TEMA 2: TÉCNICA DE VISUALIZACIÓN DE BACTERIAS

1. ESTRUCTURA Y TAXONOMÍA DE LAS BACTERIAS

ESTRUCTURA DE LAS BACTERIAS

Las bacterias son organismos unicelulares procariotas, es decir, carecen de membrana

nuclear, por lo que su material genético (ADN) está inmerso directamente en el citoplasma.

La pared bacteriana

● Estructura rígida que rodea externamente a la membrana citoplasmática

● Da forma y tamaño a la bacteria
● Constituye aproximadamente el 20% del peso de la bacteria
● La pared protege a la bacteria de fenómenos osmóticos y funciona como una barrera
contra sustancias tóxicas químicas y biológicas.
● A pesar de su rigidez, posee poros que facilitan el intercambio de moléculas.
● El componente principal de la pared bacteriana es el peptidoglucano o mureína

Pared bacterias gramnegativas

● Pared fina y de aspecto rugoso

● Una sola capa de peptidoglucano
● Capa bilipídica en el exterior que dispone de porinas para el transporte pasivo de
iones y moléculas pequeñas
● Tiene lipoproteínas en su cara interna (LPP)
● En su cara externa tienen lipopolisacáridos (LPS)
○ Incapacitan las defensas del huésped y proporcionan carga negativa a la
superficie y la estabilizan
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Bacterias gram positiva

● Pared gruesa, constituida por múltiples capas (hasta 40) de peptidoglicano.

● La pared contiene también ácidos teicoicos, que tiene las siguientes funciones
○ Dotar de carga negativa a la pared bacteriana
○ Contribuir a la rigidez de la pared celular
○ Participar en la división celular
○ Captar iones para actividades enzimáticas
○ Anclar la pared a la membrana citoplasmática

Bacterias ácido alcohol resistentes

● Capa delgada de peptidoglucano

● En su cara exterior presenta moléculas de arabinogalactano, y este a su vez se
unen a lípidos de alto peso molecular (ácidos micólicos)
● La capa que forman los arabinogalactanos y los ácidos micólicos impide la
entrada de sustancias químicas, lo que hace que estos microorganismos crezcan
lentamente y sean más resistentes a los agentes químicos y a los componentes
lisosomales de los fagocitos que la mayoría de las bacterias

La membrana citoplasmática

● Se estructura según el modelo de mosaico fluido, como una bicapa fosfolipídica en la

que se integran proteínas.
● En comparación con la membrana de las células eucariotas, tienen mayor cantidad de
proteínas y no tienen colesterol

Funciones
● Barrera osmótica selectiva y sistema de transporte
● Biosíntesis de componentes
● Metabolismo energético
● Recepción de señales
● Anclaje del cromosoma bacteriano durante la división celular
● Anclaje de los flagelos
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El genoma bacteriano

El material genético de las bacterias está contenido en su totalidad, o en una gran mayoría, en
un único cromosoma bacteriano. Pueden presentar también pequeñas moléculas circulares de
ADN, denominadas plásmidos

Cromosoma bacteriano

● Está formado por una única molécula de ADN de doble cadena (bicatenario) y
circular
● Este cromosoma bacteriano no se encuentra rodeado de una membrana nuclear, sino
que se encuentra en el seno del citoplasma asociado a proteínas y superenrollado.
● La zona en que se localiza se denomina nucleoide y se ve al microscopio electrónico
como una estructura clara con aspecto fibrilar

Plásmidos

● Son moléculas bicatenarias y mayoritariamente circulares de ADN extracromosómico

● dotan a las células que los poseen de una serie de herramientas enzimáticas que les
confieren ventajas adaptativas frente a las que nos los poseen
● También existen plásmidos capaces de integrarse en el cromosoma de una célula
hospedadora, estos plásmidos se denominan episomas

Tipos de plásmidos
● Plásmidos de fertilidad: contienen genes de transferencia que permiten
transferir genes de una bacteria a otra por medio de la conjugación
● Plásmidos de resistencia: contienen genes que codifican enzimas que
degradan o modifican determinados antibióticos
● Plásmidos de virulencia: contienen genes que potencian la patogenicidad de
la bacteria
● Col-plásmidos: contienen genes que codifican colinas y proteínas que pueden
matar a otras bacterias
● Plásmidos degradativos: contienen genes que codifican enzimas capaces de
degradar o expulsar sustancias tóxicas para la bacteria

Los ribosomas

● Los ribosomas son las estructuras donde se sintetizan las proteínas. En las bacterias se
encuentran libres en el citoplasma
● El ribosoma bacteriano es de 70 S
● Consta de dos subunidades
o Subunidad grande: 50 S.
o Subunidad pequeña: 30 S.
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Otros componentes estructurales

Cápsula
● Algunas especies bacterianas se caracterizan por tener una capa externa de
polipéptidos o polisacáridos que recubre la pared y que recibe el nombre genérico de
cápsula. Estas bacterias forman colonias que macroscópicamente tienen aspecto
mucoso y liso
● La cápsula es una estructura inerte, que no juega ningún papel en el metabolismo
celular, pero que tiene otras funciones importantes:

o Proteger frente a la desecación y la fagocitosis

o Facilitar la colonización, ya que permite a las bacterias adherirse a las
superficies
o Proteger frente a agentes antibacterianos
o Incrementar la capacidad patogénica de la bacteria

Flagelos
● apéndices filamentosos extracelulares

● responsables del movimiento en los medios líquidos de la mayor parte de las bacterias
móviles.

Según el número y disposición de los flagelos las bacterias pueden ser:

● Monotrica: tienen un solo flagelo en disposición polar es decir, situado en un extremo

de la bacteria. Producen desplazamiento lento en línea recta
● Lofotrica: tienen dos o más flagelos en disposición polar, situados todos en el mismo
extremo. Producen desplazamiento lento en línea recta
● Anfitricas: tienen varios flagelos en disposición polar, pero en los dos extremos de la
célula. Producen movimiento rápido y errático
● Peritricas: tienen múltiples flagelos distribuidos por toda la superficie bacteriana,
Producen movimiento rápido y errático

Estructuralmente los flagelos constan de tres partes

● Filamento

● Cuerpo o corpúsculo basal

● Codo
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Fimbrias y pili
● Son estructuras filamentosas proteicas más cortas y finas que los flagelos que se
insertan a nivel de la membrana plasmática
● Las fimbrias tienen un diámetro de 3-7 nm. Tienen funciones de adhesión a
superficies vivas o inerte
● Los pili o pelos sexuales son un poco más gruesos, con alrededor de 10 nm de
diámetro, pero mucho más numerosos. Suelen estar codificados por plásmidos y
participan en la conjugación bacteriana

Endoesporas
● formas de resistencia que se forman en el interior de algunas bacterias gram positivas
en condiciones medioambientales desfavorables y, sobre todo por ausencia de
nutrientes
● Son células en reposo, con tu metabolismo reducido y muy resistentes al calor, la
desecación, la radiación ultravioleta y a agentes químicos
● Están formadas por
o varias cubiertas concéntricas impermeables
o La forma de la espora y su posición en el interior de su célula madre son
características de cada especie

TAXONOMÍA BACTERIANA

La taxonomía bacteriana clasifica las bacterias teniendo en cuenta sus características

fenotipicas y genotipicas

Clasificación taxonómica de las bacterias

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los taxones
La organización de las bacterias parte del dominio Bacteria, uno de los tres en que se
organizan los seres vivos. Este dominio agrupa a todas las bacterias y se va dividiendo y
subdividiendo en ramas o taxones, formando una estructura en forma de árbol

Las denominaciones de los taxones son las siguientes

Una cepa bacteriana se puede definir como una población de bacterias que descienden de una
única célula o de un aislamiento de un cultivo puro

Una especie bacteriana está integrada por una colección de capas que comparten muchas
características morfológicas, metabólicas, genéticas y ecológicas entre si, y diferentes de las
que presentan otras especies del mismo genero

Nomenclatura de las bacterias

La primera palabra se escribe con la primera letra en mayúscula y es el género, la segunda es

la que concreta la especie y va en minúsculas Igual que las demás denominaciones, el nombre
completo se escribe en cursiva o subrayado
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2. EL ESTUDIO MORFOLÓGICO DE LAS BACTERIAS

MORFOLOGÍAS MICROSCÓPICA Y MACROSCÓPICA

En el estudio morfológico se observan

● La morfología microscópica: de las bacterias y de los agrupamientos que forman
● La morfología macroscópica: de las colonias

Morfología microscópica
Las bacterias suelen tener una longitud que oscila entre las 0,5 y las 5 micro metro
El pequeño tamaño de estos microorganismos obliga el empleo de microscopios y tinciones
para poder visualizarlos. En el estudio microscópico se observan las características de las
células y si es el caso, las agrupaciones que forman

Morfología individual

En bacteriología se describen varios morfotipos básicos bien diferenciados

● Cocos: bacterias esféricas o prácticamente esféricas
● Bacilos: bacterias alargadas con forma de bastón
● Cocobacilos: bacterias con formas ovaladas cortas
● Vibrio: bacterias alargadas ligeramente curvadas en forma de coma
● Espirilo: bacterias alargadas en forma de espiral con una o más vueltas de hélice

Agrupaciones de cocos Agrupaciones de bacilos

Diplococos: cocos asociados formando parejas Cadenas en caña de bambú: múltiples bacilos
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Tétradas: cuatro cocos unidos formando un unidos por los extremos

cuadrado Empalizadas: múltiples bacilos colocados
Cadenas: múltiples cocos formando una lateralmente
cadena arrosariada Letras chinas
Sarcinas: agrupaciones cuboideas regulares Ramificados: múltiples bacilos formando
Racimos: Cocos agrupados en masas de forma cadenas ramificadas
irregular

Morfología bacteriana

La colonia bacteriana se define como un conjunto o agrupación de bacterias crecidas sobre un

medio de cultivo sólido, procedente de una unidad formadora de colonias

La unidad formadora de colonias se define como una bacteria o agrupamiento de bacterias

que inoculadas sobre un medio de cultivo sólido o líquido, son capaces de producto una
colonia

Para unas condiciones de cultivo determinadas (medio de cultivo, temperatura, atmósfera, y

tiempo de incubación) la morfología de la colonia es característica de cada especie
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PREPARACIÓN PARA LA OBSERVACIÓN AL MICROSCOPIO

El estudio microscópico puede realizarse en fresco o a partir de preparaciones fijadas y

teñidas

La observación en fresco

● Consiste en observar directamente una parte de un cultivo.

● La técnica consiste en poner una gota del medio de cultivo sobre un portaobjetos,
cubrirla con un cubreobjetos y observar rápidamente al microscopio óptico, ya que la
evaporación del medio puede afectar el movimiento bacteriano.
● La técnica de la gota pendiente evita la evaporación al colocar una gota en el centro
de un cubreobjetos rodeada de aceite de inmersión. Luego, se coloca un portaobjetos
excavado y se invierte, dejando la gota suspendida sin tocar el portaobjetos.

Las preparaciones fijadas y teñidas

La elaboración de preparaciones fijadas y teñidas se rige por un protocolo genérico que tiene
los siguientes pasos:

1. Extensión de la muestra sobre un portaobjetos identificado: esta extensión o frotis

debe ocupar la región central del portaobjetos y tener forma ovalada
● Medio de cultivo líquido crecido. Se carga un asa de siembra estéril con el
medio de cultivo, se descarga sobre el portaobjetos y se extiende. También se
puede tomar y descargar el material con una pipeta Pasteur estéril

● Colonia sobre medio de cultivo sólido. Se carga un asa de siembra estéril con
el material de la colonia y se extiende sobre la zona central del portaobjetos.

● Muestra biológica.
○ Si la muestra es un fluido biológico se procesa igual que un medio de
cultivo líquido.
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○ Si la muestra se remite al laboratorio recogida con una torunda

(exudados), la extensión se realiza directamente con la torunda sobre
la zona central del portaobjetos
○ Si la torunda es única, la extensión se realiza siempre en último lugar
después de haber sembrado los medios adecuados

2. Fijación de la muestra: Tiene una doble función preservar la morfología y las

estructuras de las células y conseguir una buena adherencia de la muestra al
portaobjetos. La fijación se consigue mediante desnaturalización y precipitación de
las proteínas por calor o mediante fijadores químicos
3. Tinción
4. Lavado y secado: los procedimientos de tinción finalizan con un lavado para eliminar
los restos del último colorante utilizado
Este lavado puede hacerse con agua destilada o, lo más comun, con agua corriente
Luego se deja secar la extensión a temperatura ambiente, en posición vertical con un
ángulo aproximado de 45°
5. Observación microscópica: Con la preparación ya lista, se procede a su observación
con microscopio óptico

LA OBSERVACIÓN CON MICROSCOPIO

Las preparaciones se observan con los objetivos 10x, 40x y 100x

● Observación a 10x: proporciona una visión global de la preparación

● Observación a 40x: se aumenta la zona identificada y se observa la distribución, las
posibles agrupaciones…
● Observaciones: se añade una gota de aceite de inmersión y se coloca el objetivo a
100x. Se observa la misma zona obteniendo el detalle de las células

3. LAS TINCIONES

TINCIONES CROMOGÉNICAS

Los colorantes

Los colorantes son compuestos químicos orgánicos, generalmente sales, que al estar en
solución se ionizan y uno de los iones resultantes actúa de cromóforo (tiene color).

Dependiendo de la carga del ion que porta el color, los colorantes pueden ser de cuatro tipos:

● Ácidos o aniónicos. Tienen carga negativa, por lo que se unen a componentes y

estructuras con carga positiva, como proteínas y citoplasma.
● Básicos o catiónicos. Tienen carga positiva, por lo que unen a componentes y
estructuras ligeramente ácidas o con carga negativa, como los ácidos nucleicos y la
pared bacteriana
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● Neutros o anfóteros. Son sales de colorantes ácidos y básicos, por lo que tiñen todo
tipo de estructuras,
● Indiferentes. Son colorantes que tiñen las estructuras al solubilizarse en ellas

Tinciones simples

requieren un único colorante disuelto en solución acuosa o alcohólica, que se puede suplementar
o no con un mordiente.
Son tinciones específicas, que tiñen por igual todas las bacterias presentes en la extensión
Las tinciones simples se utilizan para estudiar la morfología individual y el tamaño de las
células, los agrupamientos y la densidad de bacterias en la muestra y su homogeneidad
hay un único morfotipo o varios

Tinción con azul de metileno Tinción con nigrosina

Es una tinción simple positiva que resulta rápida La nigrosina es un colorante aniónico negro
y sencilla de hacer. incapaz de penetrar en las bacterias, porque
Colorea todas las bacterias de un color azul más o es repelido por la pared bacteriana.
menos oscuro La utilidad de esta tinción se limita a la
observación de bacterias con cápsula,
esporas, bacterias flageladas y bacterias
difíciles de teñir por otros métodos

Tinciones diferenciales

Utilizan dos colorantes que contrastan en intensidad o color, en combinación con un tratamiento
que provoca una respuesta diferente a la tinción entre distintos microorganismos.
Permiten distinguir entre bacterias de igual morfología por sus diferentes propiedades tintoriales

Tinción de gram Tinción de Ziehl-Neelsen

Es la tinción diferencial más utilizada en los Es una tinción diferencial que permite distinguir
laboratorios de microbiología. un grupo de bacilos grampositivos cuya pared
presenta resistencia a la decoloración por una
Proporciona la misma información que una mezcla de ácido y alcohol
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tinción simple, pero además divide a las

bacterias en dos grandes grupos, según el color Se desarrolla en tres fases
del que se tiñen con esta técnica: 1. Tinción en caliente con un colorante
● Bacterias grampositivas, que se tiñen de básico (fucsina fenicada)
color azul o violáceo oscuro. 2. Decoloración con una mezcla de acido-
alcohol
● Bacterias gramnegativas, que se tiñen de 3. Coloración de contraste
color rosáceo intenso o rojizo

Tinciones estructurales

Están diseñadas para teñir estructuras concretas que están presentes solo en algunas especies
bacterianas y que, por tanto, sirven como criterio de identificación

Las estructuras que se identifican con este tipo de tinciones son:

● Cápsulas
o Tinción de nigrosina
o Tinción china
o Tinción de Hiss
● Flagelos
o Tinción de Leifson
o Tinción de Rhodes
● Endoesporas
o Tinción de Wirtz-Conklin

TINCIONES FLUORESCENTES

Son una alternativa a las tinciones cromogénicas, que se han desarrollado para intentar conseguir
mayor sensibilidad, sobre todo en la detección de ciertas especies bacterianas en extensiones directas
de muestras biológicas muy contaminadas.

En este caso no se usan colorantes sino fluorocromos

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Tinciones fluorescentes directas Tinciones fluorescentes

Tinción de naranja de acridina Las tinciones fluorescentes indirectas se basan

El naranja de acridina es un fluorocromo que se en el uso de anticuerpos marcados con
une inespecíficamente a todos los ácidos fluorocromos, que se unen a antígenos
nucleicos de bacterias y células. Si se une a específicos de las bacterias, lo que permite
ADN de doble cadena emite fluorescencia visualizarlas.
verde, mientras que si se une a ADN de cadena
sencilla, ARN o compartimentos ácidos emite
fluorescencia roja

Tinción de auramina-rodamina
Tinción fluorescente diferencial, que permite
distinguir las BAAR de las demás bacterias, que
no retienen el colorante