INSTITUTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
FUNDAMENTOS BIOLÓGICOS DE LA MEDICINA
PRÁCTICO #8: Extracción y visualización de DNA de células
epiteliales
Carrera: Docente:
Medicina Morales Navarro, Samuel
Integrantes: Ayudantes:
González González, Jaime Añez Paz, Daniela
Moraga Vásquez, Carlos García Sepúlveda, Martina
Muñoz González, Marcelo Valenzuela Navarro, Javiera
Vásquez Fierro, Sofía
[email protected]
23 de octubre de 2024
Introducción
El ADN, o ácido desoxirribonucleico, es una molécula muy importante ya que esta
contiene la información genética necesaria para el desarrollo de todos los seres
vivos. Posee una estructura de doble hélice compuesta por nucleótidos que se
organizan en secuencias específicas para armar cadenas. Esta molécula juega el rol
fundamental en la transmisión y almacenamiento de información genética que se
traspasa de generación en generación. Un mayor entendimiento del ADN ha sido
muy relevante en muchos ámbitos, entre ellos la medicina, biotecnología, genética,
etc. Gracias a esto, se han permitido muchos avances y conocimientos en
mecanismos y procesos fundamentales de la vida (Watson, 2018).
La extracción de ADN es un proceso muy importante, en el cual se puede obtener y
purificar esta molécula a partir de las células de múltiples organismos. Este
mecanismo de extracción de ADN consiste en la ruptura de células para liberar el
citoplasma y con ello su contenido, separando proteínas y otros elementos celulares.
Con ello, se produce un aislamiento de la molécula y una posterior purificación
mediante el mecanismo de precipitación (Velázquez et al., 2014).
La electroforesis en gel de agarosa es una técnica utilizada en el área de biología
molecular para separar los distintos fragmentos de ácidos nucleicos. Este
mecanismo o técnica tiene como fundamento el movimiento de los diversos
fragmentos de ADN a través de un gel de agarosa como efecto proveniente de la
presencia de un campo magnético. Gracias a las tinciones, tales como bromuro de
etidio o GelRed (usado en laboratorio) se permite la localización del ADN y con ello
favorece la purificación. Esto se debe a que se pueden extraer determinadas bandas
en el proceso de electroforesis para un estudio más detallado (Fierro, 2014).
Un correcto manejo de los ácidos nucleicos es muy importante en diferentes áreas
de la ciencia, permitiendo en conocimiento y entendimiento de múltiples procesos o
situaciones muy importantes en la vida. Estas herramientas son claves en usos tales
como la investigación y diagnóstico de enfermedades, es por esto que un manejo
cuidadoso es crucial para asegurar avances muy significativos en biotecnología,
medicina personalizada y la farmacología (Mader et al., 2007).
La comprensión tanto funcional como estructural de los ácidos nucleicos es muy
importante para estudiar la relación de la expresión y la regulación de la información
genética, permitiendo entender diversos procesos biológicos con mayor detalle y
lograr mayores metas con respecto a la investigación en diversas áreas de la ciencia
(Bedregal et al., 2010).
Objetivo general
Extraer y purificar ADN genómico desde células epiteliales y analizar su integridad
mediante electroforesis en gel de agarosa.
Objetivos específicos
Recolectar y lisar células descamativas del epitelio bucal
Realizar precipitación del ADN y observar mediante electroforesis en gel de agarosa.
Hipótesis
"El uso de un tampón de lisis y precipitación con alcohol permitirá extraer y purificar
ADN genómico de células epiteliales de manera eficiente y sin fragmentación”.
Materiales y métodos
Para la extracción de ADN los integrantes del grupo mordieron suavemente, evitando
el sangrado, el interior de sus mejillas durante 30 segundos, pasado este tiempo se
realizaron un enjuague con agua durante otros 30 segundos. Luego cada enjuague
fue vertido a tubos de ensayos los cuales estaban rotulados con los nombres de los
integrantes, a cada uno se les agregó 2 ml de tampón de lisis (compuesto por 5 mL
1M Tris pH 8.0, 5 mL 10% SDS, 10 mL 0.5M EDTA pH 8.0, 2 mL 5M NaCl y 5 mL 1M
Sacarosa) y cubierto con Parafilm para agitar suavemente por inversión. Después a
cada tubo se le agregó 10 µl de solución de proteinasa K y nuevamente cubierto con
Parafilm y agitado suavemente por inversión para posteriormente ser puestos en un
baño termorregulado marca “Thermo Scientific” modelo “GP 10” durante 10 minutos
a 56°C. Pasado este tiempo a cada tubo de ensayo le agregó 0,5 ml de NaCl 500mM,
los tubos se cubrieron con Parafilm para ser agitados suavemente por inversión una
última vez, luego se quitó el Parafilm y se dejó escurrir por las paredes del tubo 10
ml de alcohol isopropílico frío, los tubos se dejaron reposar sin agitar y una vez que
ADN precipitó entre la interfase de la solución se recolectó y se traspasó a un tubo
de eppendorf el cual se centrifugó a 15.000 rpm durante 30 segundos en una
centrifuga marca “Arquimed” modelo “D2012 plus DLAB”, luego por inversión se
descartó el sobrenadante. Tras la centrifugación, el ADN se separó del tubo
Eppendorf mediante una técnica de "papirotazo" y se disolvió en 20 microlitros de
agua destilada utilizando una micropipeta RAININ P20.
Para la electroforesis, el procedimiento se llevó a cabo por el equipo docente. Se
selló con cinta adhesiva la bandeja de electroforesis, luego se pesaron 0,7 g de gel
de agarosa los cuales se mezclaron con 100 mL de tampón de 1 x TAE, esto se
fundió en microondas y posteriormente se dejó enfriar hasta alcanzar una
temperatura de 55°C. Luego se vertió 40 mL de la mezcla en una bandeja formadora
de gel, se le colocó el peine formador de pocillos y se dejó reposar por 15 minutos
para solidificar. Una vez solidificado se retiró la cinta adhesiva junto con el peine
formador de pocillos y se instaló la bandeja en la cubeta procurando que el extremo
que contiene los pocillos se sutiara próximo al cátodo. Luego se sumergió el gel en
un tampón de electroforesis 1 x TAE y posteriormente, utilizando una micropipeta
P20 se mezcló 5 μL de DNA con 3 μL de GelRed (20x). Luego se conectó la cubeta
de electroforesis a corriente y se puso a 80 V durante 45 minutos. Al finalizar, se
desconectó la fuente y se visualizó el gel sobre el transiluminador de luz ultravioleta
tomando registro fotográfico de lo obtenido.
Resultados
A. Extracción de ADN en células epiteliales
Figura 1: precipitación del ADN de uno de los integrantes del grupo.
Resultados: En cada tubo, junto con su correspondiente muestra de ADN procedente
de células epiteliales de la mucosa oral, tras la adición del etanol a baja temperatura
se observó la formación de un precipitado de tonalidad entre blanquecina y
transparente. Este precipitado se distribuyó principalmente en la región central del
contenido del tubo y se logró apreciar que este contaba con diminutos filamentos
de la misma tonalidad.
B. Electroforesis
Fig. 2. Resultados en electroforesis en gel de agarosa 0.7% p/v
Resultados: Se observa en la casilla que la muestra de ADN obtenida se encuentra
integra, ya que se aprecia una sola banda en la corrida electroforética.
Discusión
Los ácidos nucleicos son macromoléculas las cuales se encargan del
almacenamiento, transformación y uso de la información hereditaria en los seres
vivos. Hay dos tipos de ácidos nucleicos, el ADN (ácido desoxirribonucleico) y el ARN
(ácido ribonucleico), ambos están formados por unidades de nucleótidos (Purves et
al, 2006).
El ADN es un nucleótido el cual consiste en una azúcar pentosa desoxirribosa, un
grupo fosfato y una de las cuatro bases nitrogenadas (timina, citosina, guanina o
adenina). Para numerar los átomos de una molécula se utiliza un sistema ideado por
químicos orgánicos, es por esto qué en cuanto a la química del ADN los carbonos
individuales de cada azúcar y en cada base están numerados en base a este sistema.
Los carbonos que se encuentran en una base se designan con números (1, 2, 3,
etc.), sin embargo, para diferenciar los carbonos que se encuentran en una azúcar
se utilizan números con símbolos primos (1’, 2’ 3’, etc.). En la molécula de ADN la
base nitrogenada esta unidad al carbono 1’ del azúcar y el grupo fosfato esta unido
al carbono 5’ (Solomon et al, 2013).
Figura 1: Estructura del nucleótido. A) grupo fosfato, B) azúcar y C) base nitrogenada.
Los nucleótidos se encuentran unidos mediante enlaces covalentes, formando una
estructura que alterna azúcar fosfato. El carbono 3’ de un azúcar está unido al 5’
fosfato del azúcar adyacente, de esta manera se forma un enlace 3’,5’ fosfodiéster.
Como resultado se obtiene un polímero de longitud indefinida, es así como la
mayoría de las moléculas de ADN que se pueden encontrar en células son largas
cadenas formadas por millones de bases. Sin importar el largo de la cadena, esta
siempre tendrá en un extremo un carbono 5´unido a un grupo fosfato y, en el otro
extremo tendrá un carbono 3’ unido a un grupo hidroxilo (Solomon et al, 2013).
Generalmente, los nucleótidos se organizan formando una macromolécula
compuesta por dos secuencias, las cuales realizan una interacción antiparalela entre
sí mediada por puentes de Hidrogeno entre las bases nitrogenadas. La base
nitrogenada Timina se liga casi siempre a la base Adenina y la base Citosina se liga
casi siempre a la base Guanina (Lodish et al, 2005).
Figura 2: representación de la interacción antiparalela de las secuencias de nucleótidos en una molécula de ADN
En cuanto a las técnicas empleadas para el análisis del genoma, estas dependen en
su gran mayoría de la habilidad para extraer el ADN, para lo cual, existen diversos
métodos de extracción (Mosquera, 2005). La extracción de ADN es un proceso que
permite aislar el ADN para posteriormente analizarlo o utilizarlo en distintas
aplicaciones como por ejemplo en el área de la medicina para la identificación de
genes y mutaciones causantes de enfermedades o, en el área forense, permitiendo
la identificación de personas.
El tampón de lisis empleado se utiliza comúnmente para la ruptura de células y la
extracción de ácidos nucleicos o proteínas. El TRIS (Hidroximetil aminometano) es
un tampón biológico, cuya función es mantener el pH de la solución constante
(Mosquera, 2005). El EDTA (Ácido etilendiaminotetraacético) Se utiliza en la
extracción del ADN gracias a sus propiedades, ya que este es un agente quelante
de iones metálicos como Ca+2 y Mg+2 el cual inhibe la acción de las nucleasas
(enzimas que podrían degradar el ADN) al no haber cofactores libres para su
actividad y así, proteger al ADN en la extracción (Mosquera, 2005). El SDS (dodecil
sulfato de sodio) es un detergente aniónico el cual, en este caso fue utilizado para
la lisis celular al romper las membranas celulares (se profundiza un poco más
adelante), facilitando así la liberación de ácidos nucleicos (Carrillo, 2012). La
sacarosa utilizada en este tampón de lisis colaboró con la desestabilización de la
estructura celular mediante el cambio de la presión osmótica. En cuanto al NaCl,
este se utilizó para la estabilización de las proteínas, evitando su precipitación al
momento de la extracción del ADN (Cadavish & Gómez, 2018).
En los procesos de extracción de ADN se utiliza la proteinasa K, enzima empleada
para la purificación de la muestra mediante digestión enzimática, ya que esta digiere
proteínas y remueve contaminaciones proteicas. Además, la proteinasa K inactiva
nucleasas. De esta manera se hace más efectiva y exitosa la extracción del ADN
(Lorena et al, 2021).
El alcohol isopropílico es utilizado en la extracción de ADN ya que este colabora con
la purificación eliminando contaminantes y proteínas. sin embargo, lo más
importante es que provoca la precipitación del ADN en soluciones acuosas
(Mosquera, 2005). Al añadir alcohol isopropílico a una solución que contiene ADN,
reduce la solubilidad del ADN y hace que este se concentre, lo cual permite que se
forme un precipitado visible, como se puede apreciar en la figura 1.
La mayoría de las biomoléculas poseen una carga eléctrica dependiente del pH al
que se vean expuestos, por lo que, ante un campo eléctrico, se desplazaran en la
dirección de la carga opuesta, es decir, que, si el elemento es negativo, este se
desplazará hacia el polo positivo. Este principio es el fundamento de la
electroforesis, permitiendo un movimiento basado en el porte y tamaño de la
molécula. Este procedimiento se aplica en aminoácidos y en ácidos nucleicos, este
último fue el aplicado en el practico, y se utilizaron células epiteliales del epitelio
bucal, debido a su fácil obtención por descamación. La principal diferencia entre
ambas biomoléculas dentro de la técnica de electroforesis es que los ácidos nucleicos
son todos negativos debido a la presencia de grupos fosfatos, mientras que los
aminoácidos pueden presentar cargas tanto positivas como negativas, por lo que se
necesita realizar una homogenización de cargas (Montes et al., 2016). Para los
procesos de extracción de ADN se busca dejar todas las proteínas con carga
negativa, esto se logra añadiendo algunos detergentes como puede ser el empleado
en este práctico: el dodecil sulfato de sodio (SDS).
Como ya se mencionó, el dodecil sulfato de sodio se encarga de cambiar la polaridad
de las moléculas, esto debido a ser del tipo iónico. Al ser de esta naturaleza es
perfecto para romper y deshacer las membranas celulares, ya que estas poseen una
zona polar y otra apolar, la cual se ve afectada por la acción de un detergente. El
romper membranas celulares no solo nos permite romper la membrana plasmática
liberando el contenido celular presente en el citosol, sino que también libera el
contenido de mitocondrias y el núcleo celular, liberando así los ácidos nucleicos de
ambos. Además de cumplir un segundo rol que sería el de “desactivar” las ADNasas
y ARNasas, ya que, al cambiar la polaridad de los aminoácidos, rompe los enlaces
covalentes de la proteína, desnaturalizando esta y por ende, evita que el material
genetico se vea afectado.
Todo este proceso hace que, como resultado, se obtenga una mezcla de ARN y ADN,
tanto mitocondrial como nuclear. Para conseguir solo ADN se deberían emplear
ARNasas en el precipitado, de esta forma el ARN se vería degradado quedando solo
ADN. En el caso contrario, pasaría lo mismo con una ADNasa, se degradarían las
cadenas de ADN quedando solo ARN.
Respecto a la electroforesis, lo principal es la cámara. Se vierte un contenido y las
muestras, este contenido (el cual es un gel que del que se profundiza más adelante)
posee muchos electrolitos, por ende, permite el paso de la corriente eléctrica. La
cámara posee dos electrodos, ubicados en lado opuestos, para generar una corriente
de energía. Respecto al contenido, este corresponde a un gel de carácter semisólido
o gelatinoso, que posea microporos tridimensionales, que generen una malla, para
así lograr el filtrado por tamaño. Se pueden usar geles de agarosa o de
poliacrilamida, ambos pueden emplearse para los ácidos nucleicos, pero solo el
ultimo para proteínas (Fierro, 2014).
Respecto al gel de agarosa, es un derivado de algas marinas, el cual a temperatura
ambiente es sólido, pero a temperaturas entre 50-60°C puede estar en estado
líquido. Este se usa en electroforesis para analizar ácidos nucleicos y proteínas, pero
a diferencia de otros, este no es tóxico y, además se pueden medir ácidos nucleicos
de peso variado. Sin embargo, en comparación con otros, su resolución es menor.
Se usa disuelto junto con otros componentes, que vendrían a ser una solución
corredora y un buffer de corrimiento, los tres se calientan hasta conseguir la mezcla
o solución para la electroforesis. Una vez que se tiene la consistencia requerida se
pone en un molde rectangular con un elemento llamado peine, el cual tiene unos
espacios donde irán las muestras, estos espacios se denominan “pocillos”. El tamaño
de los poros de la matriz dependerá netamente de la concentración de agarosa, a
mayor concentración, menor el tamaño de los poros y más lento corre la muestra.
Por lo general para ácidos nucleicos se usa entre 0.5-2% (Montes et al., 2016).
En cuanto al GelRed, este es un tincionante fluorescente utilizado en electroforesis
para teñir ADN o ARN en gel de agarosa, el cual se intercala entre los genes y de
esta manera permite visualizar ácidos nucleicos, ya que estos por si solos son
transparentes. Se caracteriza por ser extremadamente estable y seguro debido a
que no genera alteraciones en la salud de las personas que lo manipulan gracias a
que este no atraviesa membranas celulares ni tampoco los guantes de látex, lo cual
reduce la genotoxicidad (tóxico o dañino para el ADN) a diferencia de otros tintes,
como puede ser el bromuro de etidio. Resulta conveniente usar esta tinción en
electroforesis ya que es muy estable a temperatura ambiente para el
almacenamiento a largo plazo y en cuanto a las condiciones del entorno, este es
resistente a altas temperaturas (Echeverry et al, 2013).
Conclusión
Este practico nos permitió entender y experimentar con las distintas etapas del
proceso de extracción y posterior visualización del ADN. Los resultados obtenidos
confirmaron la eficiencia del protocolo seguido, ya que se observó la formación de
precipitados claros de ADN y la presencia de bandas definidas en el gel de agarosa,
lo que indicó la integridad y pureza del material genético aislado. Esto valida la
hipótesis inicial de que el uso de tampones de lisis específicos y la técnica de
precipitación con alcohol son efectivos para extraer ADN de manera eficiente y sin
fragmentación significativa.
La experiencia permitió consolidar el conocimiento teórico sobre los principios de la
extracción de ácidos nucleicos, destacando la importancia de la eliminación de
proteínas y otros componentes celulares para obtener un ADN de alta calidad.
Además, la visualización mediante electroforesis reforzó la comprensión de como
las características del ADN, como lo son su carga negativa y tamaño, influyen en su
movilidad a través del gel.
Sin embargo, se observaron ciertas problemáticas, como posibles contaminantes
que podrían haber afectado la pureza del ADN, evidenciados por bandas menos
definidas en algunos casos, por lo que a modo de recomendaciones se sugiere
mejorar el control de variables durante la fase de lisis y precipitación para evitar
interferencias junto con implementar medidas de limpieza más estrictas y control
de la contaminación en el área de trabajo. Además, se recomienda llevar un registro
detallado del paso a paso, incluyendo las condiciones utilizadas y los resultados
obtenidos, ya que esto permitirá identificar patrones y problemas recurrentes para
hacer ajustes en futuros experimentos.
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