliza más con
fines cuantitativos, ya que nos
permite detectar
concentraciones muy bajas de
muestras (es muy sensible).
Mientras que el analizador de
tiempo de vuelo se emplea más
con fines cualitativos. Hay una
tendencia actual de combinar analizadores. Normalmente la combinación es la de un
analizador muy sensible con detector que permita identificar de forma cualitativa los
analitos (QqQ-TOF: QqQ-trap).

5.- Estructura/función: QSAR

Estos equipos nos permiten obtener información respecto a la muestra biológica de
partida, pero la mayor función es establecer relaciones estructura-función, es decir,
combinar los resultados estructurales con los funcionales. Las industrias farmacéuticas lo
que hacen es cuantificar estas relaciones existentes entre la estructura y la función
mediante unos parámetros llamados descriptores moleculares. Hay 3 tipos:

➣ Electrónicos: HOMO (energía necesaria para retirar un electrón y dar lugar a

un catión, también es el orbital molecular completo de mayor energía) y LUMO (orbital
molecular vacío de menor energía, energía necesaria para que un metabolito capte un
electrón y se convierta en un anión), estas relaciones son críticas para la unión de un
ligando a una proteína.

➣ Estéricos: la masa molecular del propio metabolito (más exacta con 4

decimales), podemos tener compuestos que tengan como cadena lateral un metilo, poco
voluminoso, o un isobutilo muy voluminoso; siendo estos los principales sitios de
reconocimiento por otras proteínas/enzimas.

➣ Hidrofóbicos: Se usa Log P(diapositiva). La P se refiere al cociente de reparto

entre el etanol y el agua. Colocamos un embudo de decantación en etanol y agua,
añadimos el metabolito, mezclamos y dejamos que se produzca el reparto entre las
diferentes fases, se determina la concentración del analito en cada fase y calculamos P.
De manera que el Log P es una medida de hidrofobicidad y nos aporta información
respecto a posibles destinos del metabolito.

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 Por ejemplo, los metabolitos hidrofílicos se distribuyen más por la fase etanol
orgánica. Así podrán atravesar la barrera hematoencefálica y ser útiles para el tratamiento
de enfermedades neurodegenerativas. Si fuera altamente hidrofílica, como es el caso de
la dopamina no se podría suministrar como fármaco para tratar el Parkinson porque no
podría atravesar la barrera hematoencefálica. Habría que utilizar un análogo estructural
más hidrofóbico que cuando atraviese la barrera fuera metabolizado a dopamina.
Posteriormente, se realizan análisis estadísticos de las muestras
biológicas de los alimentos. Se busca actividad lineal entre ellas, se
hacen estudios bidimensionales y tridimensionales para un mejor
estudio (QSAR).

5.1.- Diseño de nuevos fármacos

El diseño de nuevos fármacos se basa en experiencias previas, en las cuales se han
obtenido resultados favorables sobre su actuación ante una proteína o enzima que actúa
como diana farmacológica, para mejorar el tratamiento de una enfermedad (Hit
identification).
A partir de estos estudios, se intenta identificar el fármaco cabeza de serie, que
contiene grupos químicos necesarios para su bioactividad (Lead discovery).
El siguiente paso, consiste en identificar los grupos químicos imprescindibles, o
más eficaces para su bioactividad (Lead optimization).
Posteriormente, se seleccionan los mejores fármacos derivados, pretendiendo
conseguir mayor bioactividad, mayor biodisponibilidad o menores efectos secundarios
(Drug candidate).

5.2.- Optimización de fármacos: Descriptores estructurales

Dentro del proceso de optimización de fármacos (Lead optimization), se llevan a
cabo síntesis de derivados análogos al cabeza de serie, con crecientes grupos químicos
que incrementan alguno de sus descriptores electrónicos, estéricos o hidrofóbicos (2D-
QSAR), combinaciones de estas propiedades con su estructura tridimensional (3D-
QSAR), o bien combinaciones de ambos tipos de propiedades con su interacción frente a
proteínas o enzimas objetivo (acoplamiento molecular o docking, 4D-QSAR).

5.3.- Optimización de fármacos: Relaciones QSAR

El contraste entre los descriptores estructurales de los nuevos fármacos derivados y
sus respectivas bioactividades, in vitro e in vivo sobre mamíferos (ratón a simio),
proporciona relaciones cuantitativas estructura-actividad (2D/3D/4D-QSAR). Un
ejemplo es la relación 2D-QSAR entre varios derivados con creciente LogP y su mayor
bioactividad sedante (SZeA).

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 6.- LADMET
Para estudios de absorción, toxicología o metabolismo, partimos de los estudios
básicos que hacemos los científicos (biólogos, químicos, bioquímicos, biotecnólogos…);
trabajando con los analitos y metabolitos en tubos de ensayos y cultivos. Después,
vamos probando con organismos de bajo nivel (bacterias, hongos, pez cebra…). A
continuación, entra la investigación aplicada de veterinarios y farmacéuticos sobre
animales mamíferos, y en ellos, se llevan a cabo estudios de liberación, absorción,
distribución, metabolismo, excreción y toxicología.
Los analitos que dan mejores resultados en los estudios básicos son los aplicados
en la investigación aplicada sobre animales. Así de los 100 metabolitos iniciales, se criban
hasta tener 10 candidatos a mejores fármacos para poder hacer posteriormente ensayos
en humanos. Cuando las farmacéuticas nos presentan 10 candidatos a fármacos
prometedores sobre el ser humano, entran los médicos en los estudios de fase clínica en
la cual vamos a obtener un único fármaco.
Todo fármaco será tóxico, pero a partir de cierto nivel. Todo fármaco tendrá un
intervalo farmacéutico. Por debajo no será efectivo, pero por encima puede ser letal.
Metabolitos con bioactividad simple o múltiples: Algunos metabolitos pueden
ser útiles en el ámbito alimentario, otros en los cosméticos, en los farmacéuticos (simples)
y otros en varios de ellos (múltiples). Un ejemplo son los nutrientes esenciales, que suelen
ser utilizados con fines alimentarios y cosméticos.
En caso de que los resultados no sean satisfactorios, se sintetizarán nuevos fármacos
derivados, y se realizarán nuevos estudios de validación.

7.4.- Optimización de fármacos: Ensayos clínicos

Estudiando los resultados satisfactorios de las relaciones QSAR obtenidas, se
propone la síntesis piloto de nuevos fármacos, los cuales serán sometidos a ensayos
clínicos en humanos, sufragados por la multinacional farmacéutica fabricante. En caso de
que los ensayos clínicos sean favorables, los nuevos fármacos seleccionados se fabricarán
a nivel de planta de producción, en industrias farmacéuticas.

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