TEMA 3 MÉTODOS DE SEPARACIÓN: ELECTROFORESIS

INTRODUCCIÓN

-Métodos de separación: permiten separar el analito del resto de componentes de la muestra o

determinar simultáneamente varios analitos de una muestra (identificación y cuantificación).

-Los más usados son la cromatografía y la electroforesis. Esta última proporciona elevada resolución,
sobre todo con moléculas grandes.

-Electroforesis (EF): técnica que permite la separación de componentes de la muestra mediante la

aplicación de un campo eléctrico. La separación, debida a la corriente eléctrica, se produce en función
de la relación carga/masa (dependerá de cuánta carga tenga la partícula y además de cómo de grande
sea la partícula) y/o tamaño de los analitos.

-Fue desarrollada por Tiselius (1937), quien consiguió llevar a cabo la separación de proteínas en
disolución (frente móvil).

-Con el desarrollo posterior de la técnica surgió la EF de zona (1950), que aplica la muestra sobre un
soporte (papel, acetato de celulosa, geles) y permite la separación de grandes proteínas, aminoácidos e
iones inorgánicos. Permitirá identificar.

-A ella se sumaron otras variantes (70s): isoelectroenfoque (existe un gradiente de pH y se van

separando cuando su punto isoeléctrico iguala al pH. Dan bandas) e isotacoforesis (se basa en la
velocidad), basadas en distintas propiedades (pH y velocidad).

-También se realizaron modificaciones (80s): EF capilar (tubos capilares como soporte)

y EF de gel de campo pulsante (pulsos de campos eléctricos perpendiculares entre sí).

-Cabe destacar las aportaciones de Reuss (1809) quien observó que partículas de arcilla
suspendida en agua se movían hacia el polo positivo.

-Esto reveló la polarización de la sílice y permitió obtener los capilares de sílice fundida.

FUNDAMENTOS DE EF

-Las partículas cargadas migran bajo la influencia de un campo eléctrico.

-La velocidad de migración (velocidad electroforética) resulta del equilibrio entre la fuerza eléctrica
(impulsora) y la ley de Stokes (rozamiento)

-La fuerza impulsora será una fuerza eléctrica:

F = q. E

q= carga de la partícula
E= campo eléctrico
-La fuerza de rozamiento viene dada por la Ley de Stokes:

F r=6. π .r . η . v

r = radio de la partícula
μ = viscosidad del medio en el que hago la electroforesis (gel por ejemplo).
v = velocidad

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-La velocidad de migración (velocidad electroforética) resulta del equilibrio entre la fuerza eléctrica
(impulsora) y la ley de Stokes (rozamiento). Como mínimo hay que igualarlas para que la partícula se
mueva.

F=F r → q . E=6. π . r . η. v

q. E q. E
v= = → v =μef . E
6. π . r . η . v f

q
μef =
6. π . r . η

f: factor de fricción

-Hay una separación porque los analitos se van moviendo a una velocidad distinta. Para cada analito, su
movilidad electroforética (velocidad de cómo se mueve en el medio) depende de su carga y de su radio
(tamaño).

-Movilidad electroforética (μef): velocidad de migración por unidad de campo eléctrico (depende de la
relación carga/masa de la partícula)

-La movilidad electroforética de una partícula dependerá de su carga, de su masa, del medio en el que
tiene lugar la separación y del campo eléctrico.

 Tampón: fuerza iónica (mantiene el pH y la conductividad). Es importante el tampón para

mantener el pH y que permita conducir la corriente eléctrica.
 Soporte: en los soportes se pueden producir fenómenos de adsorción (retención inespecífica:
el analito puede quedar retenido) y tamiz molecular (tamaño. Si las moléculas son demasiado
grandes y no pueden atravesar los huecos del gel no podrán pasar y, por tanto, no podré
separarlos).

TIPOS DE EF

1. Electroforesis libre o de frente móvil

2. Electroforesis de zona (convencional)
a. En papel
b. En acetato de celulosa
c. En gel (agarosa, poliacrilamida y almidón).
d. Capilar

Electroforesis libre o de frente móvil

-Está en desuso, ya que la separación no es limpia y los límites no son visibles. Solo vemos que toda la
disolución se mueve. En el momento en el que corto el campo eléctrico, la
disolución vuelve al nivel original.

-La muestra se introduce en disolución tampón (para mantener el pH, que influye
en la carga y también influye sobre el tamaño de las partículas, por la solvatación)
en un tubo en forma de U con un electrodo en cada extremo. Se mueve toda la
disolución cuando se produce la separación, según las cargas que tengan las
partículas, irán hacia un lado u otro.

-Se usa para la identificación de la presencia de proteínas.

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Electroforesis de zona

-La muestra se aplica como una banda rodeada de tampón en un soporte. Los componentes se separan
en bandas o zonas puras: separación eficaz.

-Se debe controlar el pH (con el tampón), pues este influye en la carga de los distintos analitos.

-Los soportes podrán ser de distinto tipo:

 Papel: desuso
 Acetato de celulosa: uso limitado (proteínas séricas → sangre)
 Gel: tamaño (gran aplicación).
 Capilar: en expansión.

EF en papel

-La muestra se aplica sobre papel de filtro, el cual tiene los extremos sumergidos en el tampón.

-Los componentes migran paralelos a las fibras del papel en función de su relación carga/masa.

-No requiere preparación ni interfiere en la separación, pero presenta baja resolución y aplicación muy
restringida, por lo que no suele utilizarse.

-En la figura de la derecha vemos el papel. El punto de

color amarillo es el punto en el que se colocó inicialmente la muestra (en el centro). A la derecha de este
punto se encontrarán las partículas cargadas positivamente (van al cátodo) y a la izquierda los iones
negativos (van al ánodo). Esto nos permitirá saber cuáles son las partículas positivas y cuáles las
negativas.

EF en acetato de celulosa

-La muestra aplicada sobre finas tiras de acetato de celulosa con los extremos sumergidos en el tampón
(mínima adsorción y bandas bien definidas).

-Las tiras de acetato de celulosa hay que acondicionarlas, introducirlas en un tampón. Además, al
contrario que en el papel de filtro, las tiras de acetato de celulosa tienen dos caras distintas, una cara
porosa y otra no porosa. Tenemos que poner la cara porosa hacia arriba, y ahí depositar la muestra. De
esta manera quedará retenida en el soporte.

-Pueden transparentarse y disolverse, pero presentan débil resolución, por lo que se aplica casi
exclusivamente a proteínas séricas y fracciones de Hb.

-La ventaja de las tiras de acetato de celulosa, teóricamente, es que permite

algún tipo de cuantificación.

-Como se usan para proteínas (cargadas negativas), la muestra se deposita en el lado más próximo al
lado negativo para que las proteínas se desplacen hacia el positivo.

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EF en gel (GE-gel electrophoresis)

-La muestra aplicada en un gel (agarosa y poliacrilamida).

-Gel: estado intermedio entre sólido y líquido con un reticulado de poros de diferente dimensión.
Cuanto más concentrado esté el gel, más pequeñas serán las oquedades, más pequeños serán los
fragmentos que puedo separar.

-El gel se sumerge en el tampón y la muestra se aplica en un hueco practicado en él (pocillo). Con los
electrodos a ambos lados del gel, la muestra migra a su través (separación según relación carga/masa y
tamaño).

-Existen distintos tipos:

 Agarosa:
o Entramado de cadenas de galactosa que gelifica con estructura 3D en doble hélice con una
cavidad central.
o Se disuelve en caliente en el tampón y se deja enfriar en el puente de la cubeta.
o Se usan para electroforesis horizontal.
o Permiten separar fragmentos de ADN.
 Poliacrilamida (PAGE “polyacrylamide gel electrophoresis”).
o Monómeros de acrilamida polimerizados en cadenas por un entrecruzante (bisacrilamida).
o El grado de entrecruzamiento determina el tamaño de poro y esto está relacionado con el
tamaño de las partículas a separar.
o Puede realizarse en condiciones nativas (NATIVE-PAGE) o desnaturalizantes (SDS-PAGE,
añadiendo SDS). Las proteínas tienen entre sus cadenas, a veces, puentes disulfuro. El SDS
rompe los enlaces disulfuro. Dará lugar a más bandas, más fragmentos.
o Electroforesis vertical.
o Permiten separar fragmentos de proteínas.

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  Isoelectroenfoque (IEF “isoelectrofocusing”):

-EF en gel con gradiente de pH.

-Se establece un gradiente estable de pH en el gel por adición de los

anfolitos adecuados. Se coloca una mezcla de proteínas en un pocillo del gel
y se aplica un campo eléctrico. Las proteínas se distribuyen a lo largo del gel
en función del punto isoeléctrico (pI).

-Los componentes de muestra migran en el gel mientras están cargados. Al

llegar a la zona de pH = pI, presentan carga nula y se paran. Añadiendo
anfolitos se consigue diferenciar hasta 0,001 unidades de pH. Requiere bastante tiempo (migración cada
vez más lenta) y refrigeración.

 EF bidimensional (2D-EF):

-2 EF consecutivas distintas o en distintas condiciones y realizadas en direcciones perpendiculares (2D).

En la 1º se separan los componentes según un criterio (carga, tamaño, pI) y en la 2º en función de otro
distinto o en diferentes condiciones. Se consiguen 2 modos de separación y máxima resolución.

 EF en gel de campo pulsante (PFGE)

-Variante en gel de agarosa que permite separar componentes demasiado grandes para atravesar los
poros del gel, alterando la dirección del campo.

-La muestra se carga en gel de agarosa al 1% y se aplican 2 campos eléctricos en diferente dirección,
alternando entre 2 pares de electrodos.

-Se consigue separar fragmentos de varias Mb (megabases) frente a 20-40 Kb convencional.

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Isotacoforesis (ITP – Isotacophoresis)

-Separación de componentes por desplazamiento en grupos de igual velocidad de migración (E →

v=cte).

-Soporte: tubo de material aislante (PTFE: teflón).

-La muestra migra disuelta en el tampón (similar a EF libre). El tampón además tiene disuelto un ion que
se moverá más rápido (líder) que cualquier compuesto de la muestra y otro ion que se mueve más lento
que cualquier otro de los componentes de la muestra (terminal). Suelen usarse espaciadores, es decir
iones de μef intermedia entre los componentes de la muestra. La función de estos iones espaciadores es
que si los iones de la muestra se descolocan por lo que sea, mantienen las velocidades separadas.

-Ventajas:

 Presente elevado poder de resolución.

 Alta precisión
 Gran flexibilidad.

EF Capilar (CE – Capillary electrophoresis)

-EF en tubos capilares de 25-150 μm de Ф interno y 50-100 cm de longitud (sílice fundida).

-La separación depende del flujo electrosmótico.

Ventajas:

 Requiere mínima cantidad de muestra y de reactivos.

 Aplicable a gran cantidad de analitos.
 Proporciona una resolución muy elevada.

-Los extremos del capilar están dentro de un tampón. El flujo electrosmótico

ayuda a que todas las partículas se muevan en el mismo sentido. Todas irán al
mismo lado, pero no todas tienen la misma carga. Tengo un detector,
colocado casi al final del capilar. La detección se realiza directamente en el
capilar, pues este actúa como una celda de detección. Cada vez que un ion
pasa por el detector da una señal.

Variantes de electroforesis capilar:

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  CE de Zona: muy sencilla y versátil

-El tubo capilar se rellena con la disolución tampón, cuyo pH determina el grado de ionización y la μef de
los iones (separación). La μeo (movilidad electroosmótica) se controla con la carga de la pared del capilar
(del grupo silanol ) y la viscosidad (η) del tampón.

-El capilar debe ser rellenado con un buffer adecuado. Su pH es la clave para la separación, pues
determina el grado de ionización y por tanto, la movilidad relativa de los distintos analitos de la muestra.

-Los analitos se separarán, saliendo en el siguiente orden: cationes, neutros (coeluyen todos juntos con
el flujo electrosmótico) y aniones.

 CE en gel

-Los capilares también podrán estar rellenos de gel como un tamiz molecular (GE). La separación se basa
en la diferencia en el tamaño de las especies químicas que queremos separar. A mayor tamaño del
analito más le costará pasar por el tamiz, es decir, a más PM, más tiempo de migración.

-El gel usado como relleno, elimina el flujo electrosmótico, por lo que las moléculas neutras no migran y
se evita la adsorción de los analitos en las paredes del capilar.

-Se usa para separar moléculas de elevado PM: polímeros, proteínas, etc.

-Es útil en igual relación carga/masa.

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  Isoelectroenfoque capilar (CIEF capillary isoelectrofocusing)

-IEF en tubo capilar, separa péptidos, proteínas, aa (carácter anfótero) en función de su punto
isoeléctrico.

-El extremo anódico del capilar se sumerge en una disolución ácida (alta concentración de protones,
valores bajos de pH) y el extremo catódico se sumerge en una disolución básica (baja concentración de
protones). Ambos anfolitos generan un gradiente de pH. Al aplicar un campo eléctrico, los analitos
migran hasta un pH= pI (en ese momento quedan neutros y se paran). Los analitos quedan por tanto,
retenidos en bandas de acuerdo con sus puntos isoeléctricos. Una vez en estado estacionario, los
analitos se extraen del capilar aplicando una presión electrostática manteniendo el campo eléctrico, se
desplazan las especies separadas hacia el detector. Las bandas irán pasando por delante del detector a
una velocidad constante.

-Las altas eficiencias obtenidas con este procedimiento permiten separar péptidos con Pi que apenas
difieren entre sí unidades de pH.

-En este tipo de electroforesis se debe eliminar el flujo electrosmótico, usando por ejemplo un capilar
relleno internamente con alguna sustancia que evite que se genere dicho flujo. Si no se evita esto, los
analitos una vez que se hayan quedado retenido en sus bandas correspondientes, serían arrastrados por
el flujo electrosmótico.

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  Isatacoforesis capilar (CITP: capillary isotacophoresis)

-ITP en tubo capilar.

-Isotacoforesis significa electroforesis a velocidad uniforme.

-Se trabaja con un sistema discontinuo de buffer. Los componentes de la muestra viajarán situados
entre un ion delantero (con la mayor movilidad electroforética de la muestra) y un ion posterior (con
menor movilidad electroforética). Alcanzado el estado estacionario, los analitos viajarán separados pero
a una misma velocidad que estará determinada por el electrolito principal (ion delantero).

-El campo eléctrico se autoajusta en cada zona para mantener una velocidad constante. En la zona de
mayor movilidad (principal) el campo eléctrico será menor y en la zona de menor movilidad el campo
eléctrico será mayor.

 Cromatografía electrocinética micelar (MEKC)

-Híbrido entre electroforesis capilar (CE) y cromatografía de líquidos (LC).

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-Permite separar analitos cargados y neutros. Dentro de las micelas hay una oquedad, ahí podrán entrar
analitos cargados o neutros.

-La separación de los analitos neutros se basa en la adición en el buffer de un tensioactivo que permite
formar micelas, concentración micelar crítica. Éstas tienen una parte hidrofóbica (en el interior) y parte
hidrofílica (en el exterior). Permiten transportar moléculas insolubles en un medio acuoso, al quedar
atrapados por interacción hidrófoba, dentro de la micela. Los analitos neutros se distribuyen entre la
fase micelar y en el medio acuoso del buffer. Tenemos por un lado que las moléculas neutras
interaccionan con la micela en diferente grado según su hidrofobicidad y adquieren así una movilidad
electroforética.

Los compuestos hidrofílicos, que no interaccionan con la micela, van a eluír junto con el flujo
electroosmótico.

-Los compuestos que quedan dentro de la micela, eluirán con esta.

-Los analitos cargados se separarán por la acción del flujo electrosmótico.

-Variante 1:Empleo de ciclodextrinas (CD’s): unidades de glucosa cíclicas formando un tronco de cono
con cavidad hidrófoba y superficie hidrófila. Como tengo troncos de distintos tamaños, las partículas
entrarán en el tamaño que más se le corresponda. Las partículas metidas en la ciclodextrina son
desplazadas, independientemente de su carga.

Variante 2:
Cro matografía

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electrocinética micelar con CD’s (CD-MEKC): Se añade surfactante y CD’s al tampón por lo que habrá
micelas en el medio y CD’s. Los compuestos buscarán la oquedad que más le interese, esto es porque
tengo compuestos muy diferentes a separar.

TÉCNICA PRINCIPIO DE SEPARACIÓN

CZE Movilidad libre en disolución: los analitos cargados se distribuyen en función de su
relación carga/masa.
CGE Carga y tamaño: los analitos cargados se distribuyen en un gel portador en función de
su relación carga/masa y de su tamaño.
CIEF Punto isoeléctrico: los analitos cargados se distribuyen en función de su pI y del pH del
medio.
CITP Límites de movilidad: los analitos cargados se distribuyen en función de su relación
carga/masa en tampones de distinta movilidad.
MEKC Distribución en una fase micelar cargada: los analitos cargados y neutros se distribuyen
entre dos pseudofases de diferentes movilidades.

EF CAPILAR (CE)

-Soporte: tubos capilares de sílice fundida.

-A un pH igual o mayor que tres, hace que los grupos silanol de la pared interna presentan carga
negativa, por lo que se genera una doble capa eléctrica y aparece el flujo electrosmótico (EO).

-En la disolución tengo cargas positivas y cargas negativas. Al hacerlo pasar por el tubo capilar, las cargas
positivas se quedarán pegadas a la carga negativa del tubo. Se crea una capa fija, llamada capa de Stern.
Después se genera una capa difusa, los cationes estarán más cerca de la pared que del centro. En la capa
difusa hay más cationes que aniones. Se genera un potencial Z. Todas las cargas de la capa difusa se
arrastrarán hacia el electrodo negativo (cátodo). Todas estas cargas estarán rodeadas de disolvente,
arrastrando por tanto al disolvente hacia el cátodo. Se crea el flujo electrosmótico.

-En EF todo se mueve hacia el cátodo. Una vez que incorporo los analitos al disolvente, éstos serán
arrastrados por el flujo.

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v=μeo . E
μeo = movilidad electrosmótica
ε .ζ
μeo = → ≠ f ( especie )
4. π . η

V= μap . E

μap = μef + μeo

-La movilidad aparente es la suma de la movilidad electroforética y electrosmótica.

 Si tengo cargas positivas, las dos movilidades van en el mismo sentido, se unen. Cuanto más
cargado esté, más rápido se moverá. Los cationes más cargados serán los que más rápido
salgan.
 A continuación, salen los neutros, solo dependen del flujo electromótico.
 En último lugar, salen los negativos, que lucharán contra el flujo electrosmótico, que ha de ser
más fuerte que la atracción que sienten por el ánodo.

-El flujo electrosmótico provoca que el frente de la corriente de líquido en CE sea plano, a diferencia de
lo que ocurre en HPLC debido a la presión. Esto genera picos estrechos y bien definidos. En
electroforesis no ejercemos presión, pero esto sí
pasaba en cromatografía. Es más fácil integrar
en electroforesis, al ser los picos más estrechos
y definidos.

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-En la entrada del capilar tendremos el ánodo y a la salida el cátodo.

INSTRUMENTACIÓN
 Fuente de alto voltaje.
 Reservorio de electrolito (tampón)
 Capilar
 Sistema de inyección de muestra
 Detector
 Sistema de adquisición y procesamiento de datos (ordenador) - Electroferograma

Fuente de alto voltaje

-Fuente de corriente constante conectada a dos electrodos de Pt sumergidos en el tampón, capaz de

proporcionar 10-30 kV y 10-1000μA.

Reservorio de tampón

-Recipiente donde se sumergen los electrodos (paso de corriente) y los extremos del capilar.

Capilar

-Tubo de sílice fundida (50-100 cm y diámetro interno 50 μm) recubierto de poliamida.

-Proporciona una resolución elevada N> 200.000 platos /m.

-Requiere acondicionamiento, pasaremos una disolución de NaOH (pH=12) para que el flujo
electrosmótico sea constante y reproducible.

-Para usar los detectores más habituales, consta de una ventana (celda de detección), que se consigue
retirando el recubrimiento de poliamida con calor y limpiando la zona con MeOH (elimina cualquier
interferencia).

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Sistema de inyección de muestra

-Se cambia el vial de tampón de entrada por el de muestra y se aplica inyección durante 10-30 s
(cantidad de muestra del orden de nl). La muestra podrá entrar por 2 sistemas distintos:

 Hidrodinámica: gradiente de presión (inyección espontánea e incontrolada). Podrá ser de 3

formas:
o Por gravedad: coloco el vial con muestra más alto que la salida. La fuerza de gravedad
hará que se entre la muestra dentro del capilar.
o Por presión: Tengo el vial con la muestra cerrado y hago presión vertical haciendo que
la muestra se desplace.
o Vacío: aplico vacío en la parte donde recojo la muestra, de manera que hace que la
muestra se desplace del capilar.

 Electrocinética: diferencia de potencial. El problema es la baja reproducibilidad, no puedo

asegurar que todos los analitos tengan la misma posibilidad de entrar en el capilar, hay analitos
que se verán más atraídos por la diferencia de potencial que otros. Si tengo que repetir el
análisis no garantizo que vaya a ocurrir exactamente lo mismo.

Detectores

-Dispositivo que registra los analitos directamente en la ventana del capilar.

-El uso de uno u otro dependerá del tipo de analito a determinar.

 UV-vis:
o Uno de los más usados por su facilidad de trabajo.
o Elevada estabilidad
o Universal
o Opera a una única λ (≈240 nm), para ello uso un monocromador. Al llegar al
fotodiodo, registra la absorbancia cuando los analitos llegan a la ventana del capilar.

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  Fluorescencia:
o Registra la emisión de fluorescencia al pasar los analitos por la ventana del capilar.
o Presenta elevada sensibilidad y selectividad, pero hay pocas sustancias fluorescentes
(requiere derivatización, si mi analito no tiene las condiciones necesarias para usar
este método, podré modificar químicamente el analito para que si cumpla las
condiciones).

-Ambos pueden usarse en forma inversa: el electrolito es el cromóforo (grupo que genera color) o
fluoróforo (grupo que emite fluorescencia) y medir el descenso de absorbancia al registrar los analitos.
Cuánto absorbe o cuánto emite.

 Detección electroquímica (conductividad o amperométrica)

-Registran la diferencia de conductividad o intensidad de corriente cuando los

analitos pasan por la ventana del capilar.

-El conductimétrico es universal, pero poco sensible; mientras que el

amperométrico es muy sensible pero altamente selectivo.

 Detección conjunta conductimétrica (iones de movilidad diferente al

tampón) y UV–vis (iones de movilidad similar).
 Espectrometría de masas (MS):
o Registra el espectro de masas de los analitos proporcionando óptimos resultados e
identificación inequívoca.
o Requiere una interfaz (donde se mezcla por ejemplo, con el ácido acético) para
acoplarlo al equipo de CE.
o Ej. Electrospray (forma de introducir la muestra en masas) necesita un mayor flujo,
que se consigue mezclando la salida del capilar con un disolvente orgánico (CH 3COOH
en baja concentración proporciona óptimos resultados).

Adquisición y procesamiento de
datos

-Ordenador que registra los resultados, con un software que permite obtener los electroferogramas y
trabajar con ellos.

Electroferograma

-Representación gráfica de resultados: señal frente al tiempo de migración.

-Los analitos eluyen a distintos tiempos (se separan) en función de las condiciones de análisis y el tipo de
CE utilizada.

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Tenemos una mezcla de iones (cationes),
podemos ver en el electroferograma
cómo van saliendo, y en qué orden: NH 4+,
K+, Ca+2, etc… Además de las cargas,
también influyen los tamaños, de ahí ese
orden de salida.

-El tiempo de análisis varía en función de

los analitos y las condiciones de análisis: se reduce al aumentar la temperatura y el pH, y suele ser
inferior a 30 min – 1 hora.

-Tiempo muerto: aquel en que no hay respuesta, solo eluye tampón, hasta la aparición del primer
analito.

-Identificación: comparación tiempo de migración con sustancias patrón.

Cuantificación: medimos el área o altura de pico.

APLICACIONES
-Determinar aniones, cationes y sustancias neutras de forma simultánea.

-Gracias a la detección por MS y fluorescencia inducida por láser se incrementaron los campos de
aplicación:

 Medicina: determinación de proteínas, péptidos, marcadores tumorales, drogas, etc.

 Farmacia: control de calidad.
 Análisis alimentario: fraccionamiento y cuantificación de aminoácidos, hidratos de carbono,
aditivos, contaminantes.
 Control ambiental: identificación de contaminantes y sus metabolitos (pesticidas, metales
pesados, hidrocarburos, etc.).

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