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CARRERA INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA
CURSO BITE230
Guía de Laboratorio BITE230
II SEMESTRE 2024
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Laboratorio 1: Preparación de soluciones
Una solución se puede definir como una mezcla homogénea cuya composición es
variable, donde un soluto determinado se disuelve en un solvente. Estas pueden ser
clasificadas según su estado, concentración y capacidad para conducir la electricidad.
La composición de una solución se debe medir en términos de volumen y masa, por
lo tanto es indispensable conocer la cantidad de soluto disuelto por unidad de volumen o
masa de disolvente, es decir su concentración. Durante cualquier tipo de trabajo
experimental, el uso de soluciones se hace indispensable, por lo que, es necesario conocer
los procedimientos para su correcta elaboración.
Un tipo de solución ampliamente utilizada son las del tipo buffer, amortiguadoras o
tampón, las cuales son compuestas por una mezcla de un ácido débil con su base conjugada.
Su principal característica es que mantiene estable el pH de una disolución ante la adición
de cierta cantidad de ácido o base fuerte. En cuanto a su preparación, comprende varios
pasos como: pesaje y disolución de componentes, ajustes de pH y aforo al volumen final.
En esta primera instancia se prepararán soluciones que serán utilizadas en los
siguientes prácticos del semestre, para llevar a cabo la preparación de manera exitosa es
necesario tener en cuenta la siguiente información:
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Fórmulas
Molaridad:
°
𝑀 =
ó
n° moles: 𝑛° =
𝑚𝑙
%p/v: ( ) ∗ 100 %v/v: 100𝑚𝐿
∗ 100
Se prepararán 50ml de cada solución:
PBS 10x (50 ml) pH 7,4
NaCl 1,37M
KCl 0,27M
Na2HPO4 0,1M
KH2PO4 0,018M
TAE 50x (50 mL)
Tris Base 2M
Ácido acético glacial 1M
EDTA 50mM
TE 1x (50 mL)
Tris base 10mM
EDTA 1mM
Solución I
25mM Tris-HCl pH 8,0
10mm EDTA
50mM Glucosa
Solución III
3M CH3COOK pH 4,8
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Pesos moleculares:
NaCl 58,44 g/mol
KCl 74,55 g/mol
Na2HPO4 141,96 g/mol
KH2PO4 136,08 g/mol
Tris-base 121,14 g/mol
EDTA 292,24 g/mol
TRIS-HCL 157,6g/mol
C6H12O6 180,16 g/mol
CH3COOK 98,15 g/mol
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Laboratorio 2: Análisis de polimorfismos humanos
Aún cuando el genoma de una especie se encuentra altamente conservado, existen
regiones con alto grado de variabilidad, que pueden ser o no codificantes. Se han descrito
varios tipos de ADN no codificante repetitivo y de alta variabilidad como las de repeticiones
cortas (STR) o microsatélites, que son repeticiones de hasta 5 pb. Además existen las
repeticiones en tándem con número variable (VNTR) o minisatélite, con secuencias
repetidas de entre 7 a 100 pb. Estas regiones de alta variabilidad son útiles para la
genotipificación e identificación de individuos. Una característica de los VNTR es que se
encuentran flanqueados por regiones altamente conservadas, lo cual permite su
amplificación mediante el uso de partidores específicos dirigidos contra las regiones
conservadas. De esta forma el tamaño del amplicón dependerá del número de repeticiones
que presenta el individuo, presentándo una alta variabilidad entre individuos.
El locus D1S80 corresponde a un VNTR cuya secuencia repetitiva es de 16 pb
(AGGACCACCAGGAAGG). Se ha determinado que el alelo más pequeño contiene 14
repeticiones, mientras que el más grande contiene más de 72 repeticiones. En este práctico
usted analizará el locus D1S80 en una población de estudiantes de Ingeniería en
Biotecnología.
En este esquema se representa gráficamente cómo se pueden diferenciar los individuos
mediante VNTRs. Son cuatro cromosomas (rojo, amarillo, verde y cian) de tres individuos
distintos (individuos A, B y C). Los recuadros azules representan la secuencia repetida varias
veces. Vemos que estas secuencias están repartidas por los diferentes cromosomas del
genoma y se repite un número diferente de veces tanto entre los distintos cromosomas de
un individuo como entre los distintos individuos. Algunas de las
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repeticiones pueden coincidir entre diferentes individuos, lo que nos podría dar una
relación de parentesco entre ellos. (https://forensemolecular.es.tl/VNTRs.htm)
Usted debe averiguar e incluir en su informe: la ubicación genómica del locus D1S80, la
secuencia de los partidores, la frecuencia de este polimorfismo en la población y compararla
con la frecuencia obtenida en el laboratorio, la cual usted debe calcular.
Metodología
1.Lave sus manos y póngase guantes.
2.A un tubo eppendorf de 1.5 mL agregue 1 mL de PBS 1X
3.Utilizando una tórula estéril, extraiga una muestra de células descamativas desde su
mucosa bucal luego cuidadosamente cortar el extremo de algodón e introducirlo al tubo
eppendorf.
4. Centrifugar a 12000 RPM por 1 minuto.
5.Descartar sobrenadante y resuspender el pellet en 100 µL de agua destilada autoclavada,
y de esa suspensión pase 50 µL a un tubo eppendorf de 1.5 mL nuevo.
6.Agregue 200 μl de resina Chelex-100, con punta cortada, a la nueva suspensión e incube
a 56ºC por 20 minutos.
7.Realizar vortex a alta velocidad por 10 segundos. Incube a 100ºC por 8 minutos.
8.Realizar vortex a alta velocidad por 10 segundos. Centrifugar a 12000 RPM por 2 minutos.
9.Transfiera el sobrenadante a un tubo limpio. NO TRANSFIERA RESINA.
10.Cuantifique el ADN por espectrofotometría
11.Use 50 ng de ADN por cada 50 μl de reacción de PCR. Guarde el resto de la muestra en
freezer a - 20ºC.
12. Prepare 50 μl de la siguiente mezcla para la reacción de PCR:
Buffer de polimerasa 1x:
MgCl2 2 mM
dNTPs 0.5 mM
Primers Forward 0.25 μΜ
Primer Reverse 0.25 μΜ
goTaq polimerasa 1.25 Unidades
Templado 50 ng
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13. Realice la amplificación en termociclador utilizando los siguientes parámetros:
Denaturación inicial 95ºC 5 minutos
40 ciclos: Denaturación 95ºC 30 segundos
Alineamiento 67ºC 30 segundos
Extensión 72ºC 30 segundos
Extensión final 72ºC 10 minutos
14.Cargue 25 μl de la reacción de PCR en un gel de agarosa 1,5% en TAE 1X
15.Determine la presencia de homocigotos y heterocigotos; el número de alelos y la
frecuencia de cada uno en la población estudiada.
16.Determine el número de repeticiones para cada alelo, calculando el tamaño del
amplicón en base a la migración del marcador de tamaño. Grafique.
Referencias.
Walsh H et al. (1991). Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based
typing from forensic material. BioTechniques 10 (4), 50-513
Nakamura Y, Carlson M, Krapcho K, White R. Isolation and mapping of a polymorphic DNA
sequence (pMCT118) on chromosome 1p [D1S80]. Nucleic Acids Res. 1988 Oct
11;16(19):9364. doi: 10.1093/nar/16.19.9364. PMID: 2902591; PMCID: PMC338737.
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Laboratorio 3: Técnicas del ADN recombinante.
CORTES CON ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Antes de realizar una transformación bacteriana, es esencial determinar si los materiales
con los que se trabaja son los correctos para lograr el resultado deseado. Por esto, deberá
realizar la verificación del plásmido pGLO mediante un ensayo con enzimas de restricción.
Un ensayo de restricción es el procedimiento de digestión con enzimas endonucleasas
específicas capaces de realizar cortes en el DNA doble hebra, conocidas como enzimas de
restricción. Cada enzima posee una secuencia específica de reconocimiento, donde
realizará su función de corte. Estos pueden ser cortes en extremos romos o cohesivos. El
nombre de cada enzima de restricción proviene de la bacteria de la cual fueron aisladas y
nombradas por su género, especie, cepa y el número de su descubrimiento en la bacteria.
Por ejemplo: la enzima HindIII proviene de Haemophilus influenzae Rd y fue la tercera en
identificarse.
Figura 2. Enzimas de restricción comunes, con sus secuencias de reconocimiento, los
patrones de corte y su origen. Adaptado de Klug y col. (2006).
Cada proveedor especifica las condiciones y buffer necesarios para un correcto corte con la
enzima que provee, por lo cual es importante conocer la enzima a utilizar y la ficha de
trabajo de ésta antes de planificar un ensayo de restricción. Otro punto importante a
conocer con antelación es el mapa del plásmido que se analizará, puesto que allí se pueden
observar las secuencias de las diferentes enzimas capaces de cortar, el tamaño de
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los fragmentos que se generan y la cantidad de veces que dicha enzima reconoce una
secuencia en el plásmido.
Conociendo esto usted puede planificar su experimento, realizar un corte acorde a los
protocolos del proveedor y luego verificar mediante una electroforesis por gel de agarosa
las características de tamaño del o los fragmentos obtenidos. Con esto, será capaz de
determinar si el plásmido a utilizar es el correcto para su trabajo.
En este práctico contarán con diferentes plásmidos con un patrón de corte que les
permitirá identificar, por grupo, el plásmido correspondiente a cada grupo.
- 4 Unidades de enzimas de restricción X e Y para digerir 250 ng de plásmido. Procurar
realizar un control sin digerir, es decir, sin la incorporación de las enzimas de restricción
reemplazando el volúmen correspondiente por H2O libre de nucleasas (H2Oln).
- El volúmen final de la reacción de digestión = 20 ul.
- Incubar a 37 °C por una hora, en un baño termoregulado.
- Correr los productos de digestión en un gel de agarosa al 1%.
- Determinar qué plásmido de restricción poseía cada grupo y cuál será empleado en el
siguiente práctico (pGLO).
Transformación bacteriana
La transformación es una parte crucial del proceso de clonamiento. Este mecanismo está
marcado por dos fases, la primera fase considera el ingreso del material genético (ADN) a
través de la membrana celular y la segunda fase implica el establecimiento del nuevo ADN
como un material genético estable dentro de la célula. El procedimiento de transformación
es de naturaleza fisicoquímica, donde las células son expuestas a un desbalance de cationes
y temperatura que permiten desestabilizar la membrana celular y facilita el ingreso del ADN
foráneo. Esta manipulación química (cationes) es la que permite generar células
competentes, es decir, con una membrana celular apta para el proceso de transformación
bacteriana.
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Con la transformación química, las células químicamente competentes se mezclan con
el ADN del plásmido y se exponen brevemente a una temperatura elevada, un proceso
conocido como choque térmico. Para una transformación química exitosa, se recomiendan
de 50 a 100 µl de células competentes y de 1 a 10 ng de ADN. Después del choque térmico,
las células transformadas se cultivan en un medio líquido sin antibióticos durante un
período corto para permitir que comience la expresión de los genes de resistencia a los
antibióticos del plásmido adquirido. Este paso mejora la viabilidad celular y la eficiencia de
la clonación. Finalmente, se debe incubar las células en presencia de un antibiótico
adecuado con el fin de seleccionar aquellas bacterias que incorporaron el plásmido
recombinante de forma exitosa.
Un plásmido es una molécula pequeña de ADN circular que se encuentra en las bacterias
y algunos otros organismos microscópicos, están separados físicamente del ADN
cromosómico y se replican de manera independiente. El plásmido pGLO está formado de
5,3 Kpb, un origen de replicación bacteriano compatible con Escherichia coli, el gen de
resistencia a ampicilina ampR, el gen del regulador del promotor PBAD inducible por
arabinosa araC y el gen de la proteína verde fluorescente verde (GFP) bajo el control del
promotor PBAD.
Figura 1: Mapa de plásmido pGLO. GFP:
gen de medusa que codifica la proteína
verde fluorescente; ori: origen de la
replicación del ADN; ampR: gen que
codifica la β-lactamasa, (resistencia a
ampicilina); PBAD: promotor que se une a
AraC-arabinosa y promueve la unión de la
ARN polimerasa y la transcripción del gen
GFP; araC: gen que codifica la proteína
reguladora que se une al promotor pBAD
solo en presencia de arabinosa.
Protocolo:
A.- Transformación de células quimio-competentes con plásmido pGLO.
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- Agregar 5 μL de plásmido pGLO en 100 μL de bacterias competentes, marcar tubo como +pGLO, a
otro tubo de células competentes agregar 10 μL de H2O y marcar como -pGLO.
- Incubar la suspensión en hielo durante 30 minutos.
- Llevar a un baño termorregulado a 42 °C durante 50 segundos.
- Llevar el tubo a hielo rápidamente e incubar por al menos 2 minutos.
- Sembrar de forma homogénea 100 μL de cada tubo en Agar LB en 3 condiciones.
- agar LB
- agar LB + ampicilina 100 ug/mL
- agar LB + ampicilina 100 ug/mL + arabinosa 2 mg/mL.
- Incubar las placas sembradas a 37 °C durante 24 horas.
Referencias
Klug, W.S; Cummings, M.R; Spencer, C.A. 2006. Conceptos de Genética. Octava edición.
Pearson Educación. Madrid, España.
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Selección de bacterias para preparación de DNA plasmidial
A partir de las placas con bacterias sembradas en el medio de selección, se identificará una
colonia bacteriana para su amplificación y posterior extracción de DNA plasmidial.
Para esto se preparará un tubo con 4 ml de medio líquido de cultivo bacteriano (medio LB)
estéril suplementado con el antibiótico correspondiente. Este procedimiento debe
realizarse respetando normas de esterilidad, ya sea mechero o gabinete de flujo.
Sobre estos medios, usando una punta de pipeta amarilla estéril, procederá a pinchar la
colonia que desea amplificar para luego sumergirla en la mezcla de medio de cultivo,
intentando disgregar mecánicamente.
En el control negativo, realizará el mismo procedimiento, pero sin tomar ninguna colonia
de la placa de cultivo.
Estos tubos se incubará durante 16 horas (overnight) a 37°C y serán almacenados a 4°C para
posterior purificación de DNA plasmidial.
Purificación de DNA plásmidial
La purificación de DNA plasmidial es un procedimiento esencial en biotecnología para
obtener muestras de DNA altamente purificadas y concentradas a partir de cultivos
bacterianos. Los plásmidos son moléculas circulares de DNA que se replican de forma
independiente dentro de las células bacterianas y son ampliamente utilizados en
investigación genética y biotecnológica.
Durante la purificación, se enfrentan dos desafíos principales: la separación del DNA
plasmidial del DNA genómico y la eliminación de contaminantes celulares. El DNA
plasmidial, al ser una molécula extracromosómica de menor tamaño y con propiedades de
replicación autónoma, se separa del DNA genómico mediante procesos de lisis celular y
precipitación selectiva. La resuspensión inicial del cultivo bacteriano permite la
concentración de células, seguida por la lisis celular utilizando agentes como NaOH y SDS.
Estos agentes rompen la membrana celular y liberan el contenido celular, incluyendo tanto
el DNA plasmidial como el DNA genómico.
Para este trabajo práctico se utilizarán el protocolo de lisis alcalina que comenzará con la
eliminación del medio de crecimiento de las bacterias. Para esto:
1. Transferir 1,5 ml del cultivo a un tubo Eppendorf de 2 ml.
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2. Se centrifuga durante 3 minutos a 10.000 rpm, para sedimentar las bacterias. Se
descarta el medio de cultivo sin arrastrar el pellet.
3. Sobre el pellet obtenido se agregan 1,5 ml del cultivo y se repite el paso anterior.
Protocolo de lisis alcalina:
1. Al pellet bacteriano se agregan 100 µl de solución I diluyendo el medio de
crecimiento remanente y permitiendo la resuspensión de la bacteria en un
medio apropiado para el paso de lisis. Debe quedar una suspensión homogénea.
2. Se agregan 200 µl de solución II que al poseer NaOH y SDS permite la lisis
bacteriana. Se mezcla el contenido, invirtiendo el tubo 5 veces. NO UTILIZAR
VORTEX, para evitar la fragmentación del DNA cromosomal y contaminación de
la preparación del plásmido.
3. Incubar la mezcla 5 minutos a temperatura ambiente.
4. Se agregan 150 µl de solución III, que posee acetato de potasio concentrado que
neutraliza la solución alcalina anterior, con lo que el DNA cromosomal precipita
junto con los restos celulares. El DNA plasmidial permanece en solución. El tubo
se mezcla suavemente por inversión 5 veces y se mantiene durante 3 minutos a
temperatura ambiente.
5. Se centrifuga a 14000 rpm por 10 minutos para luego transferir el sobrenadante
un tubo nuevo. El precipitado (que posee DNA cromosomal y restos celulares)
se elimina. ¡No arrastrar precipitado blanco al tubo nuevo!
6. El DNA plasmidial se precipita agregando 2 volúmenes de etanol absoluto frío. El
etanol queda a una concentración de 70%.
7. La mezcla se incuba durante 10 min en hielo. Es común precipitar ácidos nucleicos
con etanol o isopropanol en presencia de sales.
8. La solución se centrifuga durante 10 min a 14.000 rpm y el sobrenadante se
elimina cuidadosamente, sin tocar el precipitado blanco, que corresponde a
DNA plasmidial que posee sales de los procesos anteriores.
9. Para eliminar el exceso de sales, se agrega 200 µl de etanol al 70%.
10. Se centrifuga por 5 minutos a 14.000 rpm. El sobrenadante se elimina
cuidadosamente.
11. El precipitado se seca al aire poniendo los tubos de forma horizontal sobre el
mesón de trabajo.
12. Una vez seco, se agregan 30 µl de buffer T.E.
Solución I Solución II Solución III
25mM Tris-HCl pH 8,0 1% SDS 3M CH3COOK pH 4,8
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10mm EDTA 0,2 M NaOH
50mM Glucosa
Electroforesis de DNA plasmidial
1. Preparar un gel de al 1% agarosa en TAE con agente intercalante para visualización en
transiluminador.
2. Tomar 5 µl de DNA plasmidial extraído y mezclar con 2 µl de buffer de carga de DNA
para carga en el gel de agarosa preparado. Procure cargar un estándar para determinar
el tamaño de los fragmentos de DNA (ladder).
3. Realice la electroforesis a 100V durante 60 min para visualizar en transiluminador.
Laboratorio 4: Cultivo celular
Es su responsabilidad revisar el manual de cultivo celular “Cell Culture basics” de
Invitrogen disponible en su aula virtual antes de este práctico.
El objetivo de este trabajo práctico es familiarizarse con la forma de trabajo en cultivo de
células eucariontes adherentes, su traspaso, conteo y capacidad de adherencia a distintas
superficies.
Células HeLa en cultivo. Las células HeLa son las primeras células humanas inmortales que se
cultivan y son la base de innumerables descubrimientos científicos importantes. Fueron
aislados en 1951 de un carcinoma cervical derivado de una paciente de 31 años, Henrietta
Lacks. Las células HeLa fueron usadas por Jonas Salk para probar la primera vacuna contra la
poliomielitis en la década de 1950. A partir de entonces, las células HeLa han sido usadas para
miles de estudios biomédicos y hay muchas patentes que incluyen este tipo celular. Según la
ATCC, es una línea.
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A) Traspaso de células
Para traspasar células de un cultivo adherente, primero es necesario disociar de la superficie
en las cuales están adheridas. Para ellos utilizaremos disociación enzimática.
1. Observe en un microscopio invertido la morfología y estado de su cultivo.
2. En el mesón con mechero, aspire el medio de cultivo, lave las células con 5-10 mL de PBS
1X, aspire el PBS.
3. Agregue 1 mL del reactivo de disociación, incube 5 minutos a temperatura ambiente. A
los 2-3 minutos observe las células bajo el microscopio.
4. Resuspenda las células por pipeteo delicado 3-4 veces, agregue inmediatamente 3 mL de
medio de cultivo y mezclar por pipeteo. Traspase la suspensión celular a un tubo de 15 mL.
B) Conteo de células
1. Prepare un tubo Eppendorf 1,5mL rotulado con el nombre de su grupo (o identificador).
2. Agregue 15uL de muestra al tubo y mezcle con 15 uL de azul de tripan.
3. Con cuidado coloque 20uL en una de las cámaras del hemocitómetro (Cámara de
neubauer).
4. Cuente la cantidad de células que se observan en los 4 cuadrantes de las esquinas,
indicadas en la sección “Manejo de la cámara de recuento celular Neubauer “.
5. Utilice la siguiente fórmula para determinar el número de células por mL en su muestra:
∗ 10 𝑐𝑒𝑙/𝑚𝐿
Manejo de la cámara de recuento celular Neubauer
La cuadrícula de recuento está formada por 9 cuadrados grandes, cada uno de ellos con una
superficie de 1 mm2.
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El cuadrado grande central (que se puede ver en su totalidad con el objetivo 10X; ver figura),
está dividido en 25 cuadrados medianos (con el objetivo 40X se pueden ver los cuadrados
medianos completamente; ver figura), cada uno de ellos con 16 cuadrados pequeños en su
interior. Los cuatro cuadrados grandes de las esquinas (no se muestran en la figura), están
formados por 16 cuadrados medianos.
El recuento se puede realizar tanto en el cuadrado grande central como en los de las
esquinas, dependiendo del tamaño de las células en estudio. En este ejemplo realizaremos
el recuento en el cuadrado central.
Cuando colocamos la muestra bajo el cubreobjetos, la suspensión celular alcanza una altura
de 0,1 mm. Teniendo estos datos en cuenta, y si consideramos uno de los cuadrados
grandes, el volumen contenido en éste será de:
1 x 1 x 0,1 = 0,1 mm3 = 10-4 mL
Con el objetivo 10X del microscopio hay que localizar la zona de recuento (uno de los
cuadrados grandes). Para contar las células se cambia al objetivo 40X. Se cuentan las células
contenidas en todos los cuadrados medianos (25 si hemos elegido como zona de recuento
el cuadrado grande central o 16 si hemos elegido una de las esquinas) de acuerdo con el
siguiente criterio:
Hay que contar todas las células que están dentro de cada cuadrado mediano y aquellas
que están tocando los lados superior y derecho de dicho cuadrado (aunque estén
parcialmente fuera). Siguiendo este criterio, en la figura se contarían las células en color
verde, y no se contarían las células en color rojo.
Si hemos contabilizado N células en uno de los cuadrados grandes (o sea, en 25 cuadrados
medianos), la concentración de nuestra muestra será:
N x 104 cel/mL
Si para hacer el recuento hemos tenido que concentrar o diluir la muestra inicial, hemos de
tener en cuenta este factor de concentración-dilución (f):
N x 104 x f cel/mL
suspensión celular inicial = suspensión celular diluida x factor de concentración-dilución
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http://insilico.ehu.es/camara_contaje/neubauer_improved.php
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Laboratorio 5: Inmunofluorescencia
Inmunocitoquímica es un método para demostrar la presencia y localización de proteínas
específicas en la célula, utilizando como medio de detección anticuerpos. La
inmunocitoquímica permite obtener un contexto general en la célula intacta o bajo distintos
tratamientos específicos. Para detectar una proteína de interés, es necesario utilizar
anticuerpos (o inmunoglobulinas) que contiene una región constante o cadena pesada (Fc)
y una región variable (Fab) o cadenas livianas, que van a detectar al antígeno.
En algunos casos, se realiza una detección directa del antígeno por parte del anticuerpo
donde el anticuerpo está conjugado con un marcador en Fc; o bien, indirectamente, donde
un segundo anticuerpo (anticuerpo secundario) conjugado va a detectar la Fc del
hospedador donde fue generado el primer anticuerpo (anticuerpo primario). La detección
de la interacción antígeno-anticuerpo puede ser visualizada de dos maneras: con un
cromógeno, donde una enzima conjugada al anticuerpo va a generar un precipitado de
color que puede ser observado con microscopios de campo claro (ejemplo:
diaminobenzidina, fosfatasa alcalina); o bien, utilizando anticuerpos conjugados con un
fluoróforo. La observación de la interacción antígeno-anticuerpo utilizando fluoróforos se
realiza con microscopios de fluorescencia, y se denomina Inmunofluorescencia.
En un microscopio la utilización de filtros que permiten separar longitudes de onda
específicas a la hora de excitar la muestra, y posteriormente, recibir la luz que la muestra
va a emitir van a ser fundamentales para identificar la localización específica de las
proteínas de interés. El espectro de luz visible comprende desde los 400 a los 700
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nanómetros (nm) aproximadamente donde cada longitud de onda va a resultar en un color
que puede ser observado o detectado electrónicamente.
En este práctico, se observará el citoesqueleto de las células. Para ello, se utilizarán
anticuerpos para detectar las proteínas principales en esta estructura, tubulina y actina a
través de una inmunofluorescencia indirecta. Las tinciones nucleares DAPI o Hoechst, que
emiten en el rango de luz UV le permitirá identificar el núcleo de la célula.
Metodología
Las células han sido sembradas sobre cubreobjetos en una densidad de 20.000
células/cubreobjetos, y posteriormente mantenidas en DMEM 10% FBS a 37°C, con 95% O 2
y 5% CO2, por 24 hrs.
1. Lávese las manos y póngase guantes para trabajar
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2. Lave los cubreobjetos con células 3 veces con PBS 1X. Agregue aproximadamente
300 µl de PBS por las paredes, a fin de no desprender las células del cubreobjetos y
retire el PBS procurando dejar una pequeña cantidad.
3. Remueva el PBS 1X y agregue el fijador correspondiente: formaldehído 3,7% por 10
minutos, a temperatura ambiente.
4. ****realizado por los profesores debido a alta toxicidad
5. Remueva el fijador, y lave las placas 3 veces con PBS 1X
6. Permeabilizar las células fijadas con 500 µl de PBS-Triton X100 0,1% por 5 minutos
7. Lave las células permeabilizadas con PBS 1X, 3 veces.
8. Bloquee los posibles sitios de unión inespecífica en las células utilizando BSA 1% en
PBS, por 15 minutos a RT. Todas las células deben ser bloqueadas, independiente
del tipo de fijación.
9. Preparar en este período de incubación la dilución de anticuerpo primario a utilizar,
anti-tubulina (mouse) y anti actina (rabbit), en buffer de bloqueo. Considere 30 µl
por cubreobjeto a utilizar, más 2 cubreobjetos extra por un posible error.
10. Prepare una cámara húmeda para incubar los anticuerpos: ponga en una caja
plástica suficiente papel secante para cubrir el fondo. Mójelo con agua destilada, a
fin de dejar todo el papel empapado en agua. Sobre esta cama de papel mojado, se
montará el soporte para mantener los cubreobjetos.
11. Utilice la tapa de la placa de cultivo como soporte y rotúlela: corte un trozo de
parafilm que cubra la tapa y péguelo por los bordes de ésta. Así, Ud podrá ver los
rótulos escritos debajo de la tapa, y localizar sobre el parafilm la incubación de las
células. Ponga este soporte en el interior de la cámara húmeda.
12. Cuando queden aproximadamente 10 minutos de incubación del bloqueo, agregue
gotas con la dilución del anticuerpo anteriormente preparada en los lugares
rotulados correspondientes. Una vez que haya terminado el tiempo de bloqueo, y
utilizando las pinzas de punta fina, tome el cubreobjeto, escurra el exceso y
dispóngalo CON LAS CÉLULAS HACIA ABAJO sobre la gota de anticuerpos.
13. Incubar las células con el anticuerpo primario 1 hr a 37°C en cámara húmeda.
14. Retire el cubreobjeto, INVIÉRTALO PARA VOLVER A LA POSICIÓN ORIGINAL, y lave
las células con PBS 1X, 3 veces. Prepare nuevamente la cámara húmeda.
15. Prepare la dilución correcta para el anticuerpo secundario, anti-mouse-488 y anti
rabbit-546 (buscar información de fluoróforos, perfiles espectrales, etc); en una
dilución de 1:500, en buffer de bloqueo.
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CARRERA INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA
CURSO BITE230
16. Incubar el anticuerpo secundario en la cámara húmeda, por 30 minutos a 37°C.
Desde este momento, las células deben estar protegidas de la luz. Los fluoróforos
conjugados a los anticuerpos secundarios son sensibles a la luz y pueden perder
actividad. (Buscar: fotobleaching). ¡RECUERDE INVERTIR LOS CUBREOBJETOS!
17. Remueva los cubreobjetos, INVIÉRTALO PARA VOLVER A LA POSICIÓN ORIGINAL y
lave en PBS 1X, 3 veces.
18. En paralelo a los lavados, prepare la tinción nuclear a una concentración de 1 µg/mL.
Stock, 1 mg/mL. Considere 500µl por cubreobjeto, más uno extra por posible error.
19. Retire el PBS 1X de cada pocillo, y agregue 500 µl de la solución de tinción nuclear.
Incubar a RT por 10 minutos. Proteger de la luz.
20. Lavar con PBS 1X, 3 veces. Proteger de la luz.
21. Terminados los lavados, rotule los portaobjetos con la siguiente información: Línea
celular, tratamiento, anticuerpos y entre paréntesis, longitud de onda del
anticuerpo secundario correspondiente, número de portaobjeto, las iniciales de los
integrantes del grupo y la fecha.
22. Ponga sólo 2 cubreobjetos por portaobjeto. Deposite 9 µl de medio de montaje para
cada cubreobjeto, evitando formar burbujas.
23. Utilizando la pinza de punta fina, tome el cubreobjeto y enjuague con cuidado en
agua destilada para retirar las sales. Escurra el agua apoyando el borde del
cubreobjeto sobre un papel secante y disponga INVERTIDO sobre la gota de medio
de montaje. Este proceso debe ser muy lento para evitar la formación de burbujas
que perjudicarán la correcta visualización.
24. Seque por 30 minutos a 37° C o toda la noche a temperatura ambiente. Terminado
este tiempo, las células están listas para su observación en el microscopio de
fluorescencia.
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Cómo realizar las Citas y Referencias de su informe de laboratorio.
Según las normas VANCOUVER y a modo de resumen, se entregan las citas y referencias
que serán evaluadas en los informes.
Las citas en el texto se efectúan a través de llamadas con números arábigos entre
paréntesis, aunque muchas revistas establecen en sus normas para autores el uso de
superíndices.
Cada trabajo citado en el texto debe tener un único número asignado por orden de
citación. Si se cita una obra más de una vez conservará el mismo número.
Las citas de un autor se pueden realizar por un número o integrando el nombre del autor
seguido de un número en el texto. Cuando en el texto se menciona un autor, el número de
la referencia se pone tras el nombre de éste. Si no se nombra al autor, el número
aparecerá al final de la frase:
Los tumores pueden extenderse desde el pulmón a cualquier parte del cuerpo (1)…
Como indicó Lagman (2) los cuidados de la diabetes…
Si la obra tiene más de un autor se citará en el texto el primer autor et al.
Simona et al. (5) establecen que el principio …..
Para citar una obra que no tiene un autor conocido, se debe usar lo que se denomina
‘autor corporativo’. Por ejemplo una organización o una entidad.
El Ministerio de Sanidad (4) recientemente ha estimado que la hepatitis…
Algunos libros contienen capítulos escritos por diferentes autores. Cuando se cita el
capítulo se citará al autor del capítulo no al editor literario o director de la obra.
Bell (3) identificó que las personas que sufren de diabetes mellitus 2 requieren unos
cuidados alimentarios estrictos
Cuando hay más de una cita, éstas deben separarse mediante comas, pero si fueran
correlativas, se menciona la primera y la última separadas por un guion
Modern scientific nomenclature really began with Linnaeus in botany (1), but other
disciplines (2,5) were not many years behind in developing various systems (4-7) for
nomenclature and symbolization
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Cita directa: Debe ser breve, de menos de cinco renglones, se inserta dentro del texto
entre comillas, y el número correspondiente se coloca al final, después de las comillas y
antes del signo de puntuación, se incluye la paginación
“…has been proven demonstrably false.” (4, p.23)
