HUMANA

CA
BIO UÍMI

- F
QB II
MED -
Q

CÁTEDRA 1
UB
.

A - DPTO

SEMINARIO
BIOLOGÍA
MOLECULAR

MATERIA: QUÍMICA BIOLÓGICA II

CÁTEDRA 1
DPTO. BIOQUÍMICA HUMANA
FMED - UBA
 DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA HUMANA
CÁTEDRA 1 - QUÍMICA BIOLÓGICA - CICLO LECTIVO 2024

SEMINARIO
BIOLOGÍA MOLECULAR
Herramientas, técnicas y aplicaciones en medicina

Objetivos de aprendizaje

• Que el alumno conozca y se familiarice con los principios básicos de la biología molecular.
• Que el alumno conozca los fundamentos de las técnicas de rutina de biología molecular.
• Que el alumno comprenda la importancia de la aplicación de técnicas de Biología Molecular
en el diagnóstico clínico.

Introducción
La biología molecular, entendida como el área de estudio de las moléculas de ácido
desoxirribonucleico (ADN) y de ácido ribonucleico (ARN), es un campo que vincula diferentes
aproximaciones en el funcionamiento de cualquier organismo vivo. Los procesos patogénicos en el
ser humano son la más clara evidencia del rol central del ADN y ARN en enfermedades de base
genética como las producidas por deficiencias enzimáticas descriptas en las clases anteriores (por
ejemplo, deficiencia de glucosa-6-P-deshidrogenasa, glucosa-6-fosfatasa, piruvato quinasa,
carnitina-palmitoil transferasa, acil-CoA deshidrogenasas, etc.) y otras enfermedades no
mencionadas en este curso como la fibrosis quística, la hemofilia, la enfermedad de Huntington y
algunos tipos de cáncer de origen genético. También es posible encontrar una participación limitada
en trastornos multifactoriales como la diabetes, la enfermedad cardíaca, la obesidad, entre otras.
En este seminario se resumen algunas de las principales herramientas y técnicas de biología
molecular y su aplicación en la medicina, describiendo los conceptos básicos más importantes para
el área de la salud, que faciliten la comprensión del uso de estas herramientas en la práctica médica
cotidiana y la utilidad clínica de las pruebas de laboratorio moleculares en la prevención, el
diagnóstico y el tratamiento de diversas enfermedades.

-Transcripción reversa

La cuantificación e identificación de los ARN mensajeros presentes en ciertas células o

tejidos es una forma indirecta de determinar las proteínas expresadas en los mismos. Para esto, se
purifica el ARN del sistema en estudio y se utiliza una enzima que sólo se encuentra en ciertos virus:
la transcriptasa reversa. Para esta reacción se necesitan moléculas de ARN que son el molde, la
enzima transcriptasa reversa (RT), un cebador o primer (oligonucleótido de ADN complementario a
una parte de la secuencia de las moléculas de ARN), y desoxirribonucleótidos (dATP, dTTP, dGTP,
dCTP). Utilizando los ARN mensajeros como molde, la enzima produce una copia de ADN (ADNc)
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a partir del ARN. El ADN producido por la transcriptasa reversa, debido a que usa ARNm maduro
como templado, no contiene intrones (Figura 1).

Figura 1: Transcripción reversa

El ARN mensajero purificado de la muestra es utilizado para la síntesis de la primera cadena de
ADN copia mediante Transcripción Reversa. En este proceso es necesario el ARN purificado
(molde), la enzima Transcriptasa Reversa, cebadores de DNA (primers), desoxirribonucleótidos
(dNTPs: dATP, dGTP, dCTP, dTTP) y buffers. El cebador se une a la cadena de RNA, y mediante
la actividad de la Transcriptasa Reversa se extiende una cadena ADN copia, resultando una
molécula híbrida. Finalmente se obtiene el ADN copia que no contiene intrones.

- Reacción en Cadena de la Polimerasa (Polymerase Chain Reaction, PCR)

En 1984, Kary Mullis ideó un ingenioso método para amplificar secuencias específicas de
ADN que se denomina Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Mediante esta técnica se
puede amplificar un segmento específico de ADN hasta millones de veces en pocas horas in vitro,
si se conocen las secuencias colindantes (flanqueantes) a esta secuencia blanco.
La PCR se lleva a cabo mezclando en un tubo
a) muestra conteniendo el ADN de interés,
b) oligonucleótidos (de entre 20 y 30 nucleótidos) que actuarán como cebadores (o primers)
uniéndose específicamente a las secuencias flanqueantes a la secuencia blanco,

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c) los cuatro desoxirribonucleótidos (dNTPs),

d) un buffer de pH 7,4,
e) ADN polimerasa termoestable al calor.

Se realizan replicaciones sucesivas repitiendo tres pasos en cada ciclo, utilizando un equipo
programable denominado termociclador. El termociclador es un aparato con capacidad para
calentar y enfriar rápidamente las mezclas de reacción, de modo que se aprovechen las cualidades
fisicoquímicas de los ácidos nucleicos y las enzimáticas de la ADN polimerasa.
Cada ciclo es la repetición de los siguientes 3 pasos:
a) Desnaturalización de la doble hélice de ADN: las dos hebras de la molécula de ADN
original se separan mediante calentamiento de la solución a 95ºC durante 15 segundos.
b) Hibridación de los cebadores: La solución se enfría rápidamente a una temperatura
entre 50º y 60ºC que es generalmente la temperatura a la cual cada cebador se une con
una hebra de ADN desapareada. Un cebador hibrida con el extremo 3’ de la secuencia
blanco en una hebra y el otro cebador hibrida con el extremo 3’ de la secuencia en la
hebra complementaria. No se formará nuevamente el ADN doble hebra inicial porque
los cebadores están presentes en exceso.
c) Síntesis de ADN: Se utiliza una enzima termoestable (Taq polimerasa) proveniente de
una bacteria termófila (Thermus aquaticus) que tiene temperatura óptima de acción
alrededor de 70ºC y es resistente a temperaturas extremas. La Taq polimerasa cataliza
la elongación de ambos cebadores copiando la secuencia blanco.

Estos tres pasos constituyen un ciclo de PCR, que se repite consecutivamente varias veces.
Cada ciclo de PCR duplica la cantidad de ADN, por lo que finalmente se produce un aumento de 2n
de la cantidad de ADN original, siendo n el número de ciclos que se llevan a cabo. La amplificación
es de un millón de veces después de 20 ciclos y de mil millones de veces después de 30 ciclos, los
cuales se pueden llevar a cabo en menos de una hora (Figura 2).
Los productos de PCR obtenidos al final de la reacción son analizados mediante una
electroforesis en gel. El ADN que ha sido amplificado por la reacción en cadena de la polimerasa,
migra en una región del gel de acuerdo con la cantidad de pares de bases (tamaño) que tiene la
secuencia, y es acumulada en una banda que se ubica en paralelo a una de las bandas de tamaño
determinado de un patrón comercial que contiene ADN de diferentes longitudes y que es corrido de
forma simultánea con la muestra; esto, permite determinar el tamaño de la secuencia estudiada en
pares de bases.

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Se denomina RT-PCR, a la técnica que consiste en primero realizar transcripción reversa

utilizando una muestra de ARN y luego utilizar el ADN obtenido de esta reacción como templado de
una reacción de PCR. Este procedimiento es utilizado ampliamente en el diagnóstico clínico, por
ejemplo, para detectar y cuantificar virus con genoma de ARN en una muestra humana.

La PCR en tiempo real (del inglés real time PCR) es una modalidad de PCR donde la
acumulación de ADN amplificado es detectado y cuantificado a medida que la reacción avanza, es
decir, “en tiempo real”. Esto se logra incorporando una molécula fluorescente que se asocia al ADN
amplificado. Así, el incremento de esta fluorescencia es proporcional al incremento de la cantidad
de moléculas de ADN amplificadas en la reacción.

Figura 2: Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

A: Esquema de los pasos de la reacción de la PCR. B: Cada ciclo de PCR duplica la cantidad de
ADN, por lo que finalmente se produce un aumento de 2n de la cantidad de ADN original

Aplicaciones: La PCR permite amplificar una secuencia de ADN presente en una proporción
muy pequeña del ADN total de una muestra. Es una técnica muy sensible, se puede amplificar y
detectar una única molécula de ADN, aportando una información muy valiosa en medicina. Además,
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la PCR es una herramienta esencial para la toma de decisiones en todas las etapas de la atención
del paciente: la evaluación del riesgo, la detección, el diagnóstico, la estadificación y el pronóstico,
la selección de la terapia, y el seguimiento en diferentes enfermedades. A continuación, se
describen algunos ejemplos:

• Detección de bacterias y virus: mediante PCR se puede detectar la presencia de bacterias

y virus en estadios tempranos de la infección o en estado latente. En estos casos, los
individuos infectados no han desarrollado todavía respuesta inmune a dichos patógenos, por
lo cual no puede detectarse la infección determinando la presencia de los anticuerpos.
Entonces, se recurre a la detección del agente patógeno empleando primers o cebadores
complementarios a una parte del genoma del agente infeccioso. Aún unas pocas copias
originales de una bacteria o virus en la muestra del paciente pueden detectarse luego de la
amplificación. Se aplica, por ejemplo, en la detección del virus Sars-Cov-2 (utilizando la RT-
PCR en tiempo real), en la detección de los virus de la hepatitis B (HBV) y C (HCV) y el de
inmunodeficiencia humano (HIV). La búsqueda de microorganismos en muestras de tejido
puede ser muy lenta y laboriosa, pero con la PCR se puede detectar la presencia de solo 10
de estos microorganismos por cada millón de células humanas.
• Seguimiento de enfermedades: los métodos moleculares cuantitativos se han convertido en
una ayuda imprescindible para el seguimiento en respuesta a la terapia, especialmente en
pacientes infectados con el virus de inmunodeficiencia humana (VIH), el virus de la hepatitis
B y el virus de la hepatitis C.
• Colaboración con la medicina forense en variados aspectos, por ejemplo, la identificación de
personas permitiendo el reconocimiento de cadáveres o parentescos biológicos en casos de
disputa de paternidad.
• Establecimiento de grupos tisulares precisos en transplantes, amplificando y comparando
secuencias de los HLA del donante y receptor para determinar compatibilidades.
• Estudio de relaciones evolutivas entre los organismos, ya que bajo ciertas circunstancias el
ADN puede mantenerse intacto durante miles de años o incluso más tiempo.

Nota: En el siguiente enlace se puede ver una animación sobre la técnica de PCR:
https://www.dnalc.org/resources/animations/pcr.html

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- Secuenciación de ADN

La secuenciación de ADN consiste en la determinación del orden de los nucleótidos (A, C,

G y T) en una molécula de ADN, lo cual resulta útil en la investigación básica de los procesos
biológicos fundamentales, así como en campos aplicados, como el diagnóstico de enfermedades
hereditarias y la investigación forense.
La secuencia provee la clase de información genética que se transporta en un segmento
específico de ADN. Por ejemplo, se puede usar la información de las secuencias para determinar
qué tramos de ADN contienen genes y qué tramos transportan instrucciones regulatorias, que
activan o desactivan genes. Además, los datos de las secuencias pueden resaltar los cambios en
un gen que pueden causar enfermedades. El desarrollo de la secuenciación del ADN ha acelerado
significativamente la investigación y los descubrimientos en biología.
La mayoría de los métodos de secuenciación que se utilizan actualmente se basan en el
método originalmente desarrollado por Sanger en el año 1977. El principio clave del método
clásico de terminación de la cadena o método de Sanger es el uso de didesoxinucleótidos
trifosfato (ddNTPs) como terminadores de la cadena de ADN. Estos ddNTPs terminan la elongación
de la cadena al carecer del grupo 3'-OH del azúcar que se necesita para la formación del enlace
fosfodiéster entre dos nucleótidos durante la elongación de la cadena de ADN. En estas condiciones
de elongación, se generan moléculas de ADN simple cadena que difieren en longitud en apenas un
nucleótido y que pueden separarse unas de otras por electroforesis en gel de poliacrilamida.
Este método requiere una hebra molde de ADN simple cadena, un cebador o primer de ADN,
una ADN polimerasa, dNTPs y los ddNTPs que terminan la elongación de la cadena de ADN. Los
ddNTPs se agregan a la reacción en una cantidad mucho menor que la de los dNTPs. Una
modificación del método original de Sanger es utilizar ddNTPs terminadores de la cadena marcados
fluorescentemente. Este método es conocido como secuenciación por terminador fluorescente
y utiliza cada uno de los cuatro ddNTPs que terminan la cadena marcado con un fluoróforo de
diferente color.
La reacción de secuenciación se realiza con la muestra de ADN a secuenciar, la ADN
polimerasa, los cuatro desoxinucleótidos estándar (dATP, dGTP, dCTP Y dTTP), y los cuatro
ddNTPs cada uno marcado con un fluoróforo de distinto color. La ADN polimerasa comienza a
generar los fragmentos de ADN complementarios a la secuencia de ADN molde. La incorporación
de un didesoxinucleótido en la cadena naciente de ADN termina su extensión, lo que produce varios
fragmentos de ADN de longitud variable según la secuencia de la molécula de ADN molde. Los
fragmentos de ADN sintetizados, conteniendo la marca fluorescente según el ddNTP incorporado,
son desnaturalizados por calor y separados por tamaño (con una resolución de un solo nucleótido)
mediante electroforesis. Esta técnica se desarrolla en equipos automatizados que realizan una
separación electroforética capilar y detectan la fluorescencia para determinar la secuencia: un

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sensor detecta el color emitido por cada banda a medida que la electroforesis avanza por lectores
láser y envía los datos a un programa informático que ensambla la secuencia (Figura 3). Esta
automatización de la lectura hace al método atractivo por su gran capacidad y rapidez.
Posteriormente, se desarrollaron los denominados métodos de “Next-generation
sequencing” (NGS) o de alto rendimiento. Estos hicieron la secuenciación genómica más rápida y
de menor costo, permitiendo una aplicación más extensiva de la técnica.
Nota: En los siguientes links se puede ver cómo se realiza el método de secuenciación automática:
https://www.dnalc.org/resources/animations/cycseq.html

Figura 3: Secuenciación de ADN

Esquema como se realiza la secuenciación de ADN por terminador fluorescente. Cada banda en la
electroforesis y pico de color en el registro de la computadora representa un nucleótido en la
secuencia de ADN.

-Enzimas de restricción

Las enzimas o endonucleasas de restricción son enzimas de origen procariota que

reconocen secuencias de bases específicas en el ADN doble hélice (4-8 pares de bases) e
hidrolizan las uniones fosfodiéster en cada hebra de la región reconocida. Por lo general, los

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sitios de corte son secuencias palindrómicas (repetición invertida) y los puntos de corte están
dispuestos simétricamente. La reacción catalizada por estas enzimas puede ocurrir en el centro
mismo de la secuencia reconocida dejando lo que se conoce como extremos “romos” con ADN
doble cadena, o extremos “cohesivos” si el corte ocurre en posiciones diferentes en una hebra y en
la otra del ADN, dejando en este caso una porción de hebra simple cadena (Figura 4).
Las bacterias utilizan la actividad endonucleasa de estas enzimas para eliminar ADN foráneo
que pudiera ingresar a la célula, sin embargo, el ADN propio no se destruye porque los sitios
reconocidos por estas enzimas se encuentran metilados. Se han purificado y caracterizado más de
100 enzimas de restricción, denominadas con una abreviatura de tres letras que se refiere al
organismo hospedador, por ej. Eco de Escherichia coli o Hin de Haemophilus influenzae.

Figura 4: Enzimas de restricción.

Los puntos de corte están indicados por las flechas. El corte con BamHI (izquierda) produce
extremos simple cadena o “cohesivos” y el corte con AluI (derecha) produce extremos doble cadena
o “romos”. En cada hebra, la enzima hidroliza el enlace fosfodiéster en el lado 3’ del eje de simetría.

Aplicación: las enzimas de restricción se utilizan in vitro para “cortar” moléculas de ADN y
proporcionar pequeños fragmentos específicos que se pueden analizar y manipular con más
facilidad que la molécula original. Luego del tratamiento del ADN, la cantidad y la longitud de los
fragmentos obtenidos dependerán de la frecuencia de la secuencia específica para dicha enzima
(si esta secuencia se encuentra varias veces repetida en el ADN, la enzima cortará más veces
generando fragmentos de distintos tamaños).

Nota: En el siguiente enlace se puede ver una animación sobre la forma de acción de una
enzima de restricción https://www.dnalc.org/resources/animations/restriction.html

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-Electroforesis en gel

La electroforesis en gel es una técnica que utiliza un campo eléctrico para separar moléculas
según su tamaño y carga. En el caso de los ácidos nucleicos, tanto el ADN, como el ARN contienen
grupos fosfatos cargados negativamente, por los tanto estas moléculas migrarán hacia el electrodo
positivo (ánodo). Las moléculas más cortas se movilizarán con mayor rapidez por los poros de un
gel que las moléculas más largas, por lo tanto, la separación se basará solo en el tamaño (longitud
de los fragmentos). Para visualizar el ácido nucleico separado se utilizan agentes luminiscentes o
colorantes como el bromuro de etidio, que se intercala en el ADN de doble cadena y genera una
señal lumínica que es directamente proporcional a la cantidad de ácido nucleico presente (Figura
5).
Nota: En el siguiente enlace se puede ver una animación sobre cómo se realiza una
electroforesis en gel de agarosa:
https://www.dnalc.org/resources/animations/gelelectrophoresis.html

Figura 5: Electroforesis de ácidos nucleicos en gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio de
los fragmentos separados

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APLICACIONES DE TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR EN MEDICINA

-Detección de polimorfismos

Un polimorfismo es una variación en la secuencia de un lugar determinado del ADN (locus)

en los cromosomas entre los individuos de una población. Aquellos polimorfismos que afectan a la
secuencia codificante o reguladora y que producen cambios importantes en la estructura de la
proteína o en el mecanismo de regulación de la expresión, pueden traducirse en diferentes fenotipos
(ej: color de los ojos, Rh, histocompatibilidad). Existe otro tipo de polimorfismos, en regiones
codificantes o regiones regulatorias del ADN, estrechamente relacionadas a genes que pueden
estar involucrados en la etiología (causa) de enfermedades heredables. Estas variaciones en el
genoma sirven como base para el uso de técnicas de biología molecular en el diagnóstico de
enfermedades. En la actualidad la secuenciación es el método utilizado para analizar regiones del
ADN, zonas de genes, regiones no codificantes, etc.

Polimorfismos de regiones altamente variables, causados por repetición de secuencias de

ADN

El ADN humano contiene algunas secuencias que están repetidas en tándem (una al lado
de la otra) un número variable de veces en ciertos loci dispersos en el genoma. Esas regiones se
llaman regiones hipervariables, y son polimórficas ya que la secuencia varía en el número de copias
de la unidad que se repite. Existen dos clases de secuencias repetitivas de ADN: los minisatélites
(variable number of tandem repeats, VNTRs) y los microsatélites (short tandem repeats, STRs).
Los VNTRs en humanos son secuencias de 1-5 kb que consisten en un número variable de
unidades repetitivas de 15 a más de 100 pb de longitud en el genoma de diferentes individuos. Se
comparan los patrones generados por muestras de ADN de distinto origen (conocido y
desconocido). La coincidencia entre los patrones indica con alta probabilidad que las muestras
provienen de la misma fuente. El análisis de los VNTRs es aplicable cuando se pueden obtener
muestras de ADN en buenas condiciones y en cantidad abundante.
Los STRs son secuencias repetidas en tándem de entre 2 y 5 nucleótidos, característica que
los diferencia de los VNTRs. El tamaño total de un STR es más pequeño que el de cualquier VNTR.
Los STRs contienen repeticiones más cortas y la secuencia de las regiones flanqueantes a ambos
lados del STR es igual en todos los individuos. (Figura 6). Cientos de sistemas de STRs fueron
mapeados en todo el genoma humano y varios fueron investigados para su aplicación en tests de
identificación de individuos. Pueden ser detectados mediante la amplificación por PCR de los
segmentos del genoma que contienen diferente número de repeticiones, utilizando para ello
cebadores o "primers" que flanqueen los STRs. Luego de la amplificación del ADN, los fragmentos

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se visualizan mediante electroforesis y tinción con Bromuro de etidio o técnicas análogas. Esta
opción se ha vuelto más frecuente con el aumento de información de secuencias en bases de datos
que permiten el diseño de cebadores flanqueantes de STRs. Se analizan principalmente
repeticiones de 4 pb. Dada la enorme variedad de alelos presentes en una población, al examinar
múltiples loci de STRs se puede obtener un alto grado de diferenciación entre individuos.

Figura 6: Esquema de microsatélites o short tándem repeats (STR)

Se muestran las secuencias de cuatro nucleótidos (CAGG, en este ejemplo) repetida en diferentes
cromosomas un número diferente de veces (STR), siendo para el par de cromosomas rojos 7 y 4
veces, para los amarillos 5 veces cada uno, para el par de cromosomas verdes 6 y 4 veces y para
el par de color celeste, 10 y 5 veces. En azul claro tenemos representadas las secuencias
flanqueantes de las STR (GGCCAT). https://forensemolecular.es.tl/strs.htm

Huella genética:
La huella dactilar genética, o huella genética, es un método de aislamiento e identificación
de elementos variables dentro de la secuencia de ADN. La técnica fue desarrollada en 1984 por el
genetista británico Alec Jeffreys, después de descubrir la existencia de los minisatélites. Jeffreys
reconoció que cada individuo tiene un patrón único de minisatélites (las únicas excepciones
son los individuos procedentes del mismo cigoto, como los gemelos idénticos). Ya que la huella
dactilar genética de cada persona es única, es un gran método para identificar a alguien de
forma inequívoca. En la actualidad, la huella genética se realiza mediante el análisis de STRs.
Inicialmente, la huella genética fue utilizada para resolución de delitos y para determinación
de maternidad y paternidad. Luego se utilizó para la identificación de restos humanos,
compatibilidad en la donación de órganos, el estudio de las poblaciones de animales silvestres, y el
establecimiento del origen o la composición de alimentos. Por este método pueden determinarse

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relaciones familiares: individuos que están estrechamente relacionados genéticamente tendrán

patrones de STRs más similares entre sí que comparados con personas no relacionadas.
La técnica también se aplica para aportar evidencia a favor o en contra de sospechosos en
casos policiales. La extrema sensibilidad del método permite utilizar pequeñas cantidades de ADN
humano como evidencia para obtener la huella dactilar de ADN de la persona que la dejó en el
lugar. En estos casos, se comparan las huellas dactilares genéticas de muestras biológicas
obtenidas como evidencia (sangre, semen, tejidos como células del folículo piloso en el extremo de
un único pelo, aún en pequeñas cantidades) con las muestras provenientes de sospechosos. Las
huellas dactilares de ADN resultaron un importante avance en medicina forense.
En Argentina, en el año 1987, fue creado el Banco Nacional de Datos Genéticos (BNDG), el
cual es un archivo sistemático de material genético y muestras biológicas de familiares de personas
que han sido secuestradas y desaparecidas durante la dictadura militar argentina. En estos casos
se utiliza el material genético de una abuela o abuelo, por ejemplo, y de una nieta o nieto y se
analizan los STR localizados en el cromosoma Y (línea paterna) y en las mitocondrias (línea
materna).

-Diagnóstico de enfermedades hereditarias aplicando técnicas de secuenciación

La medicina de precisión es un nuevo concepto que hace referencia a la adaptación del

tratamiento médico a las características individuales de cada paciente. Implica que las decisiones
referentes al tratamiento o la prevención de enfermedades se tomarán sobre la base de la
integración de las características genómicas y moleculares, la información sobre la situación clínica
y los hábitos del paciente.
Por ejemplo, BRCA1 y BRCA2 son genes humanos que producen proteínas supresoras de
tumores. Cuando uno de estos genes está mutado o alterado de forma que la proteína que origina
no se produce o no funciona correctamente, los daños y errores en la transcripción y replicación del
ADN no pueden ser reparados adecuadamente; como resultado, las células están propensas a
desarrollar alteraciones genéticas adicionales que pueden conducir al cáncer. Mutaciones
heredadas específicas en los genes BRCA1 y BRCA2 aumentan el riesgo de cáncer de mama
femenino y de ovario, y se han asociado con un mayor riesgo de varios tipos de cáncer por lo que
su detección temprana permite evaluar el riesgo de un paciente de presentar la enfermedad.
Otro ejemplo es el de la poliposis adenomatosa familiar (PAF), enfermedad autosómica
dominante que se caracteriza por el desarrollo de cientos a miles de adenomas en el colon y el recto
durante la segunda década de la vida. La PAF tiene una incidencia de 1/8300 nacimientos, y se
manifiesta por igual entre ambos sexos. Casi todos los pacientes desarrollan cáncer colorrectal si

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no se identifican y son tratados en una etapa temprana. La enfermedad es causada por mutaciones
en el gen APC, un gen supresor tumoral localizado en el cromosoma 5q21.
Hoy en día, es posible analizar las mutaciones en el gen APC. El método más utilizado
actualmente es la secuenciación directa del gen. La información genética no es solo relevante para
el paciente afectado, sino también para la familia inmediata y sus futuros descendientes. Cuando
se identifica una mutación específica causante de la enfermedad, se debe realizar la prueba
genética a todos los parientes de primer grado. Miembros de la familia con un resultado negativo
para la mutación detectada en el paciente no necesitan más investigación y su seguimiento es el
mismo de la población en general. El diagnóstico precoz a través del análisis de la secuencia del
gen logró extender y mejorar la calidad de vida de estos pacientes. También es relevante el
conocimiento de qué tipo de mutación presentan los pacientes ya que ayuda a predecir la severidad
de la enfermedad, dado que la ubicación de la mutación puede afectar la función de la proteína de
diferente manera.
Secuenciación de nueva generación: La secuenciación de nueva generación (NGS) ha sido
recientemente adaptada para su uso como herramienta de diagnóstico molecular, como por ejemplo
para la caracterización de patógenos, detección de polimorfismos genéticos, diagnóstico de cáncer,
estudio de microbiota, etc. De forma general, las diferentes plataformas de NGS tiene la capacidad
de secuenciar una gran cantidad de material genético en horas a diferencia de los métodos de
secuenciación tradicionales (Sanger) en los que se requerían días a semanas. Las enfermedades
infecciosas y el cáncer son las áreas donde se ha iniciado la implementación de estas herramientas,
principalmente en el estudio de brotes infecciosos y en el diagnóstico de neoplasias,
respectivamente. La NGS entrega una gran cantidad de información, la que debe ser
cuidadosamente analizada por bioinformáticos en conjunto con el equipo médico para enfocar la
búsqueda de lo que se quiere diagnosticar.

-Consejo genético

El consejo genético es el proceso de comunicación en el que se tratan cuestiones médicas,

genéticas y sociológicas asociadas al riesgo de aparición de una enfermedad hereditaria, es decir,
una enfermedad que aparece en los genes de una familia. Con la verificación de la presencia de
genes defectuosos en un individuo, particularmente en familias que se conoce que lo portan, los
consejeros genéticos informan a los pacientes o familiares del riesgo de padecer una enfermedad
hereditaria, de la posibilidad de trasmitirlo a las siguientes generaciones, de las medidas preventivas
o terapéuticas que se pueden realizar y de la posibilidad de realizar un test genético para su
detección. El conocimiento del mapa del genoma humano y los desarrollos tecnológicos hacen
posible detectar alteraciones cromosómicas, enfermedades con transmisión mendeliana, defectos
metabólicos, marcadores de múltiples enfermedades.

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-Microarrays

En los últimos años se desarrolló una técnica que permite la detección de muchos genes al
mismo tiempo con el fin de determinar qué alelos de estos genes están presentes en las muestras
obtenidas de pacientes: los microarrays (también conocidos como biochips). La superficie de un
biochip pequeño se cubre con miles de piezas de DNA de una sola hebra, en donde cada una
corresponde a un gen diferente o un segmento del mismo. Luego, el biochip se incuba con una
muestra del DNA de un paciente y se determina el patrón de hibridación mediante análisis
informático. Los resultados pueden determinar, por ejemplo, cuál de las múltiples mutaciones
conocidas para una enfermedad genética es la que porta el paciente o para determinar qué alelos
de las enzimas que metabolizan un fármaco están presentes y, por lo tanto, la probabilidad de que
un paciente tenga una reacción adversa a un fármaco en particular. Otro uso consiste en determinar
qué genes están expresados en una determinada muestra. El ARN mensajero de una muestra de
tejido se utiliza para producir el ADN copia mediante transcripción reversa, el ADNc hibridará
solamente con aquellos genes que están expresados en el tejido analizado. Por ejemplo, en un
paciente con cáncer esta técnica podrá utilizarse para determinar la clasificación del cáncer con
mucha rapidez y diseñar el tratamiento de forma específica para cada paciente.

Nota: En el siguiente enlace se puede ver una animación sobre los microarrays:
https://www.dnalc.org/resources/animations/dnaarray.html

-Producción de Proteínas Terapéuticas

La ingeniería genética es la utilización de la tecnología del ADN recombinante para alterar

la composición genética de un organismo. El ADN recombinante es una molécula de ADN artificial
formada in vitro por la unión de secuencias de ADN provenientes de dos organismos distintos que
normalmente no se encuentran juntos. La producción de una proteína no presente en un organismo
determinado y producidas a partir de ADN recombinante, se llaman proteínas recombinantes.
Una contribución muy importante de la ingeniería genética a la medicina es haber
desarrollado la habilidad de producir cualquier proteína en cantidades casi ilimitadas, siempre que
se conozca el gen que codifica dicha proteína. Con el desarrollo de métodos que permiten la
transferencia de genes específicos de una célula a otra, y la inducción de la expresión de los mismos
en el nuevo hospedador, la industria farmacéutica ha adquirido una gran potencialidad. Algunas
compañías farmacéuticas producen polipéptidos humanos por bacterias o levaduras.
En el año 1978, gracias al desarrollo de la ingeniería genética, se consiguió la síntesis de la
insulina. El procedimiento se realizó utilizando bacterias Escherichia coli como “fábricas” para
producir de forma separada las cadenas A y B de la insulina humana, introduciendo para ello los

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genes que las codifican en las bacterias mediante un vector. Los vectores (por ejemplo, un plásmido
bacteriano) son moléculas transportadoras que transfieren y replican fragmentos de ADN que llevan
insertados mediante técnicas de ADN recombinante. Posteriormente se llevaba a cabo la
purificación, plegamiento y unión in vitro de las cadenas (mediante la oxidación de las cisteínas para
formar los puentes disulfuro de la proteína activa). El resultado fue una insulina humana, más barata
de producir, potente y segura, ya que no mostraba los problemas que producían las homólogas
animales. Empezó a distribuirse a principios de los años 80 como tratamiento contra la diabetes,
siendo (una vez más) la primera proteína recombinante aprobada como medicamento (Figura 7).
De manera similar, en 1985 se logró desarrollar la hormona de crecimiento recombinante,
empleada para tratar niños con deficiencias de esta hormona (anteriormente era aislada de tejido
de hipófisis de cadáver, cuyo suministro resultaba escaso).
Además, la técnica de ADN recombinante ha permitido la obtención de proteínas antigénicas
de agentes infecciosos para la creación de vacunas. Las vacunas recombinantes contienen
antígenos virales (proteínas). Como carecen de material genético y no pueden replicarse, su
utilización es totalmente segura, sin riesgo de infección por su uso. La primera vacuna obtenida con
esta técnica fue la vacuna contra Hepatitis B en 1986. Hoy en día se encuentran varias vacunas en
desarrollo contra el SARS-Cov-2 utilizando esta técnica.
Además de la insulina y la hormona del crecimiento, se han producido por esta técnica
glucagon, interferón, factores de la coagulación, factor VIII, interleuquinas, anticuerpos
monoclonales, eritropoyetina, etc.

Figura 7: Producción de insulina humana

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-Animales transgénicos

La ingeniería genética permite modificar genéticamente animales y vegetales, con diferentes

aplicaciones, que van desde el mejoramiento de las razas domésticas hasta el empleo de los
animales como fábricas de fármacos. La modificación genética se realiza de dos maneras: 1)
anulando o alterando ciertos genes presentes en un animal de manera que esta modificación se
transmita a la descendencia (transferencia génica por inyección directa de ADN extraño en un cigoto
obtenido por fecundación in vitro) o 2) transfiriendo genes a un animal desde la misma especie o de
una especie diferente.
Los ratones transgénicos constituyeron una herramienta fundamental en el laboratorio para
el estudio de la fisiología animal y sirvieron de modelos experimentales para entender las bases
de muchas enfermedades que afectan al hombre (Figura 8). Luego se desarrolló la tecnología
para hacer los ratones “knockout”, es decir, ratones en los que se anulaba la actividad de un gen
para analizar luego los efectos producidos por esta falta. Esta técnica hoy es muy importante en el
estudio de la función de los genes, tanto en ratones como en otros organismos.

Figura 8: Aproximadamente hace 20 años se creó el primer animal transgénico en un ratón, al

cual se le incorporó a su genoma la hormona de crecimiento por lo que el ratón creció más de lo
normal

Los ratones transgénicos se obtienen por inyección directa del ADN en el pronúcleo del
ovocito fecundado, o bien por transformación de células embrionarias in vitro con el ADN de interés.
En la actualidad, es posible obtener otros animales transgénicos, además de roedores. Los
animales más grandes, como ovejas, cabras, cerdos y vacas pueden modificarse genéticamente
gracias al desarrollo de las técnicas de clonación. Esta aplicación se da especialmente en especies
de interés comercial o agrícola-ganadero (vacas, cerdos, ovejas, caballos). En el área médica, los
animales transgénicos son utilizados en la producción de proteínas recombinantes (granjas
farmacéuticas). En estas granjas farmacéuticas se crían ovejas, cabras, vacas o cerdos
transgénicos que producen en su leche proteínas terapéuticas humanas. Ejemplos: obtención de
eritropoyetina, α1-antitripsina, proteína C, factor VIII de coagulación, antitrombina III, etc.

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-Xenoinjertos

En la medicina personalizada de precisión para el cáncer, se busca utilizar información

específica del tumor de una persona con el fin de facilitar el diagnóstico, planificar el tratamiento o
dar un pronóstico. Los xenoinjertos (en inglés, xenograft) son trasplantes de un órgano, un tejido o
células a un individuo de otra especie, con el fin de probar la eficacia de medicamentos y otros tipos
de tratamientos antes de administrarlos al paciente.
En el caso del estudio de tratamientos contra el cáncer, el tejido tumoral se extrae de un
paciente y se implanta en ratones inmuodeficientes con fines de investigación. Los ratones con
xenoinjertos derivados de pacientes (PDX, del inglés "patient-derived xenograft") se pueden usar
para estudiar cuál podría ser el mejor tratamiento para un determinado paciente. Estos injertos
también se usan en la búsqueda de nuevas drogas contra el cáncer. En la Figura 9 se esquematiza
la generación de los ratones PDX y su utilización.

Figura 9: Generación de ratones PDX Una porción de un tumor de un paciente es implantada en

un ratón (deficiente en su propio sistema inmune). Así el tumor crece en el ratón y puede ser
estudiado de distintas maneras. Se realiza el análisis genómico o la amplificación del mismo en
mayor número de ratones para, por ejemplo, realizar pruebas de distintos tratamientos posibles.
Además, se puede preservar una muestra para el banco de tumores.

Links de interés
Laboratorio virtual para realizar una electroforesis en gel de agarosa:
https://learn.genetics.utah.edu/content/labs/gel/
Laboratorio virtual de PCR: https://learn.genetics.utah.edu/content/labs/pcr/
Laboratorio virtual de Microarray: https://learn.genetics.utah.edu/content/labs/microarray/

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Nuevas estrategias de biología molecular en Medicina

El rápido avance de las técnicas de biología molecular ha permitido el desarrollo de técnicas

prometedoras que aportan una nueva perspectiva para el tratamiento de enfermedades donde las
metodologías convencionales no han tenido éxito.

-Terapia génica
Muchas enfermedades de origen genético se traducen en defectos en la expresión de
proteínas, las cuales son difíciles de administrar o modificar mediante técnicas farmacológicas ya
sea por su tamaño, complejidad o inaccesibilidad celular. Una de las aplicaciones futuras más
promisorias de la genética molecular en el tratamiento de las enfermedades es la implementación
de la terapia génica, la cual puede ser definida como la administración e introducción de material
genético en un tipo celular o tejido apropiado para afectar la expresión génica con el fin de obtener
un efecto terapéutico deseado, superando las barreras de una terapia farmacológica convencional.
La terapia génica puede aplicarse utilizando diferentes estrategias:
1) Ex vivo: consiste en extraer las células que se deben reparar de un paciente, repararlas
en el laboratorio y reimplantarlas en el organismo del individuo en cuestión.
2) In situ: consiste en introducir el gen reparador directamente en el propio órgano
defectuoso del individuo.
3) In vivo: consiste en administrar directamente al paciente el gen corrector para que este
alcance el punto a tratar (Figura 10).

Entre los principales obstáculos de esta aproximación se encuentra la dificultad de dirigir el

material genético específicamente a aquellas células o tejidos donde hace falta que el gen ejerza
su función, o que la regulación del gen introducido se aproxime a la forma en que se regula el gen
en las personas sanas.

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Figura 10: Terapia génica in vivo: Introducción del ADN terapéutico en el paciente.

Por ejemplo, la fibrosis quística es una enfermedad hereditaria causada por mutaciones en
el gen que codifica para la proteína CFTR y afecta principalmente a los pulmones, en los que se
produce la acumulación de secreciones anormales que interfieren con el funcionamiento normal de
los mismos. Desde la identificación del gen CFTR como responsable de la fibrosis quística, la terapia
génica ha sido considerada como una de las vías terapéuticas para abordar el tratamiento de la
enfermedad desde su raíz: mediante la inhalación de moléculas de ADN se entrega a las células
pulmonares una copia normal de dicho gen.
Además de las enfermedades genéticas propiamente dichas, la terapia génica se está
aplicando de forma experimental al tratamiento del cáncer (en aquellos tumores que no tienen un
tratamiento eficaz o en los que el tratamiento convencional ha fracasado) (Figura 11), y, más
recientemente, otras enfermedades como la enfermedad coronaria, la enfermedad arterial periférica
o la artritis reumatoide.

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Figura 11: Ejemplo de terapia génica en cáncer.

En agosto de 2017, la FDA (U.S. Food and Drugs Administration o Administración de Alimentos y
Medicamentos de Estados Unidos) anunció la autorización por primera vez en la historia de la
terapia génica contra el cáncer. Se autorizó la utilización de Kymriah (tisagenlecleucel) como
tratamiento para niños y jóvenes que sufren una forma de leucemia linfocítica aguda (LLA). Kymriah
es una inmunoterapia a base de células T autólogas genéticamente modificadas, es decir que cada
tratamiento de Kymriah constituye una dosis de las propias células T del paciente. El procesamiento
de las células T comienza con el recogimiento y envío de las células a un centro de producción,
donde se modificarán genéticamente incluyéndoles un nuevo gen que contiene cierta proteína
específica (un receptor antígeno quimérico o RAQ) la cual sirve para ordenar a los linfocitos T que
atacan y eliminan a las células de leucemia cuya superficie tiene el antígeno específico CD19. Una
vez hecha la modificación genética de las células, éstas se vuelven a trasfundir al paciente para que
eliminen las células cancerígenas.

-CRISPR

En la actualidad, se conocen más de 10000 enfermedades hereditarias monogénicas

(causadas por un único gen) que afectan a millones de personas en todo el mundo. Algunas de
estas enfermedades son causadas por mutaciones autosómicas dominantes, es decir que la
herencia de una única copia defectuosa del gen responsable puede causar síntomas clínicos. El
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desarrollo de técnicas que permitan editar o corregir con precisión y eficiencia el genoma de células
vivas es, por lo tanto, uno de los objetivos principales de la investigación biomédica. En las últimas
décadas se han investigado e implementado distintas herramientas de edición genómica entre las
cuales se destaca el sistema CRISPR/Cas9, un mecanismo de defensa bacteriano que ha sido
adaptado y rediseñado para su utilización en otros modelos celulares (Figura 12). La tecnología
CRISPR/Cas9 podrá corregir genes defectuosos en personas enfermas. Con esta tecnología es
posible alterar o eliminar cualquier secuencia o base en un genoma de billones de nucleótidos. Al
administrar la proteína Cas9 (“tijeras moleculares”) y los ARN guía apropiados a una célula, el
genoma de ésta puede cortarse en los lugares deseados (cuyas secuencias serán complementarias
a las de los ARN guía utilizados). Esto permite la eliminación funcional de genes o la introducción
de mutaciones. Luego, utilizando los mecanismos normales de reparación de ADN que tienen las
células, se puede insertar la secuencia corregida del gen. La accesibilidad y el enorme potencial de
CRISPR/Cas9 han dado lugar a una revolución casi sin precedentes en las ciencias biomédicas y
representan un gran avance en el campo de la terapia génica.

Figura 12: Sistema CRISPR/Cas9

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Figura 13: Posibles aplicaciones del sistema CRISPR/Cas9

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