Unidad 2.
Cultivos celulares
Profesor: Rubén Moreno Díaz
Unidad 2. Cultivos celulares
Introducción
El cultivo celular se define como el conjunto de procedimientos que hacen posible el mantenimiento de células de
organismos pluricelulares in vitro, preservando al máximo sus características fisiológica, bioquímicas y genéticas.
Laboratorio de
cultivo celulares
• Medios de cultivos
Propagación/Crecimiento
artificiales
(organismos pluricelulares)
• Condiciones controladas
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1. Cultivos celulares
1.1 Tipos de cultivos celulares
A. CULTIVO DE ÓRGANOS
Consiste en mantener un órgano entero o parte de él en la interfase
entre un medio de cultivo artificial y una atmósfera controlada.
Se mantienen durante un tiempo limitado.
Las células no proliferan, tan solo se produce el crecimiento de
algunos tipos celulares indiferenciados presentes fundamentalmente
en la zona periférica que no conserva la estructura tisular propia del
órgano.
Se utilizan para el estudio de relaciones intercelulares y respuestas a
estímulos y sustancias.
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1. Cultivos celulares
1.1 Tipos de cultivos celulares
B. CULTIVO DE EXPLANTES
Un explante es una pequeña porción de tejido u órgano que se
adhiere a una superficie y generalmente crecen las células de la
periferia.
El fragmento de tejido se adhiere a un frasco de cultivo o placa Petri y
se nutre con medio de cultivo. Las células de la periferia se
multiplican y proliferan, ocupando toda la superficie del soporte.
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1. Cultivos celulares
1.1 Tipos de cultivos celulares
C. CULTIVO DE CÉLULAS
El cultivo de células se realiza a partir de suspensiones celulares, que se introducen en un
recipiente adecuado junto con un medio de cultivo y se incuban en las condiciones óptimas
donde las células proliferan. La suspensión celular para el cultivo se obtiene disgregando la
células de un tejido por métodos mecánicos o enzimáticos.
Es el tipo de cultivo más habitual y se realiza a partir de muestras de cualquier tipo de tejido.
Según la procedencia de la suspensión celular de partida, los cultivos de células pueden ser:
• Cultivo primario: se puede realizar a partir de la mezcla celular compleja formada por
distintos tipos celulares presentes en el tejido, o seleccionando un tipo celular concreto
• Cultivo secundario: se obtiene a partir de un subcultivo de otro cultivo previo in vitro.
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1. Cultivos celulares
1.2 Aplicaciones de cultivos celulares
1. En investigación básica:
• Aspectos relacionados con el metabolismo celular
• Interacciones celulares: entre células, con la matriz extracelular y con el medio
2. En investigación aplicada: son una potente herramienta biotecnológica. Aplicaciones más destacadas:
• Inmunología: producción de anticuerpos monoclonales
• Farmacología: producción de fármacos y vacunas
• Toxicología: estudios de citotoxicidad, carcinogénesis y mutagénesis
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1. Cultivos celulares
1.2 Aplicaciones de cultivos celulares
EN LA ACTUALIDAD…
• La terapia celular consiste en la introducción de células madre,
ocasionalemente modificadas, para la reparación de tejidos dañados o
la restitución de procesos biológicos que han resultado dañados por la
enfermedad.
• La medicina regenerativa o ingeniería de tejidos es la rama de la
bioingeniería que se sirve de la combinación de células, métodos de
ingeniería de materiales, bioquímica y fisicoquímica para reparar o
reemplazar parcial o totalmente tejidos.
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1. Cultivos celulares
1.3 Biología de las células en cultivo
Una vez que a las células en suspensión se les añade un medio de
cultivo, se introducen en un recipiente adecuado (frasco de cultivo) y
se incuban en condiciones óptimas de temperatura y humedad, las
células empiezan a crecer.
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1.3.1 La curva de crecimiento del cultivo
La dinámica de crecimiento de un cultivo, es decir, la concentración
de células por los días de evolución del cultivo, se representa
1. Fase de latencia o adaptación. Es un tramo recto sin pendiente o
gráficamente mediante una curva de crecimiento.
con cierta concavidad. Corresponde a las primeras 24 horas de
evolución del cultivo, en la que no se produce crecimiento y, por lo
tanto, el número de células se mantiene constante o incluso puede
disminuir ligeramente.
2. Fase de crecimiento exponencial. En la curva es el tramo recto y
de pendiente elevada. Dura aproximadamente 6-7 días y
corresponde a la fase en la que el número de células aumenta de
manera exponencial hasta alcanzar un máximo.
3. Fase estacionaria. Es un tramo recto de pendiente nula. Sucede a
partir de los 6-7 días de evolución del cultivo y es la fase en la que
el número de células permanece constante.
4 Muerte
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1.3.2 Formas de crecimiento
Consiste en que las células crecen adheridas sobre una
A. CRECIMIENTO EN MONOCAPA superficie sólida (plástica o vidrio).
Este tipo de células se dice que son dependientes de anclaje,
Se pueden distinguir diferentes momentos es decir, necesitan adherirse a una superficie sólida para
o etapas del desarrollo: poder crecer. Es el método utilizado para el cultivo de la
mayoría de las células.
1. Adhesión a una superficie
2. Proliferación y formación de colonias
3. Inhibición por contacto: las células detienen su crecimiento, aunque se mantienen vivas. Se inicia
la fase estacionaria de la curva de crecimiento. En esta célula la morfología y la fisiología de las
células se parecen más a las de las células de origen.
Para que las células reanuden su crecimiento se necesita hacer un subcultivo o “pase” de parte de las
células a un nuevo frasco de cultivo. El momento idóneo para realizarlo es el final de la fase
exponencial.
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1.3.2 Formas de crecimiento
En el crecimiento en suspensión las células no necesitan pegarse a
una superficie para crecer, por lo que se mantienen dispersas en el
B. CRECIMIENTO EN SUSPENSIÓN seno del medio de cultivo o proliferando. Este tipo de crecimiento
es típico de células sanguíneas circulantes, células
hematopoyéticas, células madre, algunas líneas tumorales y
algunas líneas celulares transformadas.
1. Adaptación al medio de cultivo
2. Proliferación en suspensión
3. Inhibición por densidad. Ocurre cuando el cultivo llega a un número
crítico de células en relación con el volumen de medio y los nutrientes
disponibles. No se dividen, pero siguen vivas.
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1.3.3 Comportamiento vital tras sucesivos pases
Las líneas celulares obtenidas a partir de un tejido u órgano mediante un
cultivo primario se denominan líneas celulares primarias.
La población celular aumenta en cada pase y, normalmente,
a partir del tercer pase se estabiliza. Esto significa que las
células se hacen uniformes y homogéneas, manteniéndose
La línea celular primaria es aquella obtenida a partir de
las características morfológicas y fisiológicas estables
un tejido u órgano mediante un cultivo primario que se
durante sucesivas generaciones.
mantiene en cultivo mediante pases seriados durante un
tiempo limitado.
Cuando el cultivo primario se realiza a partir de una mezcla
celular compleja, el tipo celular con mayor tasa de
crecimiento acaba desplazando a los demás, es decir,
impidiendo el crecimiento de las células con tasas de
crecimiento menores.
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1.3.3 Comportamiento vital tras sucesivos pases
SENESCENCIA
Las líneas celulares primarias tienen una vida finita, es decir,
se mantiene en crecimiento durante un número determinado
de generaciones o pases, característico de cada tipo celular
(suele oscilar entre 20 y 100) y después entran en la
denominada fase de senescencia.
Esto es debido a que con las sucesivas divisiones los
telómeros se acortan y las células van acumulando
anomalías genéticas y perdiendo funciones.
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1.3.3 Comportamiento vital tras sucesivos pases CARACTERÍSTICAS:
• Crecen indefinidamente en cultivo
• Pierden la dependencia del anclaje para crecer,
LÍNEAS CELULARES CONTINUAS
por lo que pueden crecer en suspensión
• Pierden la inhibición por contacto
Las líneas celulares continuas están formadas por células • Pueden invadir tejidos y producir tumores
inmortales que aparecen espontáneamente en algunos cultivos • Acumulan anomalías genéticas
y se mantienen en cultivo por tiempo ilimitado mediante pases
seriados.
— Métodos físicos: irradiación del cultivo
SE PUEDEN INDUCIR POR: — Métodos químicos: tratamiento con productos químicos carcinogénicos
— Métodos biológicos: infección vírica, transfección de ADN
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2. Factores que intervienen en el cultivo
2.1 Soporte físico
El cultivo de células implica:
1. Extraerlas de su entorno fisiológico
2. Introducirlas en el interior de un recipiente adecuado
3. Incubarlas
A. MATERIALES PARA CULTIVO
El material debe:
• Permitir la adhesión de las células
• Ser fácilmente esterilizable
• Tener una mínima calidad óptica para poder visualizar el cultivo
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A. MATERIALES PARA CULTIVO
MATRICES TRIDIMENSIONALES: estructuras
VIDRIO: reutilizable, fácil de porosas de colágeno o celulosa. Los tipos
limpiar y esterilizar en el celulares crecen organizándose de la manera
autoclave. más similar a como lo hacen en su tejido de
procedencia.
MICROSFERAS DE SEPHADEX O
POLIACRILAMIDA: las células
crecen adheridas a microesferas.
PLÁSTICO DESECHABLE: es el más
utilizado. Disminuye el riesgo de
contaminación
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B. CARACTERÍSTICAS Y TIPOS DE RECIPIENTES DE CULTIVO
El parámetro más importante que los caracteriza es la
superficie útil de cultivo, porque con base a ese valor se
calcula la cantidad de células que se siembran y se prevé el
PLACAS MULTIPOCILLO: son
número aproximado final de células cuando se alcanza la
útiles para realizar experimentos
confluencia.
puntuales simultáneos
BOTELLAS PARA INCUBADORES
FRASCOS O BOTELLAS ROUX: frascos DE TIPO ROLLER: botellas
PLACAS DE PETRI: placas clásicas planos con tapón de rosca. Sirven cilíndricas que se incuban sobre
de cultivo, circulares y con tapa. tanto para cultivo monocapa como en rodillos. El cultivo crece sobre las
suspensión. paredes interiores.
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2. Factores que intervienen en el cultivo
2.2 Composición y propiedades del medio de cultivo
Un medio de cultivo es una solución o un gel que
contiene los nutrientes necesarios para permitir en
condiciones favorables de pH y temperatura, el
crecimiento de las células.
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2. Factores que intervienen en el cultivo
2.2 Composición y propiedades del medio de cultivo
COMPOSICIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO
1. Medios naturales: fluidos naturales, pero al carecer de la información exacta de su composición son
difícilmente reproducibles.
2. Medios artificiales o sintéticos:
• Medios complementados con suero: suero fetal bovino. Aporta hormonas y factores de
crecimiento
• Medios libres de suero: con factores de crecimiento y proteínas
• Medios químicamente definidos: con ingredientes orgánicos e inorgánicos ultrapuros libres de
contaminación
• Medios libres de proteínas: promueven un crecimiento celular y expresión proteica superior
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COMPOSICIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO Cada componente tiene una función
1. Sales minerales: cloruro sódico, cloruro potásico, cloruro cálcico, cloruro magnésico, fosfato sódico y
bicarbonato sódico (importante para la regulación de pH del medio).
2. Tampón: tampón bicarbonato o tampón HEPES, tiene un gran poder tamponador en el rango de pH
óptimo.
3. Glucosa: fuente de energía.
4. Aminoácidos: todos los aminoácidos esenciales (aquellos que la célula no puede sintetizar)
5. Vitaminas: depende de la concentración de suero
6. Suplementos orgánicos de bajo peso molecular: ácidos grasos esenciales y otros lípidos,
nucleósidos, piruvatos, etc.
7. Indicador de pH: el más usado es el rojo fenol.
8. Hormonas y factores de crecimiento: esenciales para el crecimiento de las células.
9. Antibióticos y antifúngicos: para evitar la contaminación
2. Factores que intervienen en el cultivo
2.3 Características fisicoquímicas del medio de cultivo
• pH: óptimo de 7.4 (rango 7.2-7.6)
• Osmolaridad: los medios de cultivo deben ser isotónicos o ligeramente hipotónicos
• Viscosidad: dependerá de la concentración de suero
• Tensión superficial: para evitar burbujas por dióxido de carbono que se añade, se añaden agentes
antiespumantes.
BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA. Cultivos celulares
2. Factores que intervienen en el cultivo
2.4 Atmósfera gaseosa
La atmósfera gaseosa es la mezcla de gases en que se mantienen
los cultivos. Los dos componentes más importantes son el O2 y el
CO2
• El CO2 tiene un papel muy importante en los cultivos celulares
puesto que la fracción disuelta en el medio está en equilibrio con el
ion bicarbonato.
• Los incubadores llevan acopladas botellas de CO2 y un dispositivo
que permite controlar la concentración de este componente en la
atmosfera de incubación.
• La concentración más habitual es del 5%, con un rango entre 2% y
8%.
BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA. Cultivos celulares
2. Factores que intervienen en el cultivo
2.5 Condiciones de incubación
• TEMPERATURA: influye en la tasa de crecimiento celular. La temperatura óptica
suele ser la misma que la fisiológica para ese tipo celular. Mamíferos: 37ºC; insectos:
28ºC
• HUMEDAD: debe ser suficiente para evitar la evaporación del medio de cultivo
debido a la temperatura. La humedad relativa óptima es del 95%.
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3. Procedimientos de cultivo celular
Es el primer paso para obtener en suspensión el tipo celular.
3.1 Disgregación celular
Para ello hay que separar las células de sus uniones entre sí y
de la matriz celular.
1. Métodos mecánicos: cortar, picar o triturar con suavidad los fragmentos de órganos o
tejidos. Un método para órganos blandos es el cribado de células o tamizado: aquí se
colocan los trozos de órganos sobre una malla de nailon o metálica y aplastar. Esta malla se
acopla a un recipiente y se realizan lavados seriados.
2. Métodos enzimáticos: este método se basa en aplicar enzimas proteolíticas sobre la matriz
celular para que las células se liberen. Las proteasas más utilizadas son: colagenasa, tripsina,
papaína, elastasa y proteinasa K.
BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA. Cultivos celulares
3. Procedimientos de cultivo celular
3.2 Separación celular
1. Por sus propiedades específicas: se hace pasar a las células por columnas o filtros con
diferentes sustratos a los que se adhieren. Para liberarlas se lavan con tampón.
2. Por métodos inmunológicos: son métodos basados en la técnica ELISA mediante el empleo
de anticuerpos específicos para antígenos celulares concretos.
BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA. Cultivos celulares
3. Procedimientos de cultivo celular
3.3 Recuento y viabilidad celular
Para conocer la densidad celular debemos conocer la
concentración de células y cuántas de estas son células viables.
Colorantes vitales: nos permiten
diferenciar las células vivas de las
muertas. El más usado es azul
tripano, que penetra en el interior
de las células con membranas
rotas muertas) Los recuentos se pueden realizar
manualmente, en cámara de Neubauer,
o empleando métodos automáticos
(autohemocitómetros)
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3. Procedimientos de cultivo celular El descongelado es un procedimiento
habitual en el laboratorio para iniciar
3.4 Descongelación de células
cultivos secundarios, a partir de líneas
celulares mantenidas en
Se trabaja en cabina de bioseguridad. Los pasos son los siguientes: ultracongeladores a-80ºC.
1. Incubar el vial de células congeladas a 37ºC en un baño
2. Limpiar la superficie externa del vial con etanol a 70%
3. Transferir el contenido del vial a un tubo y añadir medio de cultivo nuevo atemperado a
37ºC
4. Congelar el tubo a 800 rpm durante 5 minutos
5. Desechar el sobranadante, para eliminar el DMSO (crioprotector) que es tóxico, y
resuspender el pellet celular en medio de cultivo nuevo atemperado a 37ºC.
BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA. Cultivos celulares
3. Procedimientos de cultivo celular https://www.youtube.com/w
atch?v=Qv-Lo2bMjQc
3.5 Inicio de cultivo (siembra)
1. Elegir el recipiente a emplear
2. En base al recipiente debemos ajustar la densidad de células a sembrar
3. Añadir al recipiente un volumen adecuado de la suspensión celular y añadir el
medio de cultivo
4. Incubar a 37ºC, 95% humedad y 5% de CO2
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3. Procedimientos de cultivo celular
3.6 Mantenimiento del cultivo
1. Control periódico microscópico: normalmente entre 1 y 3 días.
2. Cambios de medio: así se renuevan los nutrientes consumidos y se eliminan los
productos de desecho generados por el metabolismo celular. Se realiza cada 2 o 3 días.
Nunca es total, sólo un 2/3 del total.
3. En los cultivos monocapa retiramos 2/3 del medio con una pipeta.
4. Los cultivos en suspensión se centrifugan suavemente, a 800rpm durante 5 minutos y
retiramos 2/3 del medio, resuspendiendo las células
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3. Procedimientos de cultivo celular
3.7 Pase o subcultivo
Cada 6 o 7 días los cultivos en monocapa
llegan a su confluencia máxima y los
cultivos en suspensión a su densidad
crítica.
• Cultivos en monocapa: se despegan las células de la superficie, de
forma mecánica con rascadores o scrappers o de forma enzimática
con tripsina. Después se realiza un recuento de viables y se realiza un
subcultivo.
• Cultivos en suspensión: se realiza el pase a partir del recuento de
viables.
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3. Procedimientos de cultivo celular
3.8 Conservación de células
Las líneas celulares continuas o
inmortales se pueden conservar
mediante su congelación.
1. Obteniendo una suspensión celular del cultivo monocapa, por medios mecánicos o
enzimáticos. Los cultivos en suspensión no precisan este paso.
2. Centrifugamos a 800rpm durante 5 min y se resuspende junto con FBS y DMSO. La
concentración final de células debe ser de 10^6 células/Ml
3. Se alicuotan en criotubos de 1mL y se procede a su congelación progresiva. Las
primeras 24h a -20ºC y a continuación otras 24h a -80ºC
4. Después pueden conservarse a –196ª en nitrógeno líquido de forma indefinida.
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4. Contaminaciones
4.1 Bacterias, levaduras y hongos
BACTERIAS Y LEVADURAS Corto plazo
HONGOS FILAMENTOSOS Largo plazo
El uso de antibióticos y antifúngicos no siempre es suficiente. Para ellos debemos:
• Trabajar siempre en condiciones estrictas de asepsia
• Tener cuidado al manipular los recipientes
• Limpiar las superficies con etanol al 70%
• Si el incubador de cultivos tiene una bandeja para proporcionar humedad, cambiar el agua de
forma regular y añadir antisépticos
• Si hay un cultivo contaminado, eliminarlo
BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA. Cultivos celulares
4. Contaminaciones Los micoplasmas son
microrganismos procariotas
4.2 Micoplasmas
sin pared celular.
• La contaminación suele provenir de líneas celulares continuas, que se
suministran contaminadas o de una contaminación de los sueros animales.
• No es fácil de detectar.
ARN
• Se puede detectar amplificando mediante PCR, amplificando el 16S RNA
ribosómico
• Hay que aislar el cultivo y eliminarlo en el caso que sea posible, o tratarlo con
antibióticos
BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA. Cultivos celulares
4. Contaminaciones
4.3 Virus Se denomina efecto citopático
(ECP) a los cambios bioquímicos y
moleculares, morfológicos y de
• Poco frecuente pero grave
viabilidad celular, visibles a
• La fuente de contaminación suele provenir de sueros animales
microscopía óptica, causados
• Se detecta mediante la observación del efecto citopático
durante el ciclo de replicación viral.
• Eliminar el cultivo y esterilizarlo mediante irradiación
Efecto citopático.
A: Cuerpos de Negri en un tejido de cerebro infectado por rabdovirus
BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA. Cultivos celulares B: Cuerpo de Filkendey en sarampión
