Two component systems

Marco Acuña; Silver Ceballos; José Pablo Cerdas; Kevin Quesada

Las bacterias como organismos vivos han logrado colonizar una amplia variedad de distintos
ambientes naturales, cada uno con condiciones únicas de vida tales como nutrientes, fuentes de
energía, temperatura y pH entre otros. Debido a que este complejo ecosistema en donde se
desarrollan establece qué obtendrán las bacterias para su crecimiento, estas debieron idear una
manera para adaptar su metabolismo para lograr su supervivencia. La manera en que estas han
logrado realizar tal adaptación es mediante la regulación de la expresión génica mediante la
detección y respuesta ante la concentración de todos los distintos estímulos presentes en el medio
intra o extra celular (Salis et al, 2009).

Al conocer que las bacterias son capaces de producir una amplia gama de productos útiles para los
procesos industriales, medicina, alimentos e incluso biorremediación, se plantea la importancia de
conocer de qué manera las bacterias llegan a controlar su metabolismo a partir de todas las
señales distintas que reciben de cada compuesto presente en su medio. Esto ha llevado a la
búsqueda de los mecanismos en que se logra obtener tal nivel de control en la expresión génica.
De esta manera se hace posible que las bacterias sean usadas como biofábricas al proporcionar
exactamente los compuestos necesarios para su correcto desarrollo (Spiro & Rixon, 2010).

Mediante la investigación sobre los mecanismos utilizados por las bacterias para regular su
crecimiento, se ha llegado a conocer las formas principales para el reconocimiento de señales
provenientes de su medio, entre las cuales destacan la regulación alostérica, los “riboswitches”,
los “two componen systems” (TCS), los sensores de luz y los mecanismos de Quorum sensing (QS)
(Salis et al, 2009).

A diferencia de la regulación alostérica o los riboswitches, un TCS se encuentra incrustado en la

membrana celular de una forma transmembranal, lo cual le permite detectar los estímulos que
provienen del medio ambiente extracelular. Tal como su nombre lo indica estos sistemas poseen
dos componentes esenciales, los cuales son una proteína con función quinasa dispuesta en forma
transmembranal que al activarse transfiere una señal al segundo componente un regulador de
respuesta citoplasmático, el cual una vez fosforliado se une a un sitio operador específico del ADN
para aumentar la tasa de transcripción de la secuencia o su represión; esto al variar su sitio de
unión al ADN, con lo cual se logra responder al estímulo eficientemente (Salis et al, 2009).

Esta clase de sistema de respuesta presenta una serie de ventajas a las bacterias, ya que son
capaces de responder a estímulos nutricionales, presencia de iones y metales, o inclusive fuentes
de estrés y temperatura en la activación o represión de distintos genes en respuesta a estos
estímulos, de esta forma, las bacterias que poseen TCS para determinado estímulo serán capaces
de adaptar su maquinaria metabólica para sobrellevar el efecto que este cauce (Beier & Gross,
2006). De esta forma inclusive la patogenicidad de una bacteria se ve aumentada al contar esta
con sistemas TCS para lograr una mejor respuesta al medio cambiante que habita frente a otras
bacterias y los ataques que realice el organismo al que invade.
De esta forma es posible utilizar diferentes metodologías de alteración o adición de estos TCS a
bacterias que carecen de ellos para obtener la respuesta esperada durante su cultivo in vitro o en
reactores y produzcan los compuestos buscados o realicen las funciones que es necesario que
realicen. Metodologías para crear TCS en bacterias involucran el uso de complejos híbridos, al
mezclar distintas partes de TCS distintos para así responder ante un mismo estímulo con una
distinta respuesta, o viceversa (Yoshida et al, 2007); además es posible utilizar métodos de
evolución dirigida al seleccionar entre mutaciones inducidas a las bacterias solamente aquellas
que presenten una mejor y más eficiente respuesta ante el estímulo suministrado (Collins et al,
2005).

Mecanismo
El dominio N-terminal del sensor kinasa está constituido por uno o más segmentos anclados en la
membrana plasmática. Es el responsable de percibir el estímulo ya que posee formas
conformacionales alternas que son estabilizadas o desestabilizadas por la presencia o ausencia del
estímulo (Salis et al., 2009). Una vez que el dominio del sensor kinasa inicia un cambio alostérico
en su conformación, un dominio conservado conocido como HAMP-linker (el cual está constituido
por dos hélices paralelas) altera la actividad kinasa del dominio histidina kinasa. Este se ubica al
lado C-terminal del último dominio periplásmico y permite una rotación de la proteína en un eje
perpendicular a la membrana (Wang, 2012).

En respuesta al estímulo, el dominio histidina quinasa fosforila el residuo conservado de histidina

utilizando la actividad del dominio ATPasa. Este dominio se une específicamente a su regulador de
respuesta respectivo. En caso de estar fosforilado el grupo fosfato es transferido a un residuo
conservado de aspartato en el regulador de respuesta; este paso puede ser reversible (Salis et al.,
2009).

Los reguladores de respuesta son factores de transcripción que se unen a operadores específicos
en el ADN, una vez que su residuo de aspartato ha sido fosforilado. La fosforilación de la proteína
causa la formación de homodímeros o tetrameros, los cuales incrementan el área superficial para
establecer interacciones con los operadores (Bayles & Fujimoto, 2002). Es posible que el regulador
de respuesta se una al ADN primero y luego establezca interacciones proteína-proteína como
forma de estabilización. Una vez unido al ADN, el regulador de respuesta puede regular la
transcripción, activándola o reprimiéndola. Esto último depende de que tan frecuente el regulador
de respuesta se une al operador, la posición del operador con respecto al RBS y la fuerza de las
atracciones o repulsiones entre el regulador de respuesta y la ARN polimerasa. En general, cuando
un operador está localizado entre -35 y +25 nucleótidos del sitio de inicio de transcripción la
transcripción es reprimida por la competencia del regulador de respuesta y la ARN polimerasa.
Caso contrario a cuando el operador se encuentra entre -65 y -30 nucleótidos. Traslapar
operadores puede causar que múltiples reguladores de respuesta compitan por unión al ADN,
creando puertas lógicas donde la transcripción puede ser activada o reprimida por la combinación
específica de diferentes estímulos (Salis et al., 2009).
Ejemplificación de un sistema bacteriano de dos componentes (respuesta a nitrógeno)

La primera reacción en la señalización de la cadena consiste en la auto-fosforilación de la histidina

conservada en el módulo de transmisión que está ligada directamente con estímulos del
ambiente. Seguidamente el grupo fosfato es transferido a un residuo de aspartato del grupo
conservado N-terminal del módulo del regulador de respuesta. Esto induce la activación del
dominio de salida como del sistema de respuesta (Kramer & Weiss, 1999).

La adaptación ante un ambiente cambiante requiere que una respuesta eficiente en ambas
direcciones, tanto para se encienda bajo demanda, si no también que se apague en distintas
condiciones (Kramer & Weiss, 1999).

Un ejemplo de una histidina quinasa bifuncional es el caso de NtrB para la regulación del
nitrógeno. En condiciones de nitrógeno limitado, el NtrB promueve la fosforilación del regulador
de respuesta NtrC. El NtrC fosforilado funciona como un activador transcripcional para el regulón
Ntr. Bajo condiciones de exceso de nitrógeno en el medio, el NtrB promueve la desfosforilación y
la inactivación del complejo NtrC-P. El señalamiento del estado del nitrógeno es dirigido hacia el
NtrB por medio de la proteína PII (producto de glnB) y la UTasa (producto de glnD), esta última
promoviendo un control negativo sobre el NtrB (Kramer & Weiss, 1999).

Las proteínas reguladores del nitrógeno (PII) controlan indirectamente la transcripción del gen
glutamina sintetasa (glnA). Esta enzima juega un papel importante en el metabolismo del
nitrógeno por medio de la catálisis de la condensación de glutamato y amonio para formar
glutamina (UniprotKB, 2013). Es de suma importancia para la célula este tipo de regulación ya que
la glutamina es una fuente importante de energía y está envuelta en la proliferación celular, como
también en la inhibición de la apoptosis y en la regulación del pH ya que remueve el amonio en
circulación (GeneCards, 2013).

Una de las aplicaciones que se han dado mediante el uso de este sistema de dos componentes el
para la creación de biosensores, los mismo se realizan mediante la extracción del componente
genético de sensores como las quinasas, sintetazas, reguladores de respuesta y promotores, y
combinarlas con otros elementos genéticos, tales como factores de transcripción, interruptores
epigenéticos, y reporteros fluorescentes, estas “redes genéticas” pueden exhibir comportamientos
dinámicos como biestabilidad, oscilación y patrones de formación. La meta de los biosensores es el
crear ingeniería microbiana en donde las bacterias sean “computadoras vivientes
autorrepliclables” que usen los vectores para interactuar con el ambiente; por ejemplo, el ligar
genes que son promovidos por TCS responsables del quorum sensing con proteínas marcadoras
como GFP (Ninfa et al., 2007).

Un uso que se le pude dar a los biosensores es la generación de un reloj genético, el reloj genético
consiste de dos módulos, un activador y un represor, el activador se encarga de dirigir la expresión
genética del gen de interés y de sí mismo, sin embargo también se encarga de la expresión del
represor de dicho gen, por lo que se da una serie de oscilaciones en la actividad bacteriana de
manera sinusoide (gráfica con forma de la función senx), esto permite relajar las bacterias. Se
utilizó de esta forma un glnK el para inactivar el represor lacZ, de esta forma se da la transcripción
de las proteínas NtrI y NtrII, las cuales son responsables percibir la presencia de nitrógeno en el
medio y de regular la síntesis de compuestos nitrogenados (respectivamente), debido a que se
liga el gen responsable del represor LacZ a los genes NTR, sea da una expresión del represor, lo
que al alcanzar concentraciones altas del represor, provoca la inhibición de la expresión de Ntrl y
NtrII y un apagado del “sistema” (Ninfa et al., 2007).

Quorum sensors:

El sistema quorum sensor detecta y responde a moléculas difusibles que son producidas por
poblaciones de organismos. La concentración de estas moléculas auto-inductoras cambia
drásticamente de acuerdo a múltiples factores incluyendo la tasa de producción de las mismas
moléculas auto-inductoras, el número de organismos que las producen y el volumen del espacio
cerrado (Kramer & Weiss, 1999). Comportamientos como el factor de virulencia y la formación de
biofilms se dan por la densidad alta o baja de la población y son regulados por los sistemas de
quorum-sensing.

El quorum sensing ha mostrado un papel de gran importancia en cuanto al aspecto patogénico y

en la simbiosis de las bacterias con el hospedero. En cuanto a la simbiosis los quorum sensing de
gran importancia son la bioluminiscencia y los nódulos en la raíz. Muchos patógenos clínicos usan
el quorum sensing como medio de sobrevivencia en base a procesos de virulencia. Esto se logra
gracias a que solo atacan al hospedero cuando la densidad de población alcanza valores mayores a
los que puede soportar el organismo atacado para su defensa (Galloway et al., 2011). Por ejemplo
tenemos a la bacteria Pseudomonas aeruginosa la cual realiza (por medio de quorum sensing) la
formación de bioflims para resistir agentes antimicrobianos.

EL quorum-sensing para gram positivas y gram negativas es distinto ya que interactúan diversas
señales y proteínas para el intercambio de información en poblaciones bacterianas. Las bacterias
gram negativas sintetizan N-acil homoserina lactona (AHLs) las cuales son proteínas muy
conservadas que funcionan como moléculas de comunicación difusibles (Kramer & Weiss, 1999).
El primer quorum sening basado en AHL fue reportado en Vibrio fischeri, una bacteria marina
bioluminiscente que produce luz a altas densidades de población. Este quorum sensing consta de
un auto-inductor que sería N-3-oxohexanoylhomoserina lactona (OHHL) y las proteínas LuxI y
LuxR. Las OHHL son producidas por la proteína LuxI para luego ser liberadas de la célula. La
proteína LuxR actúa como receptor de estos auto-inductores, sin embargo, la concentración tiene
que estar en los límites aceptados para lograr la unión del complejo LuxR-OHHL que sería el
responsable de la transcripción de los genes de bioluminiscencia (Galloway et al., 2011). Esto se ha
convertido en el paradigma de la señalización mediada con AHL, por lo que las proteínas de otros
tipos de quorum sensing posteriormente descubiertos han sido llamadas LuxI de tipo sintasa y
LuxR de tipo receptor.
En estudios realizados por Collins et al., (2005) sobre la evolución de del componente LuxR en
Vibrio Fischer revelan que los sistemas de quorum sensing pueden evolucionar rápidamente para
responder a nuevos o diversos AHLs, lo que sugiere que este sistema puede ser una gran ventaja
evolutiva para mantener gran plasticidad ante el ambiente.

En las bacterias gram positivas el auto-inductor es un péptido corto que es secretado por la célula
y se une con receptores membranales, los que realizan fosforilaciones como mecanismo de
transcripción genética. Otra característica presente en este tipo de quorum sensing es el casete de
unión de ATP (ABC) el cual se encarga de la secreción del péptido feromona. Tanto la activación
del precursor como la señal de secreción de péptido feromona están transcripcionalmente unidos
y parecen estar regulados por las señales que ejercen los péptidos en los receptores membranales
(Kleerebezem et al., 1997).

Este sistema de dos componentes bacteriano ha sido utilizado en un proceso de evolución dirigida,
el mismo es un procedimiento repetitivo que optimiza la selectividad de un blanco molecular para
una determinada función o comportamiento, el cual inicia con la escogencia de una enzima que
presente un mínimo de actividad deseada, mediante mutagénesis al azar o recombinación
genética se genera un pool de proteínas variantes. Con un procedimiento de selección bien
diseñado se pueden identificar las proteínas que presentaron una mejor actividad (Collins et al.,
2005).

El problema de este sistema de dos componentes radica en que la producción de oxohexanoyl-HSL

por célula es tan baja que para alcanzar la bioluminiscencia se requiere una concentración muy
alta. Mediante la utilización de error-prone PCR (errores propensos en el PCR) y luz ultravioleta se
propició la mutación bacteriana, obteniendo un número de 9 colonias luminiscentes de alrededor
de 20 000, estas 9 colonias fueron aisladas de las cuales se encontró un falso positivo,
posteriormente se aislaron y amplificaron los alelos pertenecientes al LuxR, para asegurar que la
mutación se diera en este punto, de las cuales se descartó 1 colonia más, dos de los alelos
restantes eran idénticos entre sí, obteniéndose un total de 6 alelos mutantes. Cabe destacar que
factores como la virulencia, la producción de antbióticos y la formación de biofilms también están
regulados por Acyl-HSL (Collins et al., 2005).

Otra aplicación de este sistema de dos componentes, es el determinar patrones de formación de

estos sistemas, esto conduce a la diferenciación de células mediante la regulación de la expresión
genética de acuerdo a la concentración de una molécula señal difusible, es decir, utilizar el sistema
como un biosensor. Para ello so coloca un disco con bacterias que expresen solamente el LuxI
(proteína catalizadora del AHSL). La cepa que recibe el AHSL posee LuxR, el AHSL se difunde
formando un gradiente de concentración en el medio de cultivo de difusión. Se da una formación
de un anillo (proteína indicadora de que el represor está inactivo: GPF) en donde las bacterias más
cercanas al disco de difusión no expresan la proteína pues al estar tan cerca de la fuente de AHSL,
se da tanta actividad de la proteína LuxR que si bien es cierto, promueve la expresión de los genes
de GFP, también promueve la síntesis del represor, por lo que la expresión se detiene. La cantidad
de represor presente en la parte media de la placa no causa problemas en la expresión del GPF,
pues en estas concentraciones se da una oscilación en la expresión genética como la ya
mencionada, a bajas concentraciones al no recibir una señal externa suficiente, no expresa
ninguno de los genes. Visualmente se da la formación de un anillo de GPF en la placa Petri (Basu et
al., 2005).

Proteínas híbridas

Una aplicación que se le puede dar a este tipo de sistemas de dos componentes bacterianos es
para la producción de proteínas híbridas, las quinasas sensores híbridos son una fusión entre dos
quinasas sensores de dos sistemas de dos componentes diferentes, busca detectar el estímulo del
primer sensor y ejercer la respuesta del segundo, por ejemplo el uso de la proteína Taz (Tar-EnvZ),
la cual consiste en el dominio del Tar capaz de responder ante la concentración de aspartato en el
medio y el dominio EnvZ-HAMP (Histidine kinase, Adenylyl cyclases, Methyl ‐accepting proteins,
and Phosphatases), la cual envía señales a genes relacionados con el balance osmótico (ompR,
ompP, ompF, entre otros), esta proteína se construyó aprovechando el sitio de comunicación Nde I
presente en ambas proteínas y en muchos otros receptores de membrana (región de unión, estas
son regiones conservadas), el mismo comunica el dominio transmembrana interno (TM2) y el
dominio citoplasmático. Guiándose por esta región de unión es que se sintetiza el híbrido Tar-
EnvZ, mediante la inserción de la secuencia quimérica en un plásmido para la transformación
bacteriana, lo que se busca en la proteína híbrida es el reemplazo del estímulo de osmolaridad por
uno más sencillo de controlar externamente (Yoshida et al., 2007).

La búsqueda de diferentes estímulos que provoquen la expresión del sistema de dos componentes
bacterianos, provee una gran cantidad de posibilidades para la realización de proteínas híbridas
que respoondan a estímulos fácil de controlar, por ejemplo la fototaxia. Este tipo de regulación
implica regulación de la transcripción genética por medio de la longitud de onda de la luz
presente. Los fitocromos son una familia de proteínas que activan o inactivan estados de
señalización en respuesta a luz desde rojo a rojo lejano. Esto se ha utilizado como controlador
sintético de células vivas por medio de la creación de sistemas de proteínas híbridas para construir
un promotor que pueda ser regulado en diversas cepas (Tabor et al., 2010).

Un ejemplo claro es el sistema de dos componentes presente en cianobacterias que está ligado a
la expresión de los genes relacionados con ficobilosomas, los cuales son proteínas membranales
que se encargar de captar la luz que proviene del medio, en este caso en respueta a luz verde. Las
proteínas que intervienen en este caso serían CcaS quinasa y el regulador o aceptor de señales
CcaR. Estas señales responden en un rango de 535nm (verde) a 672nm (rojo), donde la absorción
de luz roja genera revierte el proceso y evita la transcripción genética (Tabor et al., 2010).

Se ha logrado la fusión del receptor de membrana Cph1 del sistema de dos componentes de la
cepa de cianobacteria PC6803 (sensible a luz roja), con sistemas de dos componentes de E. coli
para la expresión de diversos genes de interés. Al ingresar los datos a las bases de datos para
determinar la región de unión para realizar la quimerización, es necesario ingresar solamente la
región HAMP de ambas proteínas, para evitar que regiones conservadas causen confusión a la
hora de alinear las secuencias, también es importante el verificar que ambas quinasas sensores
usen el mismo mecanismo para transmisión de señales (Tabor et al., 2010).

Las bacterias fotosintéticas, a diferencia de las plantas, poseen proteínas que responden a
prácticamente todo el espectro visible, por lo que Tabor et al (2010) aprovecharon esto para la
creación de una bacteria en la que se pueda tener un control de expresión multicromático. Para
esto combinaron los dominios membranales de la proteína Cph1 (la cual es sensible a luz roja –
650 nm) con el dominio citoplasmático del EnvZ, así como los dominios membranales de CcaS del
género Synechosystis (responde a luz verde -532 nm- y se inactiva ante luz roja) y, nuevamente, el
dominio citoplasmático del EnvZ, para esto se insertaron las secuencias quiméricas dentro de un
plásmido con indicador lacZ (β-galactosidasa) junto a S-gal y citrato férrico de amonio (para formar
un pigmento negro cuando se expresa cualquiera de las proteínas). La creación de estos sistemas
de dos componentes multicromáticos permite el control en tiempo real de la expresión genética
de la bacteria (Tabor et al., 2010).

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