Tinción de Gram
La tinción de Gram o coloración de Gram es un tipo de tinción diferencial
empleado en microbiología para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras
clínicas. Debe su nombre al bacteriólogo danés Christian Gram, que desarrolló la técnica en
1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana como para
poder realizar una primera aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose
Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color moradas o violeta y
Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa o rojo.
Materiales:
Portaobjetos
Ansa bacteriológica
Mechero de Bunsen
Agua destilada
Fijadores
Colorantes
Papel secante
Guantes de procedimiento
Aceite de inmersión
Pinza
Recipiente
Microscopio
Técnica de la coloración de Gram
Realizar un frotis (Frotis: Es una película de bacterias extendidas sobre un
portaobjeto y secadas al aire.)
Con la ayuda de un mechero, flamear un asa bacteriológica y esperar que enfríe un
poco.
Tomar el asa (previamente flameada) y con ésta tomar un poco de muestra.
Una vez obtenida una pequeña cantidad de la muestra (con el asa), hacer que ésta
tenga contacto con una lámina portaobjetos, la cual servirá para depositar la muestra
contenida en el asa.
Con el asa (conteniendo la muestra) sobre la lámina portaobjetos, proceder a
realizar la extensión de la muestra en el portaobjetos mediante movimientos
giratorios (dar vueltas con el asa) sobre la lámina, de tal forma que al terminar la
extensión, tengamos como producto un espiral en la parte media de la lámina.
Esperar que seque al aire libre o ayudarse con la llama de un mechero para fijar la
muestra, teniendo en cuenta que el calor no debe ser directo (sólo se pasa por la
llama), puesto que el calor excesivo puede cambiar la morfología celular de las
bacterias a observar. El calor deseable es aquél en el que el portaobjetos sea apenas
demasiado caliente para ser colocado sobre el dorso de la mano.
Tinción
Con violeta de genciana (violeta cristal, azul de metileno o en todo caso tinta china)
utilizando una cantidad suficiente de dicho colorante sobre la muestra, como para lograr
cubrirla por completo. Se deja actuar al colorante por 1 minuto.
Enjuague
Al transcurrir el minuto, se debe enjuagar la lámina conteniendo la muestra con agua
corriente. Para realizar el lavado, se debe tener en cuenta que el chorro de agua NO debe
caer directamente sobre la muestra, ésta debe caer sobre la parte superior de la lámina que
no contiene muestra. El chorro debe ser un chorro delgado. También el enjuague se debe
realizar poniendo la lámina portaobjetos en posición inclinada hacia abajo.
Mordiente
Una vez enjuagado el portaobjetos, se aplica como mordiente yodo o lugol durante 30
segundos (el tiempo de reposo depende de cada laboratorio de fabricación de la coloración
de Gram). El mordiente es cualquier sustancia que forme compuestos insolubles con
colorantes y determine su fijación a las bacterias.
Enjuagar
Decoloración
Luego de haber enjuagado la lámina, el frotis se decolora con etanol al 75 %, etanol al
95 %, acetona o alcohol-acetona, hasta que ya no escurra más líquido azul. Para esto se
utiliza el gotero del frasco del decolorante. Se van añadiendo cantidades suficientes del
decolorante, hasta lograr que éste salga totalmente transparente, es decir, hasta que ya no
escurra más líquido azul. Dejar reposar por 10 segundos aproximadamente.
Lavado
Lavar con agua para quitar los residuos de decolorante.
Tinción de contraste
Procedemos a teñir nuevamente, pero esta vez se va a utilizar un colorante de contraste
como por ejemplo la safranina (o fucsina), dejar actuar durante 1 minuto.
Nuevo enjuague
Pasado el minuto correspondiente, se procede a enjuagar la lámina con agua, se escurre
el agua sobrante y se seca con papel absorbente.
De esta manera, ya tendremos listo el frotis para su respectiva observación
microscópica. Para observar al microscopio óptico es conveniente hacerlo a 100x con aceite
de inmersión.
Explicación
Tinción de Gram es una tinción diferencial, clasificando a las bacterias en Gram + y Gram -,
de acuerdo a las propiedades de su pared bacteriana. Las bacterias Gram + tiene una pared
más gruesa, y la red de peptidoglucanos origina varias capas superpuestas y las Gram-
presentan una pared más delgada y hay una sola capa de peptidoglucanos.
El cristal violeta (colorante catiónico) penetra en todas las células bacterianas (tanto
Gram positivas como Gram negativas) a través de la pared bacteriana. El lugol es un
compuesto formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio), el cual está
presente para solubilizar el yodo, y actúa de mordiente, haciendo que el cristal violeta se
fije con mayor intensidad a la pared de la célula bacteriana. El I 2 entra en las células y
forma un complejo insoluble en solución acuosa con el cristal violeta.
La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloración, ya que
en la misma es soluble el complejo I 2/cristal violeta. Los organismos Gram positivos no se
decoloran, mientras que los Gram negativos sí lo hacen.
Para poner de manifiesto las células Gram negativas se utiliza una coloración de
contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina.
Después de la coloración de contraste las células Gram negativas son rojas, mientras que
las Gram positivas permanecen azules.
Interpretación
Gram positivas: retienen el cristal violeta y aparecen color violeta profundo.
Gram negativas: pierden el cristal violeta y por el contrate de la safranina aparecen
rojas o rosadas.
