Facultad de Ciencias de la Salud

Tema 6

Técnicas Instrumentales basadas en la Luminiscencia Molecular

Grado en Farmacia Técnicas Analíticas

 Luminiscencia
En su más amplio sentido, se entiende por luminiscencia el fenómeno de emisión de REM por parte de especies
químicas en estado excitado.
En el caso de la luminiscencia molecular, casi siempre corresponde a la emisión de luz visible por parte de
especies poliatómicas en estado electrónico excitado.

+ Sonoluminiscencia + Radioluminiscencia
 Introducción
- A las técnicas instrumentales basadas en este fenómeno se las denomina de luminiscencia
molecular porque en todas ellas, las moléculas (M) son excitadas originando una especie
cuya posterior emisión de luz (frecuentemente visible) suministra información para el análisis
cualitativo y cuantitativo.

- La fluorescencia y la fosforescencia se parecen en que la emisión tiene lugar tras una

excitación por absorción de fotones. Se denomina a ambas con el término fotoluminiscencia.

M + hn  M*, después M*  M + hn´

(Se mide hn´ y se relaciona con CM)
Luz Visible Luz UV

- La quimioluminiscencia se basa en la emisión de luz por parte de una especie excitada

formada en el curso de una reacción química.

RQ
M  P*, después P*  P + hn
(Se mide hn y se relaciona con CM)

- El número de métodos de análisis basados en la fluorescencia es significativamente mayor

que el número de aplicaciones de los otros dos fenómenos.
 Teoría de la emisión molecular
- Diagrama de Jablonski: diagrama de niveles energéticos de una molécula. Estados electrónicos moleculares fundamental (S0)
y excitados (S1, S2, T1). Se muestran los subniveles energéticos vibracionales, pero no los rotacionales.

- Cuando una molécula absorbe luz (10-15 s) pasa desde el estado electrónico fundamental (S0) a un estado electrónico excitado
(S1 o S2). (1). Muchas transiciones posibles a subniveles vibracionales y rotacionales de S1 y S2. Espectros de absorción.

S1 , S2

S0

T1

S0

S0+ hν′= S2 S0+ hν = S1

Absorción

S0
 Teoría de la emisión molecular (II)
- Si inicialmente está en cualquier nivel vibracional excitado del estado S2, lo primero que ocurre es una relajación
vibracional o conversión externa (3 , 10-14-10-11 s) hasta el nivel energético vibracional más bajo de éste estado electrónico
excitado (v=0). Tras ello, la molécula pasa a un estado vibracional excitado de S1, lo que se denomina una conversión interna
(2, 10-14-10-11 s) y desde ahí hasta el estado de menor energía vibracional de S1 (v=0), de nuevo mediante relajación
vibracional o conversión externa (3).
- Si inicialmente está en cualquier nivel vibracional excitado del estado S1, llegará hasta el estado de menor energía
vibracional de S1 (v=0), de nuevo mediante relajación vibracional o conversión externa (3).
- En estas transiciones no radiantes (líneas onduladas), la energía se comunica a las moléculas del entorno (principalmente al
disolvente y otros solutos presentes) mediante colisiones, de modo que parte de la energía del fotón absorbido se transforma en
calor que se transmite al entorno y de ahí la denominación de conversión externa.
Transiciones no
S1 , S2 radiantes
(hasta S1 (v=0))
S0

T1

S0

S2=S1+calor

S0
 Teoría de la emisión molecular (III)
- Una vez en el estado S1 (v=0), la molécula podría sufrir una nueva conversión interna y pasar a un estado vibracional
excitado de S0, de la misma energía que S1 (v=0), y desde ahí hasta el estado vibracional fundamental (v=0) de S0, por
relajación vibracional o conversión externa (3).
- Alternativamente, la molécula podría pasar a un estado vibracional excitado del estado electrónico excitado denominado T1.
A esto se le denomina cruce entre sistemas (5) y está favorecido por la presencia de átomos pesados en la molécula o de O2
disuelto (.
- Desde T1 (v=0) la molécula podría pasar a un estado vibracional excitado de S0, mediante nuevo cruce entre sistemas, hasta
alcanzar de nuevo el estado vibracional fundamental de S0 por posterior relajación vibracional o conversión externa (3´).
- Todos los procesos mencionados hasta ahora son no radiantes y convierten luz en calor mediante colisiones.
Transiciones no radiantes
(hasta S0 (v=0))
S1 , S2

S0

T1

S0

S1=S0+calor

T1=S0+calor
S0
 Teoría de la emisión molecular (IV)
- Sin embargo, desde S1 o T1, una molécula podría relajarse hasta S0 emitiendo un fotón, es decir, mediante un procedimiento
radiante. Lo primero se denomina fluorescencia (4) (10-9-10-7 s) y lo segundo fosforescencia (6) (10-4 – 102 s).
-Estas transiciones pueden terminar en cualquier estado vibracional de S0, dando lugar a múltiples transiciones de energías
extraordinariamente cercanas que originan los espectros de emisión.
- La fluorescencia y la fosforescencia son relativamente raras y por lo general suelen predominar las transiciones no
radiantes (mucho más rápidas).
- La fosforescencia es menos frecuente que la fluorescencia porque un estado electrónico excitado T1 tiene más probabilidad
de experimentar la conversión no radiativa a S0 antes de que se produzca la fosforescencia.
Transiciones radiantes
(hasta S0 (v=0))

Estado o transición Escala de tiempo (s)

Absorción 10-15
S2 10-15 – 10-14 (tiempo de vida)
S1 10-9 – 10-7 (tiempo de vida)
T1 10-4 – 102 (tiempo de vida)
Fluorescencia Conversión externa 10-14 – 10-11
´ Conversión interna 10-14 – 10-11
Cruce entre sistemas 10-8 – 10-3
Fosforescencia Fluorescencia 10-9 – 10-7
Fosforescencia 10-4 – 102
 Fluorescencia
-Que una molécula presente fluorescencia depende principalmente de su estructura
y de su entorno químico (disolvente, temperatura, pH, otras especies).

-Moléculas con anillos aromáticos y alto grado de conjugación son a priori

candidatos ideales. Los sustituyentes pueden exaltarla o inhibirla.

-La rigidez estructural favorece asimismo la fluorescencia.

Fluoresceína

Oxina
Zn

Quinina
 Fluorescencia

Bajas temperaturas y disolventes viscosos, disminuyen la posibilidad de relajación

no radiante por choques moleculares, favoreciendo de este modo los fenómenos
luminiscentes.

(quenching-quencher)
 Instrumentos empleados en fluorescencia
- Los espectrofluorímetros poseen una configuración similar a los espectrofotómetros
empleados en técnicas de absorción molecular.
- Diferencias fundamentales: dos monocromadores (filtros o redes de difracción),
celdas cuarzo (cuatro caras transparentes), medida a 90º.
Esquema de un espectrofluorímetro

lex

lex
Sl
Monocromador
excitación

Sl
-Lámpara
de arco de Xe Eex Eem
lem
-Cubierta de lem>lex
cuarzo (T, UV)
lex
lem
Monocromador
emisión Demostración:
lem
Eex =hnex =hc/lex
Eem=hnem=hc/lem
Si Eex > Eem
Espectrofluorímetro Entonces lex<lem

Tubo
Fotomultiplicador
(señales débiles)
 Espectros de fluorescencia
-Si se mantiene constante la longitud de onda de emisión y se varía la de excitación, se obtiene un espectro
de excitación (o de absorción).
- Si la longitud de excitación es fija y la de emisión se varía se obtiene un espectro de emisión (o de
fluorescencia), donde se representa la intensidad de emisión frente a la longitud de onda.

Absorption
or

Emission or

lex lem

-Puesto que las emisiones de fluorescencia son de menor energía que la radiación absorbida (la molécula
emite radiación de mayor longitud de onda que la absorbida), los espectros de absorción y emisión no son
superponibles.
- Normalmente, las medidas se llevan a cabo a longitudes de excitación y emisión fijas, que suelen ser las
óptimas. En el ejemplo:
lem=398 nm
lex=355 nm
 Ley de la emisión fluorescente
- La energía de la radiación fluorescente I, es proporcional a la potencia radiante
del haz de excitación absorbido por el sistema (P) y a la concentración de la especie
emisora (c), de modo que: I = k´ P c = K c.
lem=398 nm
lex=355 nm

- Al igual que la ley de Beer, esta ley dice que la intensidad de emisión es
proporcional a la concentración de la especie fluorescente.
- Al contrario que en la absorbancia (cociente de potencias radiantes), en la
emisión se puede aumentar la sensibilidad mediante incremento de la potencia del
haz incidente*. Por eso tiene gran interés en el análisis de trazas, cuando la
absorbancia es demasiado pequeña para ser medida.
(*) A = log (P0/P); si P0↑, P↑ y A = cte. Por otra parte I = kPc; si P↑, kP↑, aumenta la sensibilidad y bajan los límites de detección y cuantificación.
 Aplicaciones analíticas de la fluorescencia
- La fluorimetría se emplea para la determinación de especies de naturaleza inorgánica y orgánica.
- En el caso de especies inorgánicas existen métodos directos e indirectos.
- Los directos se emplean principalmente para determinar cationes metálicos después de hacerlos reaccionar
con agentes complejantes (quelantes) para originar compuestos fluorescentes (derivatización). Los mejores
reactivos fluorimétricos para la determinación de cationes son compuestos aromáticos que forman un
quelato con el catión metálico. En muchos de los casos, tras formarse el quelato en disolución acuosa, se
extrae en un disolvente orgánico inmiscible, donde se mide finalmente la fluorescencia.

Ejemplo:

IF Directo (cationes)

(3-hidroxiflavona)

Ccatión
IF Indirecto (aniones)

Canión
- Los métodos indirectos se emplean habitualmente para determinar aniones y se basan en la inhibición de la
fluorescencia de un reactivo (quenching) como resultado de su interacción con el analito.
 Aplicaciones analíticas de la fluorescencia
El mayor número de aplicaciones de la fluorimetría se centra en las especies de
naturaleza orgánica, para el análisis de productos alimentarios, farmacéuticos,
muestras clínicas y muestras medioambientales.

Dentro de este ámbito, muchos analitos son fluorescentes por naturaleza

(fluorescencia nativa) y se pueden determinar directamente (sin derivatización).

Ejemplos:

Warfarina Quinina (Práctica 4) Rivoflavina (Vitamina B2)

En otros casos el analito no presenta fluorescencia nativa pero puede dervatizarse

transformándolo en otro que sí presenta fluorescencia tras la adecuada reacción
química. Ejemplo: derivatización de compuestos con grupo amino mediante OPA.
 Ventajas e inconvenientes
de las Técnicas de fluorescencia
- La medida de la intensidad de emisión luminiscente permite la determinación
cuantitativa de un especies orgánicas e inorgánicas a nivel de trazas.

- Los límites de detección alcanzados mediante las técnicas de luminiscencia

molecular son con frecuencia hasta tres ordenes de magnitud más pequeños que
los alcanzados en espectrofotometría UV-VIS, siendo posible alcanzar 10-10 –
10-12 M (ppb).

- Los intervalos de linealidad suelen ser significativamente más amplios que los
de los métodos de absorción (hasta 4 o incluso 6 órdenes de magnitud).

- La selectividad también suele ser superior en los métodos luminiscentes (menos

especies, longitudes de onda de abs. y em.).

- En contra y respecto de la absorción molecular, sólo tiene una menor

aplicabilidad, dado el número relativamente limitado de sistemas químicos
capaces de generar luminiscencia.

- Suelen ser métodos menos robustos a causa de la presencia de quenchers (en

forma de impurezas) en reactivos y disolventes.