EVOLUCION DE LA TOXICID AD EN LAS ES PECIES Y POBLAC IONES

COLOMBIANAS DEL GEN ERO Phyllobates

Tatiana Escovar Fadul

Director: Adolfo Amézquita PhD

Codirectora: Clara Elizabeth Quijano PhD

Resumen

La toxicidad es un mecanismo de defensa contra depredadores y microorganismos

que se basa en la presencia de alcaloides para generar una sensación desagradable o
perjudicial en el depredador. Las ranas venenosas del la familia Dendrobatidae son
un claro ejemplo de organismos que han desarrollado este tipo de defensa. Su
toxicidad está atribuida a un coctel de toxinas que se encuentra en las glándulas
granulares de la dermis. Dentro de esta familia, el genero Phyllobates ha sido
reconocido por su alta toxicidad, asociada a que en todas sus especies se encuentra la
poderosa batracotoxina en su coctel de alcaloides; sin embargo, las diferencias en los
niveles de toxicidad entre especies presentan un alto grado, lo que genera inquietudes
sobre la evolución de la toxicidad. En este estudio se evaluó si la toxicidad tiene una
señal filogenética, hallando la correlación entre las diferencias en los niveles de
toxicidad y las divergencias genéticas en seis poblaciones colombianas de
Phyllobates. Para encontrar las diferencias en los niveles de toxicidad se hicieron
pruebas en ratones, considerándolos potenciales depredadores, y se identificaron los
alcaloides presentes en las pieles de las ranas por medio de cromatografía de gases y
espectrometría de masas. Así mismo se calcularon las distancias genéticas por medio
de un marcador neutral (16S). Los resultados obtenidos no mostraron una correlación
entre las diferencias de toxicidad y las distancias genéticas, lo que llevaría a pensar
que la toxicidad no tiene señal filogenética, sino que puede estar bajo presiones de
selección tales como las que generan los depredadores que obligan a las ranas a
evolucionar este tipo mecanismo.

1
Introducción

La toxicidad es un mecanismo de defensa en contra de depredadores y microorganismos, y

está basada en la presencia de alcaloides y toxinas que generan una sensación desagradable

o perjudicial para el predador potencial. Este fenómeno es usado por una gran variedad de

plantas y animales. En el caso de los anuros existen dos grupos que presentan una

toxicidad bastante fuerte, el género Mantella y la familia Dendrobatidae. (Clark et al.

2005)

La familia Dendrobatidae es endémica de América y se encuentra distribuida desde

Nicaragua hasta el sur de Brasil, sus individuos son terrestres y diurnos, es un grupo

monofilético en el que se encuentran once géneros. Algunos de los géneros se caracterizan

por poseer un mecanismo evolutivamente eficiente conocido como aposematismo que

agrupa el fenómeno de la toxicidad con una fuerte coloración, creando una señal de

advertencia para reducir el riesgo de ser predados (Silverstone 1976; Santos et al. 2003;

Grant et al. 2006; Ham et al. 2006).

Algunos estudios muestran que la coloración fuerte tiene una correlación positiva con los

niveles de toxicidad (Myers et al.1978). Este mecanismo está presente aproximadamente

en una tercera parte de las ranas de esta familia en los géneros Dendrobates, Phyllobates,

Epipedobates, Ranitomeya y Minyobates, los cuales tienen una gran cantidad de alcaloides

lipofílicos en su piel. Estas toxinas se encuentran en las glándulas granulares de la dermis

de los anuros y son secretadas cuando los individuos se sienten amenazados, o bajo

situaciones de peligro. (Daly et al. 1999; Saporito et al. 2004; Darst et al. 2005; Grant et

al, 2006).

La toxicidad de los dendrobatidos no es atribuida a una sola sustancia sino a un coctel de

varios alcaloides. Varios estudios han encontrado que puede haber más de 500 alcaloides

2
presentes en las pieles de los individuos de esta familia (Daly et al. 1999). Un gran número

de estudios proponen que la fuente de la toxicidad en estas ranas proviene de la dieta, la

cual está compuesta en su mayoría por hormigas y ácaros en los que fueron encontrados

componentes de las toxinas lipofílicas (Dumchaer et al. 2004, Saporito et al. 2004).

En esta familia se encuentra el género Phyllobates, que está distribuido desde Costa Rica

hasta el Noroeste colombiano (Grant et al. 2006). Este género es conocido como el más

venenoso de los dendrobatidos e incluye a P. terribilis, que ha sido clasificada como la

rana más venenosa del mundo (http://amphibiaweb.org). A este genero también pertenecen

otras cuatro especies con toxicidad más leve: P. aurotaenia, P. bicolor, P. lugubris, P.

vittatus) (Myers et al. 1978).

Inicialmente el género Phyllobates fue clasificado como monofilético, basado en que las

cinco especies de anfibios que la constituyen presentan en su coctel de toxinas el grupo de

alcaloides de la batracotoxina (Myers et al. 1978; Daly et al, 1999). Luego, con análisis

filogenéticos, se corroboró que este es un grupo monofilético; sin embargo, las relaciones

dentro del género todavía presentan controversias (Vences et al. 2000; Widmer et al. 2000;

Santos et al. 2003; y Grant et al. 2006).

La batracotoxina, que fue descubierta en una de las especies colombianas de este género

P.aurotaenia,, es posiblemente la neurotoxina no proteicas más potente y está

caracterizada por un anillo esteroidal. La alta toxicidad de la batracotoxina es atribuida a la

afinidad que tiene con los canales de sodio voltaje-dependientes cuando interactúa con uno

de estos canales abiertos impidiendo su cierre, y causando una despolarización de la

membrana de células nerviosas y musculares, lo que genera un bloqueo en el intercambio y

transporte de iones (Tokuyama & Daly 1969; Daly et al.1999).

3
Myers y colaboradores en 1978, con base en la presencia de batracotoxina en las pieles,

establecieron que P. aurotaenia, P. bicolor y P. terribilis secretan altas concentraciones de

batracotoxina, lo que las hace animales más venenosos, mientras que las otras dos especies

centroamericanas (P. lugubris y P. vittatus) presentan concentraciones considerablemente

más bajas. Adicionalmente, dentro de las especies colombianas también existen diferencias

en las cantidades de batracotoxina que presentan estos individuos, así P.terribilis fue

clasificado como el animal más venenoso por las altas concentraciones de este tipo de

toxina, seguida por P.bicolor y por P. aurotaenia (Myers et al. 1978; Daly et al.1999).

Estas diferencias en los niveles de toxicidad presentan un ordenamiento donde las especies

más derivadas muestran niveles de toxicidad mas altos, lo que sugiere que las especies

desarrollaron caracteres intrínsicos como diferentes procesos metabólicos o diferencias en

la dieta que los lleva a desarrollar diferentes niveles de toxicidad. Si esto fuera cierto se

esperaría que la toxicidad tuviera una señal filogenética dentro del género Phyllobates.

M ediante este estudio se pretende establecer si la magnitud de la señal filogenética en los

niveles de toxicidad. Una manera indirecta de hacerlo es probar la correlación entre las

diferencias interpoblacionales en toxicidad y la divergencia genéticas en un marcador

neutral.

Para los análisis de toxicidad se realizaron ensayos utilizando ratones que fueron

inoculados con las toxinas y se evaluó su efecto (Myers et al. 1978). Adicionalmente se

analizaron los compuestos de la piel por medio de una cromatografía de gases y una

espectrometría de masas. Para el análisis filogenético y para calcular distancias genéticas

se secuenció un fragmento del gen mitocondrial ribosomal (16S), que por ser un gen

altamente conservado puede ser un buen marcador neutral. Finalmente se calculó la

correlación entre estas dos variables.

4
MATERIALES Y MÉTODOS

En este estudio fueron analizadas seis poblaciones del género Phyllobates, Tabla 1, de las

cuales se colectaron tejidos para la extracción de ADN, así como pieles para realizar

análisis de toxicidad.

Tabla1. Poblaciones de Phyllobates analizadas en el estudio y el número de individuos

colectados por cada población.

Especie Población Departamento # de individuos

P. aurotaenia Arusí Chocó 7
P. aurotaenia Playa de Oro Chocó 3
P. aurotaenia Bochoroma Chocó 3
P. aurotaenia Piangüita Valle del Cauca 7
P. bicolor Pueblo Rico Risaralda 3
P. terribilis * Valle del Cauca 8
* No se present a la localidad especi fi ca de P.terribilis debido a que es una especie que se encuentra
altamente amenazada y es fuertemente buscada por traficantes.

Colecta de individuos

Los individuos de todas las poblaciones (Tabla 1), fueron capturados, sacrificados y se les

retiró la piel el mismo día de la captura. La piel de cada individuo fue cortada en tres partes

iguales y almacenadas en tres crioviales de 2 mL con metanol al 100 %.

Preparación de las pieles

Las pieles fueron transportadas al laboratorio donde fueron cortadas en pequeños trozos y

combinadas en un recipiente de vidrio de diez mililitros con el extracto de metanol de cada

uno de los crioviales. Las muestras/pieles fueron homogenizadas en este recipiente durante

tres minutos con un homogenizador PRO 200 (Pro Scientific, USA). Posteriormente el

extracto fue filtrado con tela porosa y depositado en los crioviales de 2 mL. El extracto de

5
metanol fue llevado a sequedad con vacío y a una temperatura de no más de 38° C; esto se

hizo con un Speed-vac Jouan (Sonuall) durante aproximadamente tres horas. Por último

fue resuspendido en 2 mL de solución salina. De la solución anterior se obtuvieron tres

diluciones diferentes de 20 50 y 100 %.

Inyección a los ratones

Para estimar el efecto de la toxicidad de las pieles sobre otros organismos, cada una de las

tres diluciones fue inyectada subcutáneamente en ratones de la especie Mus musculus

pertenecientes a la sepa (CFW), suministrados por el Bioterio de la Universidad de los

Andes. Posterior a la inyección de la toxina, a cada ratón fueron medidas tres variables

importantes: (1) el tiempo que se demoró el ratón en perder la capacidad de moverse, (2)

el tiempo que se demoró el ratón en morir, y (3) el cambio en actividad que este tenía

luego de ser inyectado. Para esto cada ratón fue introducido en un acuario de 20 cm x 40

cm al cual se le adaptó por debajo una cuadrícula (cuadrantes de 5 cm x 5 cm). Como

control, tres minutos antes de la inyección se midió el número de cuadros recorridos por el

ratón cada 20 segundos. Acto seguido cada ratón se inyectó con la dilución de toxina

correspondiente, y fue devuelto al acuario con el fin de medir nuevamente su actividad. Se

tomó el tiempo hasta que el ratón caía, es decir, hasta que perdía de la capacidad de

mantenerse de pie. También se midió el tiempo hasta la muerte, para lo cual se tomó el

momento en que el ratón tomó la ultima bocanada de aire.

Cromatografía de gases

La detección de las toxinas en las pieles se realizó por medio de una cromatografía de alta

resolución con un equipo HP 6890 serie II (Agilent Technologies, California. EE.UU), con

detector de ionización de llama de hidrógeno (FID). Se inyectó 1uL de cada extracto en

una columna capilar fundida con Silica HP-5M S (30m x 0,25mm 0,25 µm de espesor de

6
película, Sigma-Aldrich). El programa de temperatura fue el siguiente, isotérmicamente se

mantuvo a 50 °C por 2 minutos, se usó una rampa de calentamiento a razón de 4 °C/min

hasta 230 °C, e isotérmicamente a esta temperatura durante 10 min. La temperatura del

inyector y del detector fue de 250 °C. Como gas de arrastre se usó He a un flujo de

1mL/min. Se inyectó 1µL de cada extracto con una relación split de 1:10.

Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas

Las columnas y condiciones cromatográficas fueron las mismas descritas anteriormente

para el análisis por GC-FID. El detector operó en modo de ionización electrónica a 70 eV

por 1,8 scan/s con la fuente a 230 °C. La detección se realizó en modo scan entre 35 y 400

uma. Los espectros de masas fueron comparados contra librerías NIST, Wiley, NBS y

con espectros de masas de patrones estandarizados.

Análisis Filogenéticos

Se extrajo ADN genómico mitocondrial usando el kit Qiagen DNeasy Tissue. Luego se

amplificó, por medio de PCR, un fragmento del gen ribosomal 16 S. Para amplificar este

fragmento de gen los primers utilizados fueron 16SA (5´CGC CTG TTT ATC AAA AAC

3´) and 16SB (5´CCG GTC TGA ACT CAG ATC ACG T 3´) (Palumbi et al. 1991). Cada

reacción de PCR fue de 25 uL, y contenía 5-15ng de ADN genómico y 12,5 ul de M aster

M ix Taq Polimerase (Promega ®). El procedimiento de las reacciones de secuenciación

fue hecho por M acrogen Inc.

Se editaron los cromatogramas y se alinearon las secuencias complementarias de 16S en el

programa Geneious Pro (Drummond et al. 2009). Las regiones homólogas de la secuencia

consenso fueron alineadas usando M USCLE (BioM atters Ltd. 2007. Edgar, 2004). Se

calcularon las distancias genéticas por medio de un análisis de Kimura dos parámetros en

el programa M EGA 4.0 (Kumar et al. 1993). Para los análisis filogenéticos se construyó un

7
árbol por medio de máxima verosimilitud e inferencia bayesiana. Para el árbol de máxima

verosimilitud se buscó el modelo de sustitución que mejor se acoplaba a los datos: GTR+G

(General Time Reversible), que se calculó con el programa M ODELTEST (Posada &

Crandall 1998). Los soportes de la ramas de este árbol fueron ejecutados con 10000

réplicas de bootstrap usando el portal CIPRES. Para el árbol de inferencia bayesiana se

buscó el modelo de sustitución que mejor se acoplaba a los datos modelo GTR+G (General

Time Reversible). Éste se calculó con el programa M r. MODELTEST (Nylander 2004).

Para calcular el árbol se utilizó el programa BEAST (Drummond & Rambaut 2007) con

una simulación de 10000000 de cadenas de M arkov (M CM C) para calcular las

probabilidades posteriores de los clados.

Análisis estadísticos

Correlación de distancias genéticas y distancias geográficas

Para el análisis de correlación entre distancias genéticas y distancias geográficas se creó

una matriz de distancia geográfica lineal y se realizó una prueba M antel, donde la

significancia de la correlación fue probada con 999 aleatorizaciones.

Análisis de toxicidad

Para encontrar la significancia del efecto de la población, la dilución, el peso del ratón y el

sexo del ratón en el tiempo a la caída, tiempo a la muerte y el cambio de actividad se

realizó un M ANOVA y fue calculado el estadístico F para cada variable. Con base en esto

se descartaron variables como las del sexo y peso del ratón.

Para analizar el grado de correlación entre el tiempo hasta la caída, el tiempo hasta la

muerte y el cambio en actividad se realizó una prueba de correlación donde se obtuvo que

el tiempo hasta la caída esta altamente relacionada con el tiempo hasta la muerte, por lo

que durante el estudio solo se utilizó la variable del tiempo hasta la caída. Luego para

8
determinar diferencias significativas en grupos de toxicidad se llevó a cabo una prueba

TUKEY.

Para calcular la correlación entre distancias genéticas y diferencias en toxicidad se creó

una matriz de diferencias en toxicidad y se realizó una prueba M antel, donde la

significancia de la correlación fue probada con 999 aleatorizaciones.

Por último se calculó un índice de similitud de toxinas entre poblaciones. Para éste se

tomaron las toxinas compartidas entre pares de poblaciones y se dividió por el promedio de

toxinas encontradas en cada par de poblaciones. Para calcular la correlación de la similitud

de toxinas y las diferencias en toxicidad, se construyó una matriz de distancia para la

similitud de toxinas y se realizó una prueba de M antel, donde la significancia de la

correlación fue probada con 999 aleatorizaciones.

RES ULTADOS

Análisis Filogenéticos

En general, tanto el árbol de máxima verosimilitud como el de inferencia bayesiana

muestran las mismas topologías, donde se obtuvo que las especies colombianas del género

Phyllobates son un grupo monofilético. Se observan dos linajes principales (Figura 1). El

primero, corresponde al grupo de especies que se encuentran distribuidas al sur de la

distribución general de los Phyllobates: la especie P. terribilis y una de las especies de P.

aurotaenia (Piangüita), localizadas en los departamentos de Cauca y el sur del Valle del

Cauca, respectivamente. Este primer clado está soportado por valores de bootstrap de 61

y probabilidades posteriores bayesianas de 0.83. Así mismo, en este clado también se

encuentra un individuo de P. aurotaenia (Playa de Oro).

9
Por otra parte, en el segundo clado se agrupan las especies P. bicolor (Pueblo rico) y tres

poblaciones de P. aurotania (Bochoroma, Playa de Oro, Amargal), las cuales se

encuentran localizadas al norte de la distribución general, en los departamentos de Chocó y

Risaralda. Este clado tiene soportes de bootstrap de 57 y probabilidades posteriores de 1.

En el segundo clado se encuentra que la población de Playa de Oro es parafiletica y

muestra tres grupos monofileticos; dos de estos, Amargal y Pueblo rico, soportados por

valores altos de bootstrap y probabilidades posteriores; el otro, Bochoroma, con

probabilidades posteriores muy bajas.

La prueba M antel en la que se analizaron las distancias geográficas y distancias genéticas

muestra una correlación positiva (r-M antel=0.755239, p<0.05) Figura 2, donde los

individuos aislados geográficamente están distanciados genéticamente.

Análisis de toxicidad

Los resultados muestran que existen diferencias en los niveles de toxicidad entre las

poblaciones colombianas del genero Phyllobates (ANOVA F=18.703 p<0.01) y que las

diferentes diluciones tuvieron un efecto significativo en el tiempo hasta la caída del ratón

(ANOVA F=22.909 p<0.01) Figura 3. La figura de la dilución de 100% no se muestra

debido a que en los animales más tóxicos no hubo resolución.

Al realizar la prueba TUKEY se obtuvieron dos grupos clasificados por sus niveles de

toxicidad; el primero, conformado por las poblaciones más toxicas: P.terribilis (*),

P.bicolor (Pueblo rico), P.aurotaenia (Piangüita) y P.aurotaenia (Playa de Oro); el segundo,

conformado por las poblaciones menos toxicas encontrándose P.aurotaenia (Amargal),

P.aurotaenia (Bochoroma) y P.aurotaenia (Playa de Oro) Figura 3.

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Se obtuvo que la población no tiene un efecto significativo en el cambio de actividad

(después-antes de la inyección) (ANOVA F=0.300, p=0.911), del mismo modo se

encontró que la dilución no tiene un efecto significativo en el cambio de actividad

(ANOVA F=0.023 p=0.880). Sin embargo, en la Figura 4. es evidente que en todos los

casos el cambio de actividad fue negativo.

No se evidencia ningún patrón entre las distancias genéticas y las diferencias en toxicidad,

lo que quiere decir que no hay similitudes en cuanto a la toxicidad en los individuos

genéticamente cercanos. Estos resultados se confirman con la prueba M antel en la que se

buscó la correlación entre las distancias genéticas y las diferencias en toxicidad y se

obtuvo que no es significativa (r-M antel= 0.066536, p= 0.162000) Figura 5 y 6.

Un total de 25 alcaloides fueron detectados e identificados en los extractos de pieles de

Phyllobates (Tabla 2).

Tabla 2. Compuestos lipofílicos (descritos por Daly et al. 1999) encontrados por cromatografía de

gases y espectometría de masas en las poblaciones colombianas de Phyllobates.

P.aurotaen P.teriibili P.bicol P.aurotaen P.aurota P.aurota

Código ia s (Valle or ia enia enia
Daly et (Piangüita del (Puebl (B ochoro (Playa (Amarga
al. (1999) Familia del compuesto ) cauca) o Rico) ma) de Oro) l)
223A Indolizidina x
195B Indolizidina x x x
251K Pyrrolizidina x x x x x
221 Decahidroquinolina x
181B Indolizidina x x x
219A Decahidroquinolina x x x
167B Pyrrolizidina x
235A Hisrionicotoxina x x x
243A Decahidroquinolina x x x x
259 Hisrionicotoxina x x x
275B Decahidroquinolina x
Pumili
C Pumilliotoxina x
285A Hisrionicotoxina x x
287A Hisrionicotoxina x x
197D No clasificada x
195A Decahidroquinolina x x
279F Indolizidina x

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291A Hisrionicotoxina x
251D Pumilliotoxina x
275A Azabicyclo x x
235B Indolizidina x x
207A Indolizidina x
233G Indolizidina x
285E Hisrionicotoxina x
Btxa A Batracotoxina x

Al hacer una prueba mantel de correlación entre las distancias genéticas y las similitud

entre toxinas se encontró que las distancias genéticas no explican la similitud de

compuestos entre poblaciones (r-M antel=-0.209252 p=0.201000) Figura 7.

Por último se encontró que no hay correlación entre el índice de similitud de toxinas y las

diferencias en toxicidad (r-M antel= 0.325507, p= 0.127) (Figura 8). Esto sugiere que las

diferencias en toxicidad no pueden ser explicadas por las diferencias en los compuestos

que presenta cada población en su coctel de alcaloides.

DIS CUS IÓN

Análisis filogenético

Silvertone (1976) y Myers et al. (1978) propusieron dos linajes diferentes para los

Phyllobates. Un linaje centroamericano en el que se incluye P. vittatus y P. lugubris, y otro

suramericano que incluye P. aurotenia, P. bicolor y P. terribilis. Por otro lado M axon &

M ayers (1985) propusieron que las especies centro americanas P .lugubris y P. vittatus no

eran especies hermanas, sino que P. vittatus era especie hermana de P. aurotenia. Estudios

recientes (Vences et al. 2000; Widmer et al. 2000; Santos et al. 2003; y Grant et al. 2006)

demuestran dos linajes distintos para los Phyllobates, uno centroamericano y otro

suramericano, confirmando la hipótesis de Silvertone (1976) y Myers et al. (1978). Los

12
resultados de los análisis realizados en el presente estudio confirman la hipótesis de que las

especies colombianas pertenecen a un mismo linaje.

Las especies colombianas del género Phyllobates conforman una unidad monofilética. En

el árbol se observan dos linajes; en el primero se encuentran asociadas a las especies del

sur de Colombia; y en el segundo se encuentran las especies del norte de Colombia. En

este último es evidente que P. aurotaenia es un grupo parafilético, y P. bicolor a diferencia

de la hipótesis propuesta por Silvertone (1976) y Myers et al. (1978), basada en sus

características morfológicas, similares a las de P.terribilis, por las que fue asociada como

especie hermana de esta; se encuentra cercanamente emparentada con las diferentes

poblaciones de P.aurotaenia; en el caso de las distancias entre de P. bicolor y P. aurotenia

(Bochoroma), éstas son son cinco veces más pequeñas que las existentes entre P. terribilis

y P. bicolor. En el primer clado se encuentra P. terribilis y P .aurotaenia (Piangüita), con

distancias genéticas tres veces más pequeñas a las que se encuentran entre P. aurotenia

(Piangüita) y las otras tres poblaciones de P .aurotenia (Amargal, Bochoroma y Playa de

Oro) lo que sugiere que esta última se puede tratar de una clasificación taxonómica

errónea.

Las distancias geográficas explican el 75% de la variación genética de las especies

colombianas de este género, lo que sugiere que el aislamiento por distancia llevó a un

aislamiento genético y éste a la diversificación de estas especies. Adicionalmente, indica

que el marcador genético escogido 16S probablemente responde a una evolución neutral y

no está bajo presiones de selección. Las distancias genéticas entre clados son altas, sin

embargo las distancias genéticas dentro de los clados son muy bajas, lo que significa que

existe un flujo genético dentro de los clados y no entre clados. Lo anterior llevaría a pensar

que la tasa de mutación del marcador genético no está detectando diferenciaciones

recientes, ya que entre estas especies se encuentran evidentes variaciones morfológicas

13
(coloración y toxicidad), o que hay presiones de selección locales que no permiten que las

poblaciones se homogenicen.

Pese a lo anterior, debe tenerse en cuenta que el marcador genético 16S no presenta una

buena resolución, ya que los soportes del árbol filogenético en algunos clados son bajos.

Adicionalmente este marcador en ninguna de las comparaciones, con excepción de P.

bicolor y P. aurotenia (Piangüita) no presenta una divergencia genética suficiente como

para considerarlos linajes diferentes, es decir, igual o superior al 3% como lo sugieren

Fouquet et al. (2007).

Análisis de Toxicidad

En este estudio se encontró que las poblaciones de Phyllobates colombianas presentan

diferentes niveles de toxicidad, sin embargo, la prueba TUKEY destaca dos grupos de

poblaciones que se encuentran distribuidas en ambos clados: por un lado P. terribilis (*),

P. aurotenia (Piangüita), P. bicolor (Pueblo Rico) y P. aurotenia (Playa de Oro); y por

otro lado. P. aurotenia (Amargal), P. aurotenia (Playa de Oro) y P. aurotenia

(Bochoroma). Se considera que estos resultados pueden obedecer a las altas variaciones

entre individuos de la misma población.

Por otro lado, la medición del cambio de actividad en los ratones no muestra que la

población tenga un efecto significativo sobre ésta. Por observaciones en el estudio (durante

el tiempo control la actividad fue constante, después de la inyección se presentó un pico

inicial) se puede sugerir que su efecto se genera sobre la forma en que está distribuida la

actividad y no en el cambio total de actividad.

14
Correlación entre toxicidad y distancias genéticas

Un gran número de estudios sugieren que la toxicidad de la ranas venenosas de la familia

Dendrobatidae está asociada a su dieta, donde ésta es la fuente para el almacenamiento de

los alcaloides lipofílicos en su piel (Daly et al. 1994a; Daly et al. 1994b). Estos mismos

estudios, al igual que otros, indican que la dieta esta basada en artrópodos tales como

hormigas y coleópteros y que esta dieta es altamente variable entre poblaciones e inclusive

altamente variable en la misma población en diferentes estaciones del año (Toft 1980

;Dumchaer et al. 2004, Saporito et al. 2004). A partir de esto han surgido hipótesis sobre la

evolución de la especialización de la dieta y el efecto que ésta tiene en la producción de

alcaloides específicos (Summers et al. 2001; Darst et al. 2005), sin embargo ninguno de

estos ha evaluado la toxicidad como un conjunto de alcaloides desde una visión evolutiva

general y no ecológica.

Con este estudio se pretendió evaluar la evolución de la toxicidad en las ranas, teniendo en

cuanta todo el coctel de alcaloides como una unidad, para así poder atribuir los niveles de

toxicidad al coctel en general y no a compuestos por separado.

Los resultados de las pruebas de toxicidad no indican un patrón evidente que asocie la

toxicidad con las distancias genéticas. Esto permitiría pensar que la toxicidad no

evolucionó no presenta una señal filogenética sino que existen presiones de selección que

actúan sobre la toxicidad de algunas poblaciones, tales como la depredación que lleva a las

presas a evolucionar diferentes tipos de mecanismos de defensa como es el caso de las

toxinas (Darst et al. 2005) Esto se puede afirmar ya que, en las comparaciones entre

poblaciones, algunas de estas se aíslan de la tendencia. Es el caso de las comparaciones

entre grupos genéticamente cercanos como P. bicolor (Pueblo Rico) y dos poblaciones de

P. aurotaenia (Amargal y Bochorma) donde sus distancias genéticas son muy cortas y sus

15
diferencias en toxicidad son bastante altas, lo que puede ser explicado mediante dos

hipótesis: la primera, porque existen presiones locales de selección fuertes que hacen que

P. bicolor haya desarrollado una alta toxicidad; la segunda, es que en P. aurotaenia

(Amargal) y P. aurotaenia (Bochoroma) las presiones de selección se hayan relajado

conduciendo a estas poblaciones a la perdida de su toxicidad. Así mismo en otro grupo de

comparaciones se evidencia que aunque las poblaciones de P. terribilis (*) y P. aurotaenia

(Piangüita) se encuentran distanciadas genéticamente de P. bicolor (Pueblo rico) presentan

niveles de toxicidad similares, lo que conduciría a pensar que sobre estas poblaciones no

hay presiones locales de selección que produzcan una divergencia en la toxicidad de estas

poblaciones. Así resultaría necesario analizar si los componentes del coctel están

generando las diferencias en los niveles en toxicidad, de tal manera que las poblaciones

con toxicidad similar compartirían el mismo tipo de compuestos.

En algunos estudios (Daly et al 1992; Saporito et al. 2007) se muestra una gran variación

en el perfil de toxinas que presentan diferentes poblaciones de la misma especie de la

familia Dendrobatidae a nivel temporal y espacial. De este mismo modo los resultados

exponen una variación alta en el perfil de compuestos entre las poblaciones de Phyllobates,

donde la similitud de compuestos no tiene una correlación positiva con las similitudes en

toxicidad. Lo anterior significa que las poblaciones que comparten los mismos niveles de

toxicidad no necesariamente están compartiendo los mismos compuestos. Esto puede

deberse a la alta variación en la distribución de artrópodos en las zonas tropicales como lo

afirman Saporito et al. 2007, lo que conduciría a afirmar que los mismos niveles de

toxicidad están siendo adquiridos por fuentes diferentes, lo que a su vez conlleva a la

producción de diferentes compuestos. En ese entendido, selección natural estaría actuando

sobre los compuestos y las cantidades en las que estos se producen.

16
La hipótesis anterior tendría sentido si existiera una correlación positiva entre las

distancias genéticas y la similitud en compuestos. Sin embargo, los análisis hechos en este

estudio muestran que dicha correlación no existe y que del mismo modo las diferencias en

toxicidad no están correlacionadas con la similitud en compuestos. Adicionalmente, se

encontró que las distancias genéticas no están correlacionadas con las diferencias en

toxicidad. Todo lo anterior permite intuir que las presiones de selección están actuando

sobre las rutas metabólicas por las que se sintetizan estos compuestos, así como sobre la

cantidad y tipo de alcaloides que se están produciendo.

Vale la pena destacar el grupo de comparaciones en el perfil de toxinas entre P. bicolor y

P. terribilis, y entre P. bicolor y P. aurotaenia (Bochoroma): P. bicolor fue la población

en la que más alcaloides se detectaron y de los cuales el 23% se comparten con P.

aurotaenia (Bochoroma) y P.terribilis; otro 23% lo comparte solamente con P. aurotaenia

(Bochoroma) probablemente por sus relaciones genéticas cercenas y otro 15% lo

comparten sólo con P. terribilis. Esto probablemente se debe a su similitud en cuanto a los

niveles de toxicidad. El 49% restante del coctel de toxinas fueron compuestos que sólo se

detectaron en la población de P. bicolor (Pueblo Rico).

Es importante mencionar los bajos niveles de toxicidad que presentó P.terribilis en este

estudio, contrario a lo propuesto por Myers et al. en 1978 donde postulan a P. terribilis

como el animal más venenoso del mundo 20 veces más toxico que P. bicolor . Esta

toxicidad inesperadamente baja, se puede deber a que en los estudios anteriores se

determinó la toxicidad solamente por la presencia de batracotoxina en la piel a diferencia

de este estudio donde se determinó la toxicidad teniendo en cuenta el efecto del coctel

completo de alcaloides.

17
Otra posibilidad a esta discordancia en los niveles de toxicidad de P. terribilis, puede ser

atribuida a que según locales de la zona donde se capturaron estos individuos, esta

población de P. terribilis fue trasladada de la población tipo a esta localidad. En este caso,

puede existir algunos factores ecológicos que estén variando entre estas dos localidades y

tengan un efecto directo en los niveles de toxicidad como lo puede ser la dieta la cual,

como se menciono anteriormente esta altamente relacionado con la toxicidad.

La única población en la que fue detectado un tipo de compuesto de la familia de la

batracotoxina fue en P. terribilis. (*). Esto pudo ser debido a que es la especie que presenta

mayores concentraciones de estos compuestos en su piel (Myers et al. 1978). Sin embargo,

los resultados de toxicidad realizados en el estudio no muestran diferencias significativas

en los niveles de toxicidad entre P. terribilis (*), P. bicolor (Pueblo rico) y P. aurotaenia

(Piangüita), lo que contradice la clasificación de P. terribilis como la más venenosa de los

dendrobátidos (Myers et al. 1978), la cual se realizó con base en el nivel de

concentraciones de batracotoxina sin tenerse en cuenta el análisis de la totalidad del coctel.

En conclusión, existen diferencias en toxicidad entre las especies y poblaciones

colombianas del género Phyllobates, sin embargo estas diferencias no pueden ser

explicadas por una la existencia de una señal filogenética ya que el las diferencias genético

no muestra una correlación positiva con las diferencias en toxicidad. Esto sugiere que

sobre algunos grupos existen presiones de selección como pueden ser los depredadores o la

disponibilidad de alimento que están llevando a convergencias y divergencias en la

toxicidad de este género.

18
AGRADECIM IENTOS

En primer lugar agradezco a Adolfo Amézquita por su interés, dedicación, consejos, y

dirección de este trabajo. Adicionalmente, agradezco a Clara Quijano por su constante

ayuda, tiempo y enseñanzas en el área de química durante el desarrollo de este proyecto.

Un especial agradecimiento a Iliana M edina y Lina M aría Arenas por su incondicional

compañía, consejos y dedicación. Del mismo modo quisiera agradecer a todos mis

compañeros del GECOH por sus comentarios y consejos. Por ultimo quisiera agradecer a

mi familia y amigos por su constante apoyo y compañía.

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24
FIGURAS

Figura1. Árbol filogenético de máxima verosimilitud e inferencia bayesiana para 16S.

Con valores de bootstrap/probabilidades posteriores bayesianas. El área del triangulo es

proporcional al número de individuos en cada uno de los clados.

25
Figura 2. Correlación entre la distancia geográfica y la distancia genética de 6 poblaciones

colombianas del género Phyllobates.

Figura 3. Diferencias en toxicidad, indicada como el tiempo hasta la caída del ratón (s),

entre 6 poblaciones colombianas del género Phyllobates para dos diluciones diferentes.

26
Figura 4. Diferencias en el efecto que tienen 6 diferentes poblaciones colombianas de

Phyllobates sobre el cambio de actividad en ratones después de haber sido inyectados con

alcaloides, para la dilución de 20 %.

Figura 5. Árbol filogenético de máxima verosimilitud e inferencia bayesiana para 16S.

Con valores de bootstrap/probabilidades posteriores bayesianas relacionado con la

toxicidad de cada uno de los clados.

27
Figura 6. Correlación entre la distancia genética y la distancia en toxicidad en 16

individuos de 6 poblaciones colombianas del género Phyllobates.

Figura 7. Correlación entre la distancia genética y la similitud en toxinas de 6 poblaciones

colombianas del género Phyllobates.

28
Figura 8. Correlación entre compuestos compartidos y la diferencia en toxicidad en 6

poblaciones colombianas del género Phyllobates.

29
APENDICES

Apéndice 1. Distribución geográfica de 6 poblaciones colombianas de Phyllobates.

30