MARCADORES
MOLECULARES
Frecuencias de recombinación
Grupos de ligamiento
Corresponden a cromosomas
Análisis citogenético
Técnicas moleculares
Suministró sondas moleculares
Detectan sitios de ADN de variación neutra
Cambios en un solo pb
Número de veces que se repiten tramos específicos ADN
Polimorfismos moleculares
Un par de cromosomas homólogos difiere en un sitio de variación neutra
en ese locus heterocigótico
Marcador Molecular
Segrega y recombina
DNA y Cromosomas
• La principal
estructura
autoreplicable de
DNA que es
distribuida a las
células hijas con la
replicación.
The National Health Museum: [Link]/
The Chromosome
Esquema Foto profase
Gen, locus y alelo
• Gen- Región de DNA
necesaria para
codificar un producto
funcional (DNA o RNA)
• Locus-Cualquier
región específica en
un cromosoma
• Alelo - Una variante de
secuencia de DNA
The National Health Museum: [Link]/
¿Qué es un marcador molecular?
Secuencias específicas en el genoma
Si un marcador molecular se comporta según
las leyes de Mendel MARCADOR GENÉTICO
TIPOS DE MARCADORES M.M.
• Isoenzimas
• RFLP
• VNTR o Minisatélites
• RAPD
• SCARS
• AFLPs
• Microsatélites
• SNP
FUNCIÒN DE LOS M. M.
IDENTIFICAN POLIMORFISMOS EN EL ADN
ENTRE ESPECIES O INDIVIDUOS
LOS POLIMORFISMOS SE ORIGINAN POR
MUTACIONES OCURRIDAS SEGÚN LA
HISTORIA EVOLUTIVA DE LAS ESPECIES
USOS DE LOS M. M.
• SE PUEDE HACER ESTUDIOS EVOLUTIVOS
• DETERMINAR EL ORIGEN GEOGRÀFICO DE LAS
ESPECIES.
• DETRMINACIÓN DE PATERNIDAD
• IDENTIFICACIÓN VARIETAL
• ANÀLISIS DE VARIABILIDAD
PROCESO DE DETECCION DE
POLIMORFISMOS EN EL ADN
• Extracción de ADN
• Análisis del ADN con:
– Enzimas de restricción
– PCR
• Electroforesis y Análisis de datos
EXTRACCIÓN DE ADN
Rotura mecánica (mortero)
Buffer de extracción CTAB 2x o SDS
Tubo eppendorf de 1.5 mL
Incubar a 62oC
Agregar cloroformo-alcohol isoamílico (24:1)
Centrifugar a 13000 rpm
Transferir el sobrenadante
Agregar isopropanol frío para condensar el
ADN
Trasferir el ADN
Lavar el ADN con etanol al 75%
Re-suspender el DNA en 50 µL de TE
(Tris EDTA).
NanoDrop 2000
Tubos de PCR
Tubos de PCR
Agua hasta completar 10 µL
ADN molde
Taq Polimerasa
Buffer de PCR 10 X
Cloruro de Mg
Cebadores
dNTPs
TERMOCICLADOR DE GRADIENTE
PCR
• PCR
PCR
ELECTROFORESIS EN
GEL
ELECTROFORESIS
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9101112
PREPARACIÓN DEL GEL DE AGAROSA
Buffer de corrido TBE 1X
Dispensado del gel de agarosa
Cat
Colocar buffer de corrido y
las muestras
An Cat
Buffer de corrido TBE
Cámara y fuente de poder
Cámara de electroforesis
Corrido de las muestras de ADN
Foto del gel en transiluminador
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Plantas
LUZ UV DE 300 – 400 nm
Pruebas de paternidad
Cartoon sobre pruebas de paternidad
Marcadores Moleculares
Develan:
• Polimorfismos detectados en el DNA del núcleo y
organelos
Ventajas:
• No sujetos a la influencia del medio ambiente
• Potencialmente de número ilimitado
• Objetivo: medir la variación
• La mayor desventaja es la necesidad de equipo
técnicamente más complejo
Isoenzimas
• Loci codifican enzimas funcionales
• Variación proviene de mutaciones
puntuales
• Detectable por electroforesis de proteina;
variantes difieren por la carga
DETECCIÓN DE MARCADORES
ISOENZIMÁTICOS
. Extracción de proteínas del tejido vegetal
. Separación a través de electroforesis
. Coloración histoquímica del gel
Extracción de proteínas del tejido vegetal
• Identificación del tejido adecuado
• Macerar en presencia de un tampón adecuado que
permita:
a. La extracción de las proteínas
b. Mantenimiento de su actividad catalítica
c. Prevenir la oxidación (compuestos fenólicos).
Separación a través de electroforesis
• Geles de almidón, poliacrilamida etc.
• Se usan diversos sistemas tampón de acuerdo:
a. Sistema enzimático
b. Especie vegetal
c. Tipo de tejido
Coloración histoquímica del gel
• Específica, que proporcione un sustrato para las enzimas.
• El patrón de bandas observado se conoce como
(zimograma).
Intermediario (Phenazine Methosulfate)
Colorante (azul de metiltiazolil) al ser
reducido
Isoenzimas
ABCDEFGHIJKLMNSTUVWXYZ......
Aconitasa: dos loci, cada uno con dos aleleos activos
Ventajas
• Permite realizar inferencias genéticas directamente
de los patrones de bandas.
• Amplia información genética para diversas
aplicaciones
• Técnica relativamente barata
• Técnicamente accesible
• Análisis de varios loci rápida y simultáneamente
• Electroforesis en gel de almidón permite cortar
hasta 6 veces.
• Los alelos son codominantes
Restriction Fragment Length
Polymorphism (RFLP)
• Digestión de DNA genómico con enzimas
de restricción
• Variación resulta de inserciones,
deleciones o mutación en la secuencia
de la enzima.
• Detectada por diferencia de tamaño en
electroforesis
Enzimas de restricción
Origen del polimorfismo en RFLP
Plantas Sitio de sonda
restricción
Secuencia de ADN Auto radiografía
homóloga a la sonda
1
1 2 3 4 5 6
2
3
inserción
6
deleción
RFLP
gel agarosa: transferencia
separación de del ADN a
extracción de digestión total fragmentos membrana de
ADN
nitrocelulosa
hibridación con
sonda
radioactiva
AUTORRADIOGRAFIA
RFLP
• El polimorfismo de los RFLP se debe a que el
ADN de individuos genéticamente distintos
difiere en la secuencia de nucleótidos a lo
largo de la cadena.
• Obtención de sondas para la detección de
marcadores RFLP.
• Objetivo es seleccionar los clones de copia
única.
• Poseen expresión codominante (un locus).
RFLP
• Cubre todo el genoma del orgnanismo en estudio.
• Presentan variación genética en la secuencia de
nucleótidos de regiones que codifican productos genéticos,
en menor escala en regiones no transcritas.
• Las bibliotecas de sondas están disponibles: maíz, tomate,
arroz, trigo, soja, poroto, papa y coles, entre otros.
• Sondas heterólogas, es decir, aquellas derivadas de
especies del mismo género o de géneros afines.
Minisatélites o VNTR (Variable Number
of Tandem Repeats)
• Marcadores vasados en loci hipervariables.
• Se basa en secuencias repetidas de ADN.
Ejemplos:
• Drosophila: 30 %
• Tabaco: 70 %
• Arroz: 50 %
• Ofrecen la posibilidad de realizar el muestreo
simultáneo de un gran número de loci genéticos
polimórficos dispersos en el genoma.
Minisatélites o VNTR
• Estas secuencias poseen de 15 a 100 pb. y se
repiten hasta 50 veces en un locus
hipervariable.
• Las secuencias repetitivas forman un nódulo
satélite distinto al nódulo principal de ADN
genómico en la separación del ADN en
gradientes de Cloruro de Cesio, por contener
una proporción diferente de pares de bases G-
C.
Detección
• Esencialmente el mismo utilizado para RFLP.
• Cuando la enzima de restricción corta las
secuencias adyacentes a un locus
hipervariable, la longitud de los fragmentos de
restricción varía en diferentes individuos
según el número de repeticiones de los
minisatélites.
VNTRs
=CTAGCAAATTCATTACA
Auto radiografía
1 2 3 4 5 6 7 Sitio de
restricció
n A1A1 A1A2 A2A2 A2A3
Genotipo A1A1 1 2 3 4 5 6 7
1 2 3 4 5 6 7
Genotipo A1A2 1 2 3 4 5
1 2 3 4 5
Genotipo A2A2 1 2 3 4 5
1 2 3 4 5
Genotipo A2A3 1 2 3
USOS
• Programas de mejoramiento de plantas
• Identificación de variedades, cultivares y clones.
• Análisis de diversidad
• Determinación de paternidad
• Seguimiento y control de introgresión de genes en
programas de mejoramiento.
• Debido a su base genética y distribución peculiar en
el genoma, dificulta su uso en el mapeo genético.
• Seguimiento y control de introgresiones de genes
Diferencia básica entre los marcadores
RFLP y VNTR
• Sondas homólogas a secuencias únicas en el
genoma.
• Sondas constituidas por secuencias núcleo
(core sequence), homólogas a las secuencias
repetidas de los minisatélites.
• En vez de obtener un patrón simple de bandas
que contenga una banda en los homocigotos y
dos en los heterocigotos, se observa un patrón
complejo con múltiples bandas.
VNTR
• Algunas sondas pueden ser utilizadas en un
gran espectro de organismos, desde virus
hasta plantas y mamíferos.
• Fago M13 con una secuencia repetida de 15
pb. usada como sonda en seres humanos,
otros mamíferos, plantas.
VNTR
• Además del polimorfismo de la longitud de los
fragmentos de restricción en cada locus
hipervariable.
• El polimorfismo en el número y distribución
de estos loci a lo largo del genoma.
• El complejo modelo de bandas producido
corresponde a todos los loci hipervariables
detectados (entre 10 a 40 bandas
discernibles).
Genetic fingerpint
VNTR
Complejidad del perfil de bandas
• Imposible identificar las bandas (alelos)
correspondientes a cada locus.
• Identificar individuos
• Verificación de paternidad
• No para la elaboración de mapas genéticos o
pruebas de ligamiento genético entre
marcadores y genes de interés.
Random Amplified Polymorphic
DNA (RAPD)
• Segmentos de DNA amplificados con
primers cortos, no-specíficos
• Variación debida a inserciones,
deleciones o mutaciones en la secuencia
complementaria al primer
• Detección basada en presencia o
ausencia de una banda en electroforesis
Aplicaciones
• Fingerprints genómicos de individuos, variedades
y poblaciones.
• Análisis de la estructura y diversidad genética en:
poblaciones naturales, de mejoramiento y bancos
de germoplasma.
• Establecimiento de relaciones filogenéticas entre
diferentes especies.
• Construcción de mapas genéticos de alta
cobertura genómica y la localización de genes de
interés económico.
Base genética de RAPD
Amplificación de ADN anónimo con
iniciadores de secuencia arbitraria
RAPDs
1 2
1
2
RAPD
A B C D E F G H I J KL M
Región amplificada caracterizada
por una secuencia (SCAR)
• Los SCAR aprovechan una banda que ha sido
generada en un experimento de RAPD
• Usan cebadores de16 a 24 pb, diseñados a
partir de los extremos de marcadores RAPD
clonados
• Esta técnica transforma una banda —propensa
a dificultades de interpretación o de
reproducibilidad— en un marcador muy
confiable
Diagrama del procedimiento para
obtener los SCAR
Ventajas y desventajas
• Ventajas:
– Patrones más sencillos que los RAPD
– Ensayo sólido gracias al uso de cebadores
largos específicos
– Herencia mendeliana. A veces convertibles a
marcadores codominantes
• Desventajas:
– Requieren un conocimiento mínimo de las
secuencias
– Requieren esfuerzo y gastos para diseñar
cebadores específicos de cada locus
Microsatélites o SSR
• Secuencias repetidas en tandem en
unidades de una a cinco pares de bases
• La variación se origina por patinaje de
hebra durante la replicación así como por
inserción al azar y deleción
• Detección por diferencia en el tamaño de
bandas electroforéticas.
Estructura
Selección de los cebadores
Microsatélites
Los microsatélites Pueden estar como?
– Homocigotos
…CGTAGCCTTGCATCCTTCTCTCTCTCTCTCTATCGGTACTACGTGG…
…CGTAGCCTTGCATCCTTCTCTCTCTCTCTCTATCGGTACTACGTGG…
5’ región flanqueante locus microsatélite 3’ región flanqueante
– Heterocigotos
…CGTAGCCTTGCATCCTTCTCTCTCTCTCTCT ATCGGTACTACGTGG…
…CGTAGCCTTGCATCCTTCTCTCTCTCTCTCTCTCTATCGGTACTACGTGG…
Microsatélites
Microsatélites
Cómo mutan los microsatélites?
– Patinaje de la polimerasa (replicación)
– Crossing over desigual durante meiosis
Microsatélites
Aplicaciones
• Forense
• Diagnóstico e identificación de
enfermedades Humanas
• Genética de Poblaciones
• Biología de Conservation
• Mapas genéticos, de ligamiento y físicos}
Microsatélites
Ventajas
• Relativamente fácil de usar
• Altos niveles de precisión
• Altos niveles de polimorfismo
• Altamente informativos
Strand Slippage & Mutation
[Link]
Ejemplos de aplicaciones de los
SSR
• Genotipificación de individuos
• Evaluación de germoplasma
• Diversidad genética
• Cartografía de genomas
• Estudios filogenéticos
• Estudios evolutivos
AFLP
Amplified
Fragment
lenght
polymorphism
Bandas de AFLP
AFLP
Ventajas de los AFLPs
• Rápido scan del genoma por
polimorfismos debido al gran úmero de
bandas generadas por cada marcador
• Produce un fingerprint altamente
informativo
• Son también altamente reproducibles
• No requiere información previa sobre la
secuencia o sonda
• Extremedamnte útil para crear mapas
genéticos “Transcript profiling”
Desventajas de los AFLPs
• Generan grandes cantidades de información,
que pueden requerir análisis automatizados
y por tanto tecnología computacional.
• Son marcadores dominantes
• Bajo contenido de información genética por
locus, se agrupan en los centrómeros y
telómeros
• Son técnicamente demandantes en el
laboratorio y, especialmente, en el análisis de
datos.
Aplicaciones
• Determinación de la variabilidad
• Análisis de distancias genéticas
• Fingerprinting
• Analisis de colecciones
• Mapeo genómico
• Monitoreo de marcadores de
diagnóstico
Single Nucleotide
Polymorphism (SNP)
• Mutaciones de nucleótidos individuales en
DNA genómico
• Variación se origina por error de polymerasa o
transformación de nucleótido
• Se detecta por PCR, hibridación, formación de
heteroduplex
Secuenciación
Secuenciación
Secuenciación
Secuenciación
Secuenciación de ADN
Secuenciación de segunda generación o S. paralela
masiva
Moléculas de ADN 109
Plataformas (100 pb)
Enorme número de copias de cada cadena de ADN
leída simultáneamente.
A medida que son incorporados por las polimerasas, en
tiempo real
