Universidad Nacional Autónoma de México
Facultad de Estudios Superiores Zaragoza
Carrera:
Biología
Laboratorio de Investigación Formativa II
Experimento 3
Cromatografía
Integrantes del equipo:
García Martínez Areli Jocelyn
Guzmán Pérez Lindsay Yanick
Morales Suares Itzel Danae
Vega Delgadillo Samuel
Vera Guerrero Edgar Orson
Grupo: 2253
Fecha de entrega:
20-02-2023
Introducción
La cromatografía es un método de análisis químico descubierto por el botánico Mikhail
Tswett de 1906 para separar sus constituyentes y/o analitos una mezcla compleja.
Permite determinar las propiedades físico-químicas de los ingredientes la separación
depende de su solubilidad, tamaño, diferencia de carga, pureza, su caracterización
adicional de varias biomoléculas mediante tinción o mapeo.
Un cromatograma que consta de dos fases: fase estacionaria (utilizada para almacenar
componentes de la mezcla) y la fase móvil (usada para transportar los compuestos en la
mezcla).
Existen diferentes métodos cromatográficos y según ellos la configuración de fase
estacionaria es cromatografía plana: cromatografía en papel y TLC y Cromatografía en
Columna: Líquidos, Gases y fluido supercrítico.
Planteamiento del problema
Objetivos
Objetivo general:
Conocer la técnica de TLC, y CC, y conoces sus principales características
Objetivo articular:
Separar los diferentes pigmentos fotosintéticos mediante la técnica de
cromatografía
Hipótesis
Se espera que los disolventes más polares separen mejor los componentes en nuestra
muestra natural, es decir, se tenga una identificación clara de los componentes que estén
presentes.
Variables
Independientes Dependientes
Clorofila-a Etanol
Clorofila-b alúmina activada
Xantofila Agua destilada
Beta caroteno
Marco teórico
La cromatografía es un instrumento potente, cuando se debe dar la separación de líquidos
o gases de cierta mezcla. Además, esta nació a principios del siglo pasado con el objetivo
de extraer pigmentos específicos a partir de compuestos de origen vegetal. Si se ve la
industria farmacéutica, es en la que se demandan altos índices de pureza en los
productos, por ello, se ha mostrado gran interés por esta técnica en los últimos años.
Para el desarrollo de cromatografía aprendido en este trabajo, se introduce una fase
estacionaria o solida en una columna cilíndrica. Luego, se mete la mezcla (soluto) a
descomponer, seguida de un solvente o fase móvil que la puede conducir a lo largo de la
columna. La mezcla entra de esta manera en contacto con la fase estacionaria, y los
diferentes compuestos se separan según el grado de adsorción que este ejerce sobre
estos
En la cromatografía de adsorción en capa fina (TLC) la fase estacionaria se da en una
capa delgada de un adsorbente, ya sea un gel de sílice, alúmina o celulosa, depositadas
en un soporte plano, o una lámina de aluminio, vidrio o de plástico. La TLC es una técnica
analítica que tiene como un objetivo, el análisis de una mezcla de compuestos. El proceso
es muy parecido a la cromatografía de papel con la superioridad de que se desenvuelve
más rápidamente, da mejores separaciones y se puede elegir entre distintos adsorbentes.
Otro punto de importancia es que TLC es una técnica modelo en los laboratorios de
química Biorgánica.
La cromatografía de adsorción en columna (CC) es una técnica de purificación, ya que
permite encerrar los compuestos requeridos de cierta mezcla. La CC, usa una columna de
vidrio de forma vertical que se va rellenando con la fase estacionaria, algunos de los más
utilizados son el gel de sílice y alúmina. Además, la muestra que se va a separar se
coloca en la parte superior del soporte utilizado. No hay que olvidar, que el resto de la
columna se rellena con el disolvente que forma la fase móvil, también, por consecuencia
de la gravedad, se mueve la muestra a través de la columna. Por último, se crea un
equilibrio entre el soluto que fue adsorbido en la fase estacionaria y el disolvente que
constituye la fase móvil, la cual fluye por la columna (Rodríguez, V., & Alexander, A.2020).
El Rf es el factor de retardo, este mide la movilidad relativa de cada uno de los
componentes, con respecto al máximo posible y la distancia recorrida por el frente de fase
móvil.
El factor de retardo es el cociente de la distancia (b) recorrida por el centro de la mancha
y la distancia (A) recorrida simultáneamente por la fase móvil y estos se utilizan en
cromatografía planar, de la siguiente manera, Componente 1: Rf = a / A, Componente 2:
Rf = b / A, donde a es la distancia del punto de inicio al punto de muestra y b es la
distancia del punto de inicio al punto de referencia.
Los pigmentos fotosintéticos presentes en las espicas son la clorofila A, que es el que se
encuentra presente en plantas y algas. Estas son el tipo de clorofilas con mayor
distribución. Y es un pigmento con un color verdoso, que captura la energía de la luz
proveniente del sol y de esta manera produce alimentos en fotoautótrofos. Por otro lado,
está la clorofila B, al igual que el A también se encuentra en plantas y algas verdes.
Además, ayuda a la clorofila A al recolectar la energía y transferirla. Parecido a la clorofila
A, es un pigmento verdoso. Además, la estructura de la clorofila A es similar a la B.
Luego, están los carotenos que son pigmentos fotosintéticos de color amarillo de suma
importancia para la fotosíntesis, además de ser los responsables de darle el color a la
espinaca.
Por otro lado, están las xantofilas que son una familia de compuestos, derivados de los
carotenos con átomos de oxígeno en la estructura y que en la hoja de espinaca se
encuentran en menor proporción.
La fase móvil se trata de un fluido que puede ser líquido, gas o fluido supercrítico, este es
utilizado como cargador de la mezcla, la cual, se pasa a través de la columna
cromatográfica y posteriormente a la fase estacionaria. Es importante también, que la fase
física de la fase móvil podrá establecer la primera división de los métodos
cromatográficos. En particularidad, algunos tipos de fluidos pueden ser utilizado como la
fase móvil. Luego, está la fase estacionaria, que es el material que se guarda por dentro
de la columna cromatográfica durante el proceso de cromatografía y que estanca cierto
compuesto de la muestra utilizada, además, tiene una gran área en cuanto a la superficie
y puede ser un sólido o un líquido preparado encima de un sólido que actúa como un
soporte.
Por último, no hay que olvidar que cuando la fase estacionaria es sólida, no se presentan
problemas conceptuales, ya que se entiende de esta forma que una fase móvil, puede
moverse, a través de una fase sólida porosa.
Materiales
1 matraz Erlenmeyer
1 probeta
1 vaso de precipitados 100 mL
1 vaso de precipitados 250 mL
Agua destilada
5 tubos capilares
Espátula
1 pinzas
Regla
1 pipetas Pasteur de plástico
Tanque cromatográfico
Placas cromatográficas
Columnas cromatográficas
Etanol
Sustancias reveladoras (Vainillina o Anisaldehído)
Método y procedimiento
1. cromatografía de capa fina
Para la obtención y separación de los pigmentos fotosintéticos se lleva a cabo la
cromatografía en papel siguiendo esta metodología:
1. Colocar tiras de papel filtro y colocarlas dentro del vaso donde se encuentra la
muestra vegetal (aquí el papel filtro es la fase estacionaria)
2. Esperar de 15 a 30 minutos para que los pigmentos asciendan por el papel para
su posterior separación.
3. Se retira la placa y se marca el punto alcanzado por la fase móvil y se secan con
aire caliente (se puede usar un secador)
4. Observar los diferentes colores correspondientes a los pigmentos presentes en la
hoja de espinaca
2. cromatografía de columna
Preparación de la columna:
Preparar una suspensión con 15 g de alúmina activada y etanol al 96% (aprox. 20
ml). Comprobar que la llave de la columna está cerrada añadir la suspensión de
alúmina activada en etanol al 96%. Golpear suavemente, con un tubo de goma o
con el dedo, las paredes externas de la columna para favorecer la eliminación de
las burbujas de aire que se puedan haber formado.
Abrir la llave de la columna y dejar fluir lentamente el etanol
hasta que la altura de éste quede 2 mm por encima de la alúmina. Durante esta
elución inicial la alúmina sedimenta y, al finalizar la elución, debe presentar un
aspecto uniforme y una superficie lisa y perpendicular al eje longitudinal de la
columna.
El etanol que se obtiene de la columna durante esta parte del proceso
se puede reutilizar. NOTA: a lo largo del proceso cromatográfico la columna
nunca debe “secarse”, es decir, la fase estacionaria debe encontrarse en todo
momento cubierto por la fase móvil, ya que de lo contrario la fase estacionaria se
contraería y agrietaría.
Siembra de la muestra:
Una vez compactada la columna se procederá a “sembrar”, depositar, 1 ml de la
muestra sobre la superficie de la alúmina con la ayuda de una pipeta. Finalizada la
adición de la muestra se abre la llave de la columna y se eluye hasta que la
muestra sea adsorbida y el nivel del líquido quede aproximadamente 1 mm por
encima de la superficie del adsorbente. Si la pared interna de la columna se ha
manchado con la muestra al depositarla, se lava dejando gotear por ella un poco
del eluyente (con la ayuda de la pipeta) y se eluye de nuevo hasta que el nivel del
líquido vuelva a quedar 1 mm por encima de la superficie del adsorbente.
Finalmente se añade 1 ml de etanol y se eluye de nuevo hasta que el nivel del
líquido vuelva a quedar 1 mm por encima de la superficie del adsorbente.
Desarrollo/Elución de la columna:
Adicionar, con la ayuda de una pipeta Pasteur y lentamente, 10 ml de etanol en la
parte superior libre de la columna y abrir la llave para permitir el flujo del etanol a
través de la alúmina. A medida que evoluciona el cromatograma se observa que el
azul de metileno eluye a lo largo de la columna, formando una banda de color azul
bien diferenciada que se desplaza hacia la parte inferior de la misma, mientras que
el naranja de metilo queda retenido en la parte superior. Si es necesario se
añadirá más etanol a la columna durante el proceso de elución. Cuando el azul de
metileno esté próximo a la salida de la columna se procederá a recoger fracciones
en matraces Erlenmeyer numerados de forma consecutiva, hasta que todo el
producto se haya recogido y el etanol no presente coloración azul.
Dejar fluir el etanol a través de la columna hasta que la altura de éste quede 2 cm
por encima de la alúmina y llenar la parte superior libre de la columna de agua
destilada (“cambio de eluyente”), con la ayuda de una pipeta Pasteur y
lentamente. Abrir la llave de la columna y dejar fluir el agua a través de la alúmina.
A medida que evoluciona el cromatograma se observa que el naranja de metilo
eluye a lo largo de la columna, formando una banda de color naranja bien
diferenciada que se desplaza hacia la parte inferior de la misma. Cuando el
naranja de metilo esté próximo a la salida de la columna se procederá a la
recolección de fracciones siguiendo un procedimiento análogo al anterior para el
azul de metileno, hasta que el agua no presente coloración.
Referencias
Vallejo-Rosero, Y.; Barrios-Correa, L. y Anaya-Gil, J. (2021). La cromatografía en
capa fina: una alternativa vigente en la industria farmacéutica. Revista de Química,
35(2), 19-25. http://revistas.pucp.edu.pe/index.php/quimica/article/view/23788
