Norma Española

UNE-EN ISO 21149

Noviembre 2017

Cosméticos
Microbiología
Recuento y detección de bacterias aerobias mesófilas
(ISO 21149:2017)

Esta norma ha sido elaborada por el comité técnico

CTN 84 Aceites esenciales y productos cosméticos, cuya
secretaría desempeña STANPA.

Asociación Española
de Normalización
Génova, 6 - 28004 Madrid
915 294 900
[email protected]
www.une.org

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 UNE-EN ISO 21149

Cosméticos
Microbiología
Recuento y detección de bacterias aerobias mesófilas
(ISO 21149:2017)

Cosmetics. Microbiology. Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria (ISO 21149:2017).

Cosmétiques. Microbiologie. Dénombrement et détection des bactéries aérobies mésophiles

(ISO 21149:2017).

Esta norma es la versión oficial, en español, de la Norma Europea EN ISO 21149:2017, que
a su vez adopta la Norma Internacional ISO 21149:2017.

Esta norma anula y sustituye a la Norma UNE-EN ISO 21149:2010.

Las observaciones a este documento han de dirigirse a:

Asociación Española de Normalización

Génova, 6
28004 MADRID-España
Tel.: 915 294 900
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Depósito legal: M 31028:2017

” UNE 2017
Prohibida
Publicado la reproducción
por sin el consentimiento
AENOR INTERNACIONAL de UNE.
S.A.U. bajo licencia de la Asociación Española de Normalización.
Reproducción
Todos prohibida
los derechos de propiedad intelectual de la presente norma son titularidad de UNE.

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NORMA EUROPEA
EUROPEAN STANDARD
EN ISO 21149
NORME EUROPÉENNE
EUROPÄISCHE NORM Junio 2017

ICS 71.100.70; 07.100.99 Sustituye a EN ISO 21149:2009

Versión en español

Cosméticos
Microbiología
Recuento y detección de bacterias aerobias mesófilas
(ISO 21149:2017)

Cosmetics. Microbiology. Enumeration Cosmétiques. Microbiologie. Kosmetische Mittel. Mikrobiologie.

and detection of aerobic mesophilic Dénombrement et détection des Zählung und Nachweis von aeroben
bacteria (ISO 21149:2017). bactéries aérobies mésophiles mesophilen Bakterien
(ISO 21149:2017). (ISO 21149:2017).

Esta norma europea ha sido aprobada por CEN el 2017-04-26.

Los miembros de CEN están sometidos al Reglamento Interior de CEN/CENELEC que define las
condiciones dentro de las cuales debe adoptarse, sin modificación, la norma europea como norma
nacional. Las correspondientes listas actualizadas y las referencias bibliográficas relativas a estas
normas nacionales pueden obtenerse en el Centro de Gestión de CEN/CENELEC, o a través de sus
miembros.

Esta norma europea existe en tres versiones oficiales (alemán, francés e inglés). Una versión en otra
lengua realizada bajo la responsabilidad de un miembro de CEN en su idioma nacional, y notificada al
Centro de Gestión, tiene el mismo rango que aquéllas.

Los miembros de CEN son los organismos nacionales de normalización de los países siguientes:
Alemania, Antigua República Yugoslava de Macedonia, Austria, Bélgica, Bulgaria, Chipre, Croacia,
Dinamarca, Eslovaquia, Eslovenia, España, Estonia, Finlandia, Francia, Grecia, Hungría, Irlanda,
Islandia, Italia, Letonia, Lituania, Luxemburgo, Malta, Noruega, Países Bajos, Polonia, Portugal, Reino
Unido, República Checa, Rumanía, Serbia, Suecia, Suiza y Turquía.

COMITÉ EUROPEO DE NORMALIZACIÓN

European Committee for Standardization
Comité Européen de Normalisation
Europäisches Komitee für Normung
CENTRO DE GESTIÓN: Avenue Marnix 17, B-1000 Brussels

 2017 CEN. Derechos de reproducción reservados a los Miembros de CEN.

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UNE-EN ISO 21149:2017 -4-

Índice

Prólogo europeo .................................................................................................................................6

Declaración ...........................................................................................................................................6

Prólogo ...................................................................................................................................................7

1 Objeto y campo de aplicación........................................................................................9

2 Normas para consulta ......................................................................................................9

3 Términos y definiciones..................................................................................................9

4 Principio ............................................................................................................................ 10
4.1 Generalidades .................................................................................................................. 10
4.2 Recuento en placa .......................................................................................................... 10
4.3 Filtración a través de membrana.............................................................................. 10
4.4 Detección de bacterias por enriquecimiento ....................................................... 11

5 Diluyentes, neutralizantes y medios de cultivo................................................... 11

5.1 Generalidades .................................................................................................................. 11
5.2 Diluyentes y diluyentes neutralizantes .................................................................. 11
5.2.1 Generalidades .................................................................................................................. 11
5.2.2 Diluyentes neutralizantes ........................................................................................... 12
5.2.3 Diluyente ........................................................................................................................... 12
5.3 Diluyente para la suspensión bacteriana (solución de triptona y
cloruro sódico) ................................................................................................................ 12
5.3.1 Composición ..................................................................................................................... 12
5.3.2 Preparación ...................................................................................................................... 13
5.4 Medio de cultivo .............................................................................................................. 13
5.4.1 Generalidades .................................................................................................................. 13
5.4.2 Medio de cultivo para el recuento ............................................................................ 13
5.4.3 Medios de cultivo para la detección......................................................................... 13
5.4.4 Medio de agar para el cultivo de las cepas de referencia................................. 15

6 Aparatos y material de vidrio .................................................................................... 15

7 Cepas de microorganismos ......................................................................................... 15

8 Manipulación de los productos cosméticos y las muestras de

laboratorio ........................................................................................................................ 16

9 Procedimiento ................................................................................................................. 16
9.1 Recomendaciones generales ...................................................................................... 16
9.2 Preparación de la suspensión inicial ...................................................................... 16
9.2.1 Generalidades .................................................................................................................. 16
9.2.2 Productos miscibles en agua ...................................................................................... 16
9.2.3 Productos no miscibles en agua ................................................................................ 17
9.3 Métodos de recuento ..................................................................................................... 17
9.3.1 Diluciones para métodos de recuento .................................................................... 17
9.3.2 Métodos de recuento en placa ................................................................................... 17
9.4 Enriquecimiento ............................................................................................................. 18

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 -5- UNE-EN ISO 21149:2017

9.4.1 Generalidades .................................................................................................................. 18

9.4.2 Incubación de la muestra ............................................................................................ 18

10 Recuento de colonias (métodos de recuento en placa y de filtración a

través de membrana) .................................................................................................... 18

11 Detección del crecimiento (método de enriquecimiento) .............................. 18

12 Expresión de los resultados ........................................................................................ 19

12.1 Método para el cálculo del recuento de colonias ................................................ 19
12.2 Interpretación ................................................................................................................. 20
12.3 Ejemplos ............................................................................................................................ 21
12.3.1 EJEMPLO 1 Dos placas de una dilución ................................................................... 21
12.3.2 EJEMPLO 2 Una placa de una dilución ..................................................................... 21
12.3.3 EJEMPLO 3 Dos placas de dos diluciones ............................................................... 21
12.3.4 EJEMPLO 4 Dos filtros de membrana de una dilución....................................... 21
12.3.5 EJEMPLO 5 Un filtro de membrana de una dilución........................................... 21
12.3.6 EJEMPLO 6 Dos filtros de membrana de dos diluciones ................................... 22
12.3.7 EJEMPLO 7 Dos placas de una dilución ................................................................... 22
12.3.8 EJEMPLO 8 ......................................................................................................................... 22
12.3.9 EJEMPLO 9 ......................................................................................................................... 22
12.4 Detección después del enriquecimiento ................................................................ 23

13 Neutralización de las propiedades antimicrobianas del producto .............. 23

13.1 Generalidades .................................................................................................................. 23
13.2 Preparación del inóculo ............................................................................................... 23
13.3 Idoneidad de los métodos de recuento................................................................... 23
13.3.1 Principio ............................................................................................................................ 23
13.3.2 Ensayo de idoneidad del método de siembra por inclusión ........................... 24
13.3.3 Idoneidad del método de la siembra en superficie ............................................ 24
13.3.4 Idoneidad del método de filtración a través de membrana ............................ 24
13.4 Idoneidad del método de detección por enriquecimiento .............................. 25
13.4.1 Procedimiento ................................................................................................................. 25
13.4.2 Interpretación de los resultados .............................................................................. 25
13.5 Interpretación de los resultados del ensayo de idoneidad ............................. 25

14 Informe de ensayo.......................................................................................................... 26

Anexo A (Informativo) Otros diluyentes neutralizantes .............................................. 27

Anexo B (Informativo) Otros diluyentes ............................................................................ 29

Anexo C (Informativo) Otros medios de cultivo .............................................................. 30

Anexo D (Informativo) Neutralizantes de la actividad antimicrobiana de

los conservantes y líquidos de lavado ................................... 34

Bibliografía ........................................................................................................................................ 35

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UNE-EN ISO 21149:2017 -6-

Prólogo europeo

El texto de la Norma EN ISO 21149:2017 ha sido elaborado por el Comité Técnico ISO/TC 217
Cosméticos en colaboración con el Comité Técnico CEN/TC 392 Cosméticos, cuya Secretaría desempeña
AFNOR.

Esta norma europea debe recibir el rango de norma nacional mediante la publicación de un texto
idéntico a ella o mediante ratificación antes de finales de diciembre de 2017, y todas las normas
nacionales técnicamente divergentes deben anularse antes de finales de diciembre de 2017.

Se llama la atención sobre la posibilidad de que algunos de los elementos de este documento estén
sujetos a derechos de patente. CEN y/o CENELEC no es(son) responsable(s) de la identificación de
dichos derechos de patente.

Esta norma anula y sustituye a la Norma EN ISO 21149:2009.

Esta norma europea ha sido elaborada bajo un Mandato dirigido a CEN por la Comisión Europea y por
la Asociación Europea de Libre Comercio.

De acuerdo con el Reglamento Interior de CEN/CENELEC, están obligados a adoptar esta norma
europea los organismos de normalización de los siguientes países: Alemania, Antigua República
Yugoslava de Macedonia, Austria, Bélgica, Bulgaria, Chipre, Croacia, Dinamarca, Eslovaquia, Eslovenia,
España, Estonia, Finlandia, Francia, Grecia, Hungría, Irlanda, Islandia, Italia, Letonia, Lituania,
Luxemburgo, Malta, Noruega, Países Bajos, Polonia, Portugal, Reino Unido, República Checa, Rumanía,
Serbia, Suecia, Suiza y Turquía.

Declaración

El texto de la Norma ISO 21149:2017 ha sido aprobado por CEN como Norma EN ISO 21149:2017 sin
ninguna modificación.

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 -7- UNE-EN ISO 21149:2017

Prólogo

ISO (Organización Internacional de Normalización) es una federación mundial de organismos

nacionales de normalización (organismos miembros de ISO). El trabajo de preparación de las normas
internacionales normalmente se realiza a través de los comités técnicos de ISO. Cada organismo
miembro interesado en una materia para la cual se haya establecido un comité técnico, tiene el
derecho de estar representado en dicho comité. Las organizaciones internacionales, públicas y
privadas, en coordinación con ISO, también participan en el trabajo. ISO colabora estrechamente con la
Comisión Electrotécnica Internacional (IEC) en todas las materias de normalización electrotécnica.

En la parte 1 de las Directivas ISO/IEC se describen los procedimientos utilizados para desarrollar esta
norma y para su mantenimiento posterior. En particular debería tomarse nota de los diferentes
criterios de aprobación necesarios para los distintos tipos de documentos ISO. Esta norma se redactó
de acuerdo a las reglas editoriales de la parte 2 de las Directivas ISO/IEC. www.iso.org/directives.

Se llama la atención sobre la posibilidad de que algunos de los elementos de este documento puedan
estar sujetos a derechos de patente. ISO no asume la responsabilidad por la identificación de
cualquiera o todos los derechos de patente. Los detalles sobre cualquier derecho de patente
identificado durante el desarrollo de esta norma se indican en la introducción y/o en la lista ISO de
declaraciones de patente recibidas. www.iso.org/patents.

Cualquier nombre comercial utilizado en esta norma es información que se proporciona para
comodidad del usuario y no constituye una recomendación.

Para obtener una explicación sobre el significado de los términos específicos de ISO y expresiones
relacionadas con la evaluación de la conformidad, así como información de la adhesión de ISO a los
principios de la Organización Mundial del Comercio (OMC) respecto a los Obstáculos Técnicos al
Comercio (OTC), véase la siguiente dirección: http://www.iso.org/iso/foreword.html.

El comité responsable de esta norma es el ISO/TC 217, Cosméticos.

Esta segunda edición anula y sustituye a la primera edición (Norma ISO 21149:2006) de la cual
constituye una revisión menor con los siguientes cambios:

– en el Objeto y campo de aplicación se ha cambiado “validado” por “demostrado que es adecuado”;

– en el Objeto y campo de aplicación se ha añadido “véase la Norma ISO 29621” y la referencia se ha

añadido a la Bibliografía;

– en 4.1, se ha cambiado “validar” por “demostrar”;

– en 4.3, se ha cambiado “validado” por “descrito”;

– en 9.3.2.1, 9.3.2.2 y 9.3.2.3, se ha cambiado “validado” por “descrito”;

– en 9.3.2.3, se ha cambiado “procedimiento desarrollado durante la validación” por “procedimiento

del ensayo de idoneidad”;

– en 9.4.1, se ha cambiado “la validación” por “el ensayo de idoneidad”;

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UNE-EN ISO 21149:2017 -8-

– en 12.2.1, se ha cambiado “validadas conforme al método elegido” por “que se han demostrado ser
idóneas para método elegido”;

– en 13.3 y 13.4, se ha cambiado “validación” por “idoneidad”;

– en 13.3.2, 13.3.3 y 13.3.4, se ha cambiado “validación” por “idoneidad”;

– en 13.3.2, 13.3.3 y 13.3.4, se ha cambiado “si el recuento de la validación es de, al menos, el 50%
(0,3 log) del recuento del control" por “si el recuento del ensayo de idoneidad es de, al menos, el
50% del control”;

– en 13.4.1, se ha cambiado “ensayo de validación” por “ensayo de idoneidad”;

– en 13.4.2, se ha cambiado “placa de validación” por “ensayo de idoneidad”;

– en 13.5, se ha cambiado “resultados de validación” por “resultados del ensayo de idoneidad” y

“placas de validación” por “placas del ensayo de idoneidad”;

– en el punto f) del capítulo 14, se ha cambiado “validación del método” por “idoneidad del método”;

– en A.1, B.1 y C.1, se ha cambiado “validado” por “demostrado que es adecuado”.

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 -9- UNE-EN ISO 21149:2017

1 Objeto y campo de aplicación

Esta norma internacional proporciona unas directrices generales para la enumeración y detección de
bacterias aerobias mesófilas presentes en los productos cosméticos,

– mediante el recuento de colonias en un medio de agar después de la incubación aerobia, o

– mediante la comprobación de la ausencia de crecimiento bacteriano después del enriquecimiento.

Debido a la gran variedad de productos cosméticos que abarca este campo de aplicación, este método
puede no ser apropiado en todos los aspectos, para algunos productos (por ejemplo ciertos productos
inmiscibles en agua). Otros métodos (por ejemplo los automatizados) pueden sustituir a los ensayos
que se describen en esta norma, siempre que se haya demostrado su equivalencia o demostrado que es
adecuado el método se haya validado de otra manera.

Si es necesario, los microorganismos enumerados o detectados se pueden identificar mediante

ensayos de identificación adecuados descritos en las normas indicadas en la bibliografía.

Para asegurar la calidad del producto y la seguridad de los consumidores, se recomienda realizar un
análisis de riesgos microbiológicos adecuado para determinar los tipos de productos cosméticos para
los que es aplicable esta norma. Los productos considerados de bajo riesgo microbiológico (véase la
Norma ISO 29621) incluyen los que presentan una baja actividad de agua, los productos hidro-
alcohólicos, los que presentan valores extremos de pH, etc.

2 Normas para consulta

En el texto se hace referencia a los siguientes documentos de manera que parte o la totalidad de su
contenido constituyen requisitos de este documento. Para las referencias con fecha, solo se aplica la
edición citada. Para las referencias sin fecha se aplica la última edición (incluida cualquier
modificación de esta).

ISO 21148:2005, Cosméticos. Microbiología. Instrucciones generales para el examen microbiológico.

EN 12353, Antisépticos y desinfectantes químicos. Conservación de los organismos de ensayo utilizados

para la determinación de la actividad bactericida (incluida la Legionella), micobactericida, esporicida,
fungicida y virucida (incluidos bacteriófagos).

3 Términos y definiciones
Para los fines de este documento, se aplican los términos y definiciones siguientes.

ISO e IEC mantienen bases de datos terminológicas para su utilización en normalización en las
siguientes direcciones:

– Electropedia de IEC: disponible en http://www.electropedia.org/

– Plataforma de búsqueda Online de ISO: disponible en http://www.iso.org/obp

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UNE-EN ISO 21149:2017 - 10 -

3.1 bacteria aerobia mesófila:

Bacteria mesófila de crecimiento aerobio en las condiciones especificadas en esta norma internacional.

NOTA En las condiciones descritas, se puede detectar otro tipo de microorganismos (por ejemplo levaduras, mohos).

3.2 producto:
Porción de un producto cosmético identificado, recibido en el laboratorio para su ensayo.

3.3 muestra:
Porción del producto (3.2) (de al menos 1 g o 1 ml) que se emplea en el ensayo para preparar la
suspensión inicial (3.4).

3.4 suspensión inicial:

Suspensión (o disolución) de una muestra (3.3) en un volumen definido de un líquido apropiado
(diluyente, neutralizante, caldo o una combinación de ellos).

3.5 muestra diluida:

Dilución de la suspensión inicial (3.4).

4 Principio

4.1 Generalidades
Este método consiste en la enumeración de colonias en un medio de agar no selectivo o en determinar
la presencia o ausencia de crecimiento bacteriano después de un enriquecimiento. Se debe neutralizar
la posible inhibición del crecimiento microbiano debida a la muestra para permitir la detección de los
microorganismo viables[7]. En todos los casos, y sea cual sea la metodología utilizada, se debe
comprobar y demostrar la neutralización de las propiedades antimicrobianas del producto (véase el
capítulo 13)[8][9][10].

4.2 Recuento en placa

El recuento en placa consta de los siguientes pasos:

a) Preparación de placas de siembra por inclusión o placas para la siembra en superficie, utilizando
un medio de cultivo especificado, y la siembra en las placas de una cantidad definida de
suspensión inicial o dilución del producto.

b) Incubación aerobia de las placas a 32,5 °C ± 2,5 °C durante 72 h ± 6 h.

c) Recuento del número de unidades formadoras de colonias (UFC) y cálculo del número de
bacterias aerobias mesófilas por mililitro o por gramo de producto.

4.3 Filtración a través de membrana

La filtración a través de membrana consiste en los siguientes pasos:

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 - 11 - UNE-EN ISO 21149:2017

a) Se transfiere una cantidad adecuada de la muestra, preparada como se describe en el capítulo 13,
en el aparato de filtración humedecido con un pequeño volumen de diluyente estéril apropiado, se
filtra inmediatamente y se lava de acuerdo al procedimiento descrito (véase 13.3.4). Se transfiere
el filtro de membrana a la superficie del medio de agar especificado, tal como se indica en la
Norma ISO 21148.

b) Incubación aerobia de las placas a 32,5 °C ± 2,5 °C durante 72 h ± 6 h.

c) Recuento del número de unidades formadoras de colonias (UFC) y cálculo del número de
bacterias aerobias mesófilas por mililitro o por gramo de producto.

4.4 Detección de bacterias por enriquecimiento

La detección de bacterias mediante enriquecimiento consta de los siguientes pasos:

a) Incubación a 32,5 °C ± 2,5 °C durante al menos 20 h de una cantidad definida de suspensión inicial
en un medio líquido no selectivo que contenga agentes dispersantes o y/o neutralizantes
adecuados.

b) Se transfiere una cantidad definida de la solución anterior a un medio de agar sólido no selectivo.

c) Incubación aerobia de las placas a 32,5 °C ± 2,5 °C entre 48 h y 72 h.

d) Se comprueba el crecimiento y se expresa el resultado como "presencia/ausencia" de bacterias

aerobias mesófilas en la muestra S del producto.

5 Diluyentes, neutralizantes y medios de cultivo

5.1 Generalidades
En la Norma ISO 21148 se proporcionan instrucciones generales. Cuando se menciona el agua en un
documento, se utiliza agua destilada o agua purificada como se especifica en la Norma ISO 21148.

Los siguientes diluyentes, neutralizantes y medios de cultivo son adecuados para el recuento y
detección de bacterias aerobias mesófilas. Pueden utilizarse otros diluyentes, neutralizantes y medios
de cultivo siempre que se haya demostrado que son adecuados para este uso.

5.2 Diluyentes y diluyentes neutralizantes

5.2.1 Generalidades
El diluyente se emplea para dispersar la muestra. Puede contener neutralizantes si la muestra a
ensayar tiene propiedades antimicrobianas. Se debe demostrar la eficacia de la neutralización antes de
la determinación del recuento (véase el capítulo 13). El anexo D proporciona información relativa a
neutralizantes adecuados.

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5.2.2 Diluyentes neutralizantes

5.2.2.1 Medio de caseína digerida – lecitina de soja – polisorbato 20 (caldo SCDLP 20)

5.2.2.1.1 Composición

– Digerido pancreático de caseína 20,0 g

– Lecitina de soja 5,0 g

– Polisorbato 20 40,0 ml

– Agua 960,0 ml

5.2.2.1.2 Preparación
Se disuelve el polisorbato 20 en 960 ml de agua, mezclándolo mientras se calienta, en un baño de agua
a 49 °C ± 2 °C. Se añade el digerido pancreático de caseína y la lecitina de soja. Se calienta durante unos
30 min para obtener la disolución. Se mezcla y se dispensa el medio en recipientes adecuados Se
esteriliza en autoclave a 121 °C durante 15 min. Después de la esterilización, el pH debe ser
equivalente a 7,3 ± 0,2 cuando se mide a temperatura ambiente.

5.2.2.2 Otros diluyentes neutralizantes

Se pueden emplear otros diluyentes neutralizantes si son apropiados (véanse el anexo A y el anexo D).

5.2.3 Diluyente

5.2.3.1 Fluido A

5.2.3.1.1 Composición

– Digerido péptico de tejido animal 1,0 g

– Agua 1 000 ml

5.2.3.1.2 Preparación
Se disuelve 1 g de peptona en agua hasta llegar a 1 l. Se calienta con agitación frecuente. Se dispensa en
recipientes adecuados. Se esteriliza en autoclave a 121 °C durante 15 min. Después de la esterilización,
el pH debe ser equivalente a 7,1 ± 0,2 cuando se mide a temperatura ambiente.

5.2.3.2 Otros diluyentes

Se pueden emplear otros diluyentes si son apropiados (véase el anexo B).

5.3 Diluyente para la suspensión bacteriana (solución de triptona y cloruro sódico)

5.3.1 Composición

 Triptona, digerido pancreático de caseína 1,0 g

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 - 13 - UNE-EN ISO 21149:2017

 Cloruro sódico 8,5 g

 Agua 1 000 ml

5.3.2 Preparación
Se disuelven los componentes en el agua, mezclándolos mientras se calienta. Se dispensa en
recipientes adecuados. Se esteriliza en autoclave a 121 °C durante 15 min. Después de la esterilización,
el pH debe ser equivalente a 7,0 ± 0,2 cuando se mide a temperatura ambiente.

5.4 Medio de cultivo

5.4.1 Generalidades
Los medios de cultivo se pueden preparar siguiendo la descripción que se proporciona a continuación,
o a partir de las instrucciones del fabricante de medios de cultivo deshidratados. Pueden utilizarse
medios preparados (listos para usar) cuando su composición o su rendimiento en crecimiento son
comparables a los de las fórmulas que se indican en esta norma.

5.4.2 Medio de cultivo para el recuento

5.4.2.1 Medio de agar de caseína y soja digeridas (SCDA) o agar de triptona y soja (TSA)

5.4.2.1.1 Composición

– Digerido pancreático de caseína 15,0 g

– Digerido papaínico de soja 5,0 g

– Cloruro sódico 5,0 g

– Agar 15,0 g

– Agua 1 000 ml

5.4.2.1.2 Preparación
Se disuelven los componentes o el medio deshidratado completo en agua, mezclándolo mientras se
calienta. Se dispensa el medio en recipientes adecuados. Se esteriliza en autoclave a 121 °C durante
15 min. Después de la esterilización y enfriamiento, el pH debe ser equivalente a 7,3 ± 0,2 cuando se
mide a temperatura ambiente.

5.4.2.2 Otros medios para el recuento

Se pueden emplear otros medios si son apropiados (véase el anexo C).

5.4.3 Medios de cultivo para la detección

5.4.3.1 Generalidades
Cuando se elija este método, se debe emplear un caldo de enriquecimiento y un medio de agar para la
detección de bacterias.

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El caldo de enriquecimiento se usa para dispersar la muestra y para incrementar la población microbia-
na inicial. Puede contener neutralizantes si la muestra a ensayar tiene propiedades antimicrobianas.

5.4.3.2 Caldo de enriquecimiento: caldo Eugon LT 100

5.4.3.2.1 Generalidades
Este medio contiene ingredientes:

– que neutralizan las substancias inhibidoras presentes en la muestra: lecitina y polisorbato 80; y
– agente dispersante: octoxynol 9.

5.4.3.2.2 Composición

– Digerido pancreático de caseína 15,0 g

– Digerido papaínico de soja 5,0 g

– L-cistina 0,7 g

– Cloruro sódico 4,0 g

– Sulfito sódico 0,2 g

– Glucosa 5,5 g

– Lecitina de huevo 1,0 g

– Polisorbato 80 5,0 g

– Octoxynol 9 1,0 g

– Agua 1 000 ml

5.4.3.2.3 Preparación
Se disuelven, uno tras otro y en agua hirviendo el polisorbato 80, el oxtoxynol 9 y la lecitina de huevo
hasta su completa disolución. Se disuelven el resto de componentes mezclándolos mientras se calienta.
Se dispensa el medio en los recipientes adecuados y se esteriliza en autoclave a 121 °C durante 15 min.
Después de la esterilización, el pH debe ser equivalente a 7,0  0,2 medido a temperatura ambiente.

5.4.3.3 Medio de agar para la detección

5.4.3.3.1 Agar Eugon LT 100

5.4.3.3.1.1 Composición

– Digerido pancreático de caseína 15,0 g

– Digerido papaínico de soja 5,0 g

– L-cistina 0,7 g

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– Cloruro sódico 4,0 g

– Sulfito sódico 0,2 g

– Glucosa 5,5 g

– Lecitina de huevo 1,0 g

– Polisorbato 80 5,0 g

– Octoxynol 9 1,0 g

– Agar 15,0 g

– Agua 1 000 ml

5.4.3.3.1.2 Preparación
Se disuelven sucesivamente polisorbato 80, el octoxynol 9 y lecitina de huevo en agua hirviendo hasta
su completa disolución. Se disuelven el resto de componentes mezclándolos mientras se calienta. Se
mezcla suavemente para evitar la formación de espuma. Se dispensa el medio en recipientes
adecuados. Se esteriliza en autoclave a 121 °C durante 15 min. Después de la esterilización y
enfriamiento, el pH debe ser equivalente a 7,0 ± 0,2 cuando se mide a temperatura ambiente.

5.4.3.3.2 Otros medios de agar para la detección

Se pueden emplear otros medios si son apropiados (véase el anexo C).

5.4.4 Medio de agar para el cultivo de las cepas de referencia

Se emplea un medio de agar de caseína y soja digerida (SCDA) o agar de triptona y soja (TSA) (5.4.2.1).

6 Aparatos y material de vidrio

El equipo de laboratorio, aparatos y material de vidrio se describe en la Norma ISO 21148.

7 Cepas de microorganismos
Para ensayar la eficacia de los neutralizantes, se utilizan dos cepas representativas de microorga-
nismos Gram negativos y Gram positivos[8][11], respectivamente:

– Pseudomonas aeruginosa ATCC1) 9027 (cepa equivalente: CIP2) 82.118 o NCIMB3) 8626 o
NBRC4) 13275 o KCTC5) 2513 o cualquier cepa equivalente de una colección nacional).

– Staphylococcus aureus ATCC 6538 (cepa equivalente: CIP 4.83 o NCIMB 9518 o NBRC 13276 o
KCTC 1916 o cualquier cepa equivalente de una colección nacional).

1) American Type Culture Collection.

2) Institut Pasteur Collection.
3) National Collection of Industrial and Marine Bacteria.
4) National Biological Resource Center.
5) Korean Collection for Type Culture.

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Alternativamente a la cepa Gram negativa, se puede usar: Escherichia coli ATCC 8739 (cepa
equivalente: CIP 53.126 o NCIMB 8545 o NBRC 3972 o KCTC 2571 o cualquier cepa equivalente de una
colección nacional).

Se recomienda reconstituir el cultivo conforme a los procedimientos proporcionados por el proveedor

de la cepa de referencia.

Las cepas se pueden almacenar en el laboratorio conforme con la Norma EN 12353.

8 Manipulación de los productos cosméticos y las muestras de laboratorio

Si es necesario, los productos a ensayar se almacenan a temperatura ambiente. Los productos (3.2) y
muestras (3.3) no se deben incubar, refrigerar o congelar antes o después de los análisis.

El muestreo de los productos cosméticos a analizar se debería llevar a cabo tal y como se describe en
la Norma ISO 21148. Las muestras se analizan conforme a lo descrito en la Norma ISO 21148 y de
acuerdo al procedimiento descrito en el capítulo 9.

9 Procedimiento

9.1 Recomendaciones generales

Para preparar la muestra, la suspensión inicial y las diluciones, se utiliza material y equipo estéril así
como técnicas asépticas. Cuando se prepara la suspensión inicial, el tiempo que pasa entre el final de la
preparación y el momento en el que la alícuota entra en contacto con el medio de cultivo no debe
exceder de 45 min, a no ser que se mencione específicamente en los protocolos o documentación
establecida.

9.2 Preparación de la suspensión inicial

9.2.1 Generalidades
La suspensión inicial se prepara a partir de una muestra de al menos 1 g o 1 ml de producto a ensayar
bien homogenizado.

Se anota como S el peso o volumen exacto de la muestra.

La suspensión inicial es normalmente 1:10. Se pueden requerir volúmenes mayores de diluyente o de

caldo de enriquecimiento si se sospechan altos niveles de contaminación y/o si todavía no se han
eliminado las propiedades antimicrobianas en la dilución 1:10.

9.2.2 Productos miscibles en agua

Se transfiere la muestra S del producto a un volumen apropiado (por ejemplo 9 ml) de diluyente
neutralizante (5.2.2) o de diluyente (5.2.3) o de caldo de enriquecimiento (5.4.3.2), en función del
método empleado (9.3 o 9.4).

Se anota el factor de dilución d.

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9.2.3 Productos no miscibles en agua

Se transfiere la muestra (S) del producto a un recipiente apropiado que contenga una cantidad apro-
piada de agente solubilizante (por ejemplo polisorbato 80). Se dispersa la muestra en el agente solubi-
lizante y se añade un volumen apropiado (por ejemplo 9 ml) de diluyente neutralizante (5.2.2) o de
diluyente (5.2.3) o de caldo de enriquecimiento (5.4.3.2), en función del método empleado (9.3 o 9.4).

Se anota el factor de dilución d.

9.3 Métodos de recuento

9.3.1 Diluciones para métodos de recuento

Normalmente la suspensión inicial es la primera dilución de la que se realiza un recuento. Si es
necesario, se puede preparar una serie de diluciones adicionales (por ejemplo diluciones 1:10) a partir
de la suspensión inicial empleando el mismo diluyente (de acuerdo a los niveles de contaminación que
se sospechan en el producto).
Generalmente el recuento se realiza empleando, al menos, dos placas Petri. Es posible emplear sólo
una placa Petri en ensayos de rutina, o si el recuento se realiza en diluciones sucesivas de la misma
muestra o conforme a resultados anteriores.

9.3.2 Métodos de recuento en placa

9.3.2.1 Método de siembra por inclusión

En una placa Petri de 85 mm a 100 mm de diámetro, se deposita 1 ml de la suspensión inicial y/o de la
muestra diluida preparada según el método descrito en el capítulo 13 y se vierten 15 ml o 20 ml de
medio de agar fundido (5.4.2) mantenido en un baño de agua a no más de 48 °C. Si se usan placas Petri
más grandes, se incrementa la cantidad de medio de agar de una manera acorde.
Se mezcla la suspensión inicial y/o la muestra diluida con el medio, rotando o agitando cuidadosa-
mente las placas lo suficiente para dispersarla. Se deja solidificar la mezcla en la placa Petri sobre una
superficie horizontal a temperatura ambiente.

9.3.2.2 Método de siembra en superficie

En una placa Petri de 85 mm a 100 mm de diámetro, se añaden 15 ml o 20 ml de medio de agar
fundido (5.4.2) mantenido en un baño de agua a no más de 48 °C. Si se usan placas Petri más grandes,
se debe incrementar el volumen de medio de agar de una manera acorde. Las placas se dejan enfriar y
solidificar, por ejemplo, en una cabina microbiológica o en una estufa incubadora. Se dispersa sobre la
superficie del medio un volumen definido de al menos 0,1 ml de la suspensión inicial y/o de la muestra
diluida preparada conforme al método descrito en el capítulo 13.

9.3.2.3 Método de filtración a través de membrana

Se emplean membranas con un tamaño nominal de poro no superior a 0,45 m.

Se transfiere una cantidad apropiada de suspensión inicial o de muestra diluida preparada conforme al
método descrito en el capítulo 13 (que preferiblemente represente al menos 1 g o 1 ml de producto)
sobre la membrana. Se filtra e inmediatamente se lava la membrana (siguiendo el procedimiento del
ensayo de idoneidad; véase el capítulo 13).

Se transfiere la membrana a la superficie del medio de agar (5.4.2).

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9.3.2.4 Incubación
A no ser que se especifique lo contrario, las placas Petri sembradas se invierten y se colocan en la
estufa incubadora a 32,5 °C ± 2,5 °C durante 72 h ± 6 h. Después de la incubación, las placas se deben
examinar inmediatamente, si es posible. De lo contrario, se deben guardar, a no ser que se especifique
lo contrario, en la nevera durante un máximo de 24 h.

NOTA En ciertos casos, cuando exista un riesgo potencial de confundir las partículas del producto con colonias, puede ser
útil preparar un duplicado de las placas que contengan las mismas diluciones de muestra y el medio de agar que se
almacenan en la nevera, por si fuera necesario compararlas con las placas incubadas.

9.4 Enriquecimiento

9.4.1 Generalidades
Se prepara la suspensión inicial (véase 9.2) en el caldo de enriquecimiento (5.4.3.2) siguiendo el
procedimiento seleccionado y desarrollado durante el ensayo de idoneidad (véase el capítulo 13).

9.4.2 Incubación de la muestra

9.4.2.1 Generalidades
Se incuba la suspensión inicial preparada en el caldo (5.4.3.2) a 32,5 °C ± 2,5 °C durante al menos 20 h.

9.4.2.2 Subcultivos
Mediante pipetas estériles, se transfieren entre 0,1 ml y 0,5 ml de la suspensión incubada a la
superficie de una placa Petri (de diámetro entre 85 mm y 100 mm) que contenga aproximadamente
entre 15 ml y 20 ml del medio de agar adecuado para la detección (5.4.2.1). Si se emplean placas Petri
mayores, se debe incrementar el volumen de agar de una manera acorde.

9.4.2.3 Incubación de los subcultivos

No se invierten las placas inoculadas (o se espera a la absorción de la suspensión sembrada en el agar
antes de invertirlas), y se incuban a 32,5 °C ± 2,5 °C de 48 h a 72 h.

10 Recuento de colonias (métodos de recuento en placa y de filtración a través

de membrana)
Después de la incubación, se efectúa un recuento de las colonias:

– en placas Petri que contengan entre 30 colonias y 300 colonias; si se cuentan menos de 30 colonias,
véase el apartado 12.2.3;

– en membranas que contengan entre 15 colonias y 150 colonias; si se cuentan menos de 15 colonias,
véase el apartado 12.2.3.

11 Detección del crecimiento (método de enriquecimiento)

Después de la incubación del subcultivo, se comprueba la superficie del agar y se registra la presencia
o ausencia de crecimiento.

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12 Expresión de los resultados

12.1 Método para el cálculo del recuento de colonias

Se calcula el número N de microorganismos presentes en la muestra S, mediante:

– m, la media aritmética de los recuentos obtenidos de los duplicados en la fórmula (1);

– c, el número de colonias obtenidas a partir del recuento de una sola placa en la fórmula (2); o

– x c , la media ponderada de los recuentos obtenidos en dos diluciones sucesivas en la fórmula (3);

conforme a las siguientes fórmulas:


N  m/ V  d  (1)

N c/ V d  (2)

N  xc / V  d   (3)

donde
m es la media aritmética de los recuentos obtenidos de los duplicados;
V es el volumen de la alícuota sembrada en cada placa, en mililitros;
d es el factor de dilución correspondiente a la dilución realizada para la preparación de la
suspensión inicial (véase 9.2) o para la primera dilución en la que se ha efectuado el recuento;
c es el número de colonias obtenidas a partir del recuento de una sola placa;

xc la media ponderada de los recuentos obtenidos en dos diluciones sucesivas, calculado conforme
a:

xc 
c
n1  0, 1n2

donde

c es la suma del número de colonias obtenida en el recuento de las placas provenientes de

dos diluciones sucesivas;
n1 es el número de placas contadas a partir de la suspensión inicial (o a partir de la primera
dilución);
n2 es el número de placas contadas a partir de la dilución 1/10 de la suspensión inicial (o a
partir de la segunda dilución).

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Se redondea el resultado calculado con dos cifras significativas. Para esto, si la última cifra es menor a
5, no se modifica la cifra anterior; si la última cifra es superior a 5, se incrementa en una unidad la cifra
anterior. Se procede de este modo hasta que se obtienen dos cifras significativas. Se anota el número
obtenido como N.

12.2 Interpretación

12.2.1 Se debería tener en cuenta la variabilidad inherente al método de recuento en placa. Sólo se
deberían considerar diferentes dos resultados si difieren en más de un 50%, o, si se expresa como
logaritmo, la diferencia excede de 0,3 log.

Para que un recuento sea preciso, sólo deberían considerarse las placas con más de 30 colonias pero
con menos de 300 colonias, y membranas con más de 15 colonias pero menos de 150 colonias. Se
comprueba que el recuento se obtiene de diluciones que se han demostrado ser idóneas para método
elegido (véase el capítulo 13).

12.2.2 Cuando el número de UFC está entre 30 y 300 en placas, o entre 15 y 150 en membranas, y si
S es la masa o el volumen de la muestra (véase 9.2), se expresa el resultado como sigue:

– Si S es al menos 1 g o 1 ml, y V es al menos 1 ml:

el número de bacterias aerobias mesófilas por mililitro o por gramo de muestra es = N/S.

– Si S es menor que 1 g o 1 ml, y/o V es menor que 1 ml:

el número de bacterias aerobias mesófilas en la muestra (se anota la cantidad de la muestra

ensayada teniendo en cuenta S y V) es = N.

Se expresa el resultado como un número entre 1,0 y 9,9 multiplicado por la potencia de 10 adecuada
(véanse los ejemplos 1 a 3 y el ejemplo 7 en 12.3.1, 12.3.2, 12.3.3 y 12.3.7).

12.2.3 Cuando el número de UFC es menor de 30 en placas o menor de 15 en membranas, se expresa

el resultado como sigue:

– Si S es al menos 1 g o 1 ml, y V es al menos 1 ml:

el número estimado de bacterias aerobias mesófilas por mililitro o por gramo de muestra es = N/S.

– Si S es menor que 1 g o 1ml, o V es menor que 1 ml:

el número estimado de bacterias aerobias mesófilas en la muestra es = N;

donde S es la masa o volumen de la muestra (véase 9.2).

Se expresa el resultado como un número entre 1,0 y 9,9 multiplicado por la potencia de 10 adecuada
(véanse los ejemplos 4 a 6 en 12.3.4, 12.3.5 y 12.3.6).

12.2.4 Cuando no se observan colonias, el resultado se anota como:

 menos de 1/d · V · S bacterias aerobias mesófilas por gramo o mililitro de producto (S es al menos
1 g o 1 ml);

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 menos de 1/d · V bacterias aerobias mesófilas en la muestra S (se anota la cantidad de la muestra
ensayada teniendo en cuenta S y V) (S es menor de 1 g o 1 ml).

donde d es el factor de dilución de la suspensión inicial (véase 9.2) y V es 1 (para el recuento por los
métodos de filtración a través de membrana o de siembra por inclusión) o 0,1 (para el método de
siembra en superficie) (véase el ejemplo 8 en 12.3.8).

12.3 Ejemplos

12.3.1 EJEMPLO 1 Dos placas de una dilución

S = 1 g o 1 ml; V = 1; recuento obtenido: de la dilución 10-1, 38 y 42.

Para la fórmula (1):

N = m/(V · d) = 40/(1 · 10-1) = 40/0,1 = 400 o 4 · 102 bacterias aerobias mesófilas por mililitro o por
gramo de muestra.

12.3.2 EJEMPLO 2 Una placa de una dilución

S = 1 g o 1 ml; V = 1; recuento obtenido: de la dilución 10-1: 60.

Para la fórmula (2):

N = c/(V · d) = 60/(1 · 10-1) = 60/0,1 = 600 o 6 · 102 bacterias aerobias mesófilas por mililitro o por
gramo de muestra.

12.3.3 EJEMPLO 3 Dos placas de dos diluciones

S = 1 g o 1 ml; V = 1; recuento obtenido: de la dilución 10-2, 235 y 282; de la dilución 10-3, 31 y 39.

Para la fórmula (3):

N = x c /(V  d) = 235 + 282 + 31 + 39/1(2 + 0,1  2)  10-2 = 587/0,022 = 26 682.

Redondeando el resultado como se especifica arriba, se obtiene 27 000 o 2,7  104 bacterias aerobias
mesófilas por mililitro o por gramo de muestra.

12.3.4 EJEMPLO 4 Dos filtros de membrana de una dilución

S = 1 g o 1 ml; V = 1; recuento obtenido: de la dilución 10-1, 18 y 22.

Para la fórmula (1):

N = m/(V  d) = 20/(1  10-1) = 20/0,1 = 200 ó 2  102 bacterias aerobias mesófilas por mililitro o por
gramo de muestra.

12.3.5 EJEMPLO 5 Un filtro de membrana de una dilución

S = 1 g o 1 ml; V = 1; recuento obtenido: de la dilución 10-1, 65.

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Para la fórmula (2):

N = c/(V  d) = 65/(1  10-1) = 65/0,1 = 650 ó 6,5  102 bacterias aerobias mesófilas por mililitro o por
gramo de muestra.

12.3.6 EJEMPLO 6 Dos filtros de membrana de dos diluciones

S = 1 g o 1 ml; V = 1; recuento obtenido: de la dilución 10-1, 121 y 105; de la dilución 10-2, 15 y 25.

Para la fórmula (3):

N = x c /(V  d) = 121 + 105 + 15 + 25/1(2 + 0,1  2)  (110-1) = 266/0,22 = 1 209.

Redondeando el resultado como se especifica arriba, se obtiene 1 200 ó 1,2  103 bacterias aerobias
mesófilas por mililitro o por gramo de muestra.

12.3.7 EJEMPLO 7 Dos placas de una dilución

S = 1 g o 1 ml; V = 1; recuento obtenido: de la dilución 10-1, 28 y 22.

Para la fórmula (1):

N = m/(V  d) = 25/(1  10-1) = 25/0,1 = 250.

El número estimado es 250 o 2,5  102 bacterias aerobias mesófilas por mililitro o por gramo de
muestra.

12.3.8 EJEMPLO 8
S = 1 g o 1 ml; V = 1; recuento obtenido: de la dilución 10-1, 0 y 0.

Para la fórmula (1):

N  1/(V  d),

 1/(1  10-1),

 1/0,1,

 10.

El número estimado es menor de 10 bacterias aerobias mesófilas por mililitro o por gramo de muestra.

12.3.9 EJEMPLO 9
S = 1 g o 1 ml; V = 1; recuento obtenido: de la dilución 10-1, 0 y 3.

Para la ecuación (1):

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N  m (V  d),
 1,5/(1  10-1),
 1,5/0,1,
 15.

El número estimado es menor de 15 bacterias aerobias mesófilas por mililitro o por gramo de muestra.

12.4 Detección después del enriquecimiento

En el caso de detectar crecimiento (véase el capítulo 11), se expresa el resultado como:

"Presencia de bacterias aerobias mesófilas en la muestra S".

y se procede al recuento de la muestra mediante uno de los métodos propuestos (véase 9.3).

Si no se detecta crecimiento (véase el capítulo 11), se expresa el resultado como:

"Ausencia de bacterias aerobias mesófilas en la muestra S".

13 Neutralización de las propiedades antimicrobianas del producto

13.1 Generalidades
Los diferentes ensayos que se describen a continuación demuestran que los microorganismos pueden
crecer en las condiciones del análisis.

Las dos cepas (véase el capítulo 7) utilizadas para demostrar la validez de estas propiedades
generalmente son sensibles a los agentes antimicrobianos.

13.2 Preparación del inóculo

Antes del ensayo, se siembra cada cepa en la superficie del agar de caseína y soja digerida (SCDA) u
otro medio adecuado (no selectivo y sin neutralizantes). Se incuba a 32,5 °C ± 2,5 °C de 18 h a 24 h.
Para preparar el cultivo bacteriano, se utiliza un asa estéril, se raspa la superficie del cultivo y se
vuelve a suspender en un diluyente adecuado para suspensiones bacterianas (véase 5.3) para obtener
una suspensión estandarizada de unas 1  108 UFC/ml (por ejemplo mediante un espectrofotómetro,
véase la Norma ISO 21148:2017, anexo C). Esta suspensión estandarizada y sus diluciones se usan
dentro de las siguientes 2 h.

13.3 Idoneidad de los métodos de recuento

13.3.1 Principio
Para cada cepa, se mezcla la muestra neutralizada (suspensión inicial o muestra diluida de acuerdo a la
actividad antimicrobiana o la baja solubilidad del producto) con una dilución del microorganismo. Se
transfiere a una placa Petri o se filtra a través de una membrana. Después de la incubación, se
comprueba la naturaleza de las colonias y se compara el recuento con un control (sin muestra).

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Si el recuento es menor del 50% (0,3 log) respecto al control, se modifica el procedimiento (diluyentes,
agentes neutralizantes o una combinación de ambos, véase el anexo D). Se debería tener en cuenta la
variabilidad inherente del recuento en placa. Sólo se deberían considerar diferentes dos resultados si
difieren en más de un 50%, o, si se expresa como logaritmo, la diferencia excede de 0,3. El fallo en el
crecimiento del inóculo invalida el ensayo, a menos que sea poco probable la contaminación del
producto con este microorganismo.

13.3.2 Ensayo de idoneidad del método de siembra por inclusión

Se mezclan 9 ml de la suspensión inicial y/o de la(s) muestra(s) diluida(s) en el diluyente
neutralizante (o en otro, véase el apartado 5.2) con 1 ml de la suspensión del microorganismo que
contenga entre 1 000 UFC/ml y 3 000 UFC/ml. Se transfiere 1 ml a una placa Petri (preferiblemente
por duplicado) y se vierten entre 15 ml y 20 ml del medio de agar fundido (5.4.2) que se ha mantenido
en un baño de agua a no más de 48 °C. En paralelo, se prepara una placa de control con el mismo
diluyente y la misma suspensión del microorganismo, pero sin muestra.

Después de la incubación entre 24 h y 72 h a 32,5 °C ± 2,5 °C, se cuentan las colonias de las placas y se
comparan los recuentos obtenidos para el ensayo y para el control. El diluyente y el método de
recuento son satisfactorios a una dilución 1:10 (cuando se utiliza 1 ml de la suspensión inicial) si el
recuento del ensayo de idoneidad es de, al menos, el 50% del control.

13.3.3 Idoneidad del método de la siembra en superficie

Se mezclan 9 ml de la suspensión inicial en el diluyente neutralizante (o en otro, véase el apartado 5.1)
con 1 ml de la suspensión del microorganismo que contenga entre 10 000 UFC/ml y 30 000 UFC/ml (o
menos, si se dispersan 0,5 ml o 1 ml). Se siembran al menos 0,1 ml en la superficie de una placa de agar
solidificado (5.4.2) (preferiblemente por duplicado). En paralelo, se prepara una placa de control con
el mismo diluyente y la misma suspensión del microorganismo, pero sin muestra.

Después de la incubación entre 24 h y 72 h a 32,5 °C ± 2,5 °C, se cuentan las colonias de las placas y se
comparan los recuentos obtenidos para el ensayo y para el control. El diluyente y el método de
recuento son satisfactorios a una dilución 1:10 (cuando se emplea 1 ml de la suspensión inicial) si el
recuento del ensayo de idoneidad es de, al menos, el 50% del control.

13.3.4 Idoneidad del método de filtración a través de membrana

Se mezcla con el volumen de la suspensión inicial o de la muestra diluida empleada en el ensayo (véase
9.3.2.3) una cantidad adecuada de suspensión estandarizada de microorganismos, que corresponda
aproximadamente a 100 UFC.

Se filtra inmediatamente todo el volumen y se lava la membrana usando volúmenes definidos de agua
(véase 5.1), diluyente (5.2.3) o diluyente neutralizante (5.2.2). Se transfiere la membrana a la
superficie de un medio de agar adecuado (5.4.2).

En paralelo, se prepara un control en las mismas condiciones, pero sin producto. El control se filtra y
se lava en las mismas condiciones.

Después de la incubación entre 24 h y 72 h a 32,5 °C ± 2,5 °C, se cuentan las colonias en las placas y se
comparan los recuentos obtenidos para el ensayo y para el control. El método de filtración a través de
membrana y el diluyente son satisfactorios si el recuento del ensayo de idoneidad es de, al menos, el
50% del control.

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13.4 Idoneidad del método de detección por enriquecimiento

13.4.1 Procedimiento
Se prepara, en tubos que contengan 9 ml de diluyente adecuado para suspensiones bacterianas (véase
5.3), una suspensión estandarizada de cada cepa para obtener un recuento final entre 100 UFC/ml y
500 UFC/ml. Para determinar la concentración final de microorganismos viables en dicha suspensión
estandarizada se transfiere 1 ml de la suspensión a una placa Petri y se vierten entre 15 ml y 20 ml del
medio de agar fundido (5.4.2), que se ha mantenido en un baño de agua a no más de 48 °C.

Se incuba a 32,5 °C ± 2,5 °C entre 20 h y 24 h.

Se prepara por duplicado la suspensión inicial de la muestra (3.3) en las condiciones seleccionadas
para el ensayo (al menos 1 g o 1 ml de producto, volumen definido de caldo de enriquecimiento
(5.4.3.2)) en tubos o recipientes. En un tubo (ensayo de idoneidad), se introducen asépticamente
0,1 ml de suspensión estandarizada de microorganismos. Se mezclan y se incuba cada tubo (ensayo de
idoneidad y control) a 32,5 °C ± 2,5 °C entre 20 h y 24 h.

Para cada tubo o recipiente, y con una pipeta estéril, se transfieren entre 0,1 ml y 0,5 ml (en las
mismas condiciones del ensayo) de mezcla incubada sobre la superficie de una placa Petri (diámetro
de 85 mm a 100 mm) que contenga aproximadamente entre 15 ml y 20 ml de medio de agar adecuado.

Se incuban las placas a 32,5 °C ± 2,5 °C entre 24 h y 72 h.

13.4.2 Interpretación de los resultados

Para cada cepa, se comprueba que la suspensión estandarizada de bacterias contiene entre
100 UFC/ml y 500 UFC/ml.

La neutralización y el método de detección son satisfactorios si se produce un crecimiento

característico, definido como:

– para Staphylococcus aureus: cultivo pigmentado en amarillo; y

– para Pseudomonas aeruginosa: crecimiento del cultivo entre amarillento y verdoso en la placa el
ensayo de idoneidad y sin crecimiento en la placa de control.

Cuando se detecta crecimiento en la placa de control (productos contaminados), la neutralización y el

método de detección son satisfactorios si se recupera el microorganismo inoculado en la placa del
ensayo de idoneidad.

13.5 Interpretación de los resultados del ensayo de idoneidad

La falta de crecimiento en las placas del ensayo de idoneidad indica que todavía existe actividad
antimicrobiana y que es necesaria una modificación en las condiciones del método. Las modificaciones
pueden realizarse mediante un incremento en el volumen de caldo nutritivo manteniendo la misma
cantidad de producto, o con la incorporación de una cantidad suficiente de agente neutralizante en el
caldo nutritivo, o mediante una combinación adecuada de estas modificaciones que permita el
crecimiento de las bacterias.

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Si, a pesar de la incorporación de una cantidad adecuada de agente neutralizante y el incremento

sustancial en el volumen de caldo, todavía no es posible recuperar un cultivo viable como se ha
definido anteriormente, todo indica que no es probable que el producto pueda contaminarse con las
especies de microorganismos indicadas.

14 Informe de ensayo
El informe de ensayo debe contener la siguiente información:

a) toda la información necesaria para una completa identificación del producto.

b) el método empleado;

c) los resultados obtenidos;

d) todos los detalles operativos para la preparación de la suspensión inicial;

e) la descripción del método de neutralización junto con la descripción de los neutralizantes y

medios empleados;

f) la idoneidad del método, incluso si el ensayo se ha realizado por separado;

g) cualquier punto no especificado en este documento, o considerado como opcional, junto con los
detalles de cualquier incidencia que pudiera haber influido en los resultados.

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Anexo A (Informativo)

Otros diluyentes neutralizantes

A.1 Generalidades
Se puede emplear cualquier agente neutralizante para preparar la suspensión inicial si se ha
comprobado y demostrado que es adecuado. Los siguientes diluyentes neutralizantes son ejemplo de
fórmulas adecuadas. En el anexo D se proporciona información general sobre neutralizantes.

A.2 Caldo Eugon LT100 líquido

Véase el apartado 5.4.3.2.

A.3 Diluyente de lecitina y polisorbato (LP)

A.3.1 Composición

– Polipeptona 1,0 g

– Lecitina de huevo 0,7 g

– Polisorbato 80 20,0 g

– Agua 980 ml

A.3.2 Preparación
Se mezclan y disuelven los ingredientes mezclándolos mientras se calientan. Se enfría a 25 °C antes de
dispensar la disolución en recipientes adecuados. Se esteriliza en autoclave a 121 °C durante 15 min.
Después de la esterilización el pH debe ser equivalente a 7,2 ± 0,2 cuando se mide a temperatura
ambiente.

A.4 Caldo Letheen modificado[5]

A.4.1 Composición

– Digerido peptídico de carne 20,0 g

– Digerido pancreático de caseína 5,0 g

– Extracto de carne 5,0 g

– Extracto de levadura 2,0 g

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– Lecitina 0,7 g

– Polisorbato 80 5,0 g

– Cloruro sódico 5,0 g

– Bisulfito sódico 0,1 g

– Agua 1 000 ml

A.4.2 Preparación
Se disuelven en agua hirviendo, sucesivamente, el polisorbato 80 y la lecitina hasta su completa
disolución. Se disuelve el resto de componentes mezclándolos bien mientras se calientan. Se mezcla
suavemente para evitar la formación de espuma. Se dispensa el medio en recipientes adecuados. Se
esteriliza en autoclave a 121 °C durante 15 min. Después de la esterilización el pH debe ser
equivalente a 7,2 ± 0,2 cuando se mide a temperatura ambiente.

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Anexo B (Informativo)

Otros diluyentes

B.1 Generalidades
Se puede emplear cualquier diluyente para preparar la suspensión inicial si se ha comprobado y
demostrado que es adecuado. El siguiente diluyente es un ejemplo de fórmula adecuada.

B.2 Solución de peptona tamponada a pH 7

B.2.1 Composición

– Peptona de carne 1,0 g

– Cloruro sódico 4,3 g

– Fosfato monopotásico 3,6 g

– Fosfato disódico dihidratado 7,2 g

– Agua 1 000 ml

B.2.2 Preparación
Se disuelven los ingredientes en agua hirviendo. Se mezclan. Se enfría a 25 °C antes de dispensar la
disolución en recipientes adecuados. Se esteriliza en autoclave a 121 °C durante 15 min. Después de la
esterilización el pH debe ser equivalente a 7,1 ± 0,2 cuando se mide a temperatura ambiente.

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Anexo C (Informativo)

Otros medios de cultivo

C.1 Generalidades
Se puede emplear cualquier medio de cultivo si se ha comprobado y demostrado que es adecuado. Los
siguientes medios son ejemplos de fórmulas adecuadas.

C.2 Medio de agar para recuento

C.2.1 Medio de agar de Eugon LT 100

Véase el apartado 5.4.3.3.1.

C.2.2 Agar LT 100

C.2.2.1 Composición

– Digerido pancreático de caseína 15,0 g

– Digerido papaínico de soja 5,0 g

– Cloruro sódico 5,0 g

– Lecitina de huevo 1,0 g

– Polisorbato 80 5,0 g

– Octoxynol 9 1,0 g

– Agar 15,0 g

– Agua 1 000 ml

C.2.2.2 Preparación
Se disuelven el polisorbato 80, el octoxynol 9 y la lecitina de huevo en agua hirviendo, sucesivamente,
hasta que su completa disolución. Se disuelven el resto de componentes mezclándolos mientras se
calientan. Se mezcla suavemente para evitar la formación de espuma. Se dispensa el medio en
recipientes adecuados. Se esteriliza en autoclave a 121 °C durante 15 min. Después de la esterilización
y enfriamiento, el pH debe ser equivalente a 7,0 ± 0,2 cuando se mide a temperatura ambiente.

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C.2.3 Medio de agar sobre medio de caseína y soja (agar añadido al caldo SCD)

C.2.3.1 Composición

– Peptona de caseína 17,0 g

– Peptona de soja 3,0 g

– Cloruro sódico 5,0 g

– Fosfato dipotásico hidrogenado 2,5 g

– Glucosa 2,5 g

– Agar 15,0 g

– Agua 1 000 ml

C.2.3.2 Preparación
Se disuelven sucesivamente todos los componentes, o el medio completo deshidratado, en agua
hirviendo hasta su completa disolución. Se dispensa el medio en recipientes adecuados. Se esteriliza en
autoclave a 121 °C durante 15 min. Después de la esterilización y enfriamiento, el pH debe ser
equivalente a 7,2 ± 0,2 cuando se mide a temperatura ambiente.

C.3 Caldos de enriquecimiento

C.3.1 Caldo Letheen modificado [11]

Véase el anexo A.4.

C.3.2 Medio de caseína y soja digeridas – lecitina – polisorbato 80 (caldo SCDLP 80)

C.3.2.1 Composición

– Peptona de caseína 17,0 g

– Peptona de soja 3,0 g

– Cloruro sódico 5,0 g

– Fosfato de hidrógeno dipotásico 2,5 g

– Glucosa 2,5 g

– Lecitina 1,0 g

– Polisorbato 80 7,0 g

– Agua 1 000 ml

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C.3.2.2 Preparación
Se disuelven sucesivamente todos los componentes, o el medio completo deshidratado, en agua
hirviendo hasta su completa disolución. Se dispensa el medio en recipientes adecuados. Se esteriliza en
autoclave a 121 °C durante 15 min. Después de la esterilización y enfriamiento, el pH debe ser
equivalente a 7,2 ± 0,2 cuando se mide a temperatura ambiente.

C.3.3 Caldo neutralizante D/E (caldo neutralizante Dey/Engley) [11]

C.3.3.1 Composición

– Glucosa 10,0 g

– Lecitina de soja 7,0 g

– Na2S2O3·5H2O 6,0 g

– Polisorbato 80 5,0 g

– Digerido pancreático de caseína 5,0 g

– NaHSO3 2,5 g

– Extracto de levadura 2,5 g

– Tioglicolato sódico 1,0 g

– Púrpura de bromocresol 0,02 g

– Agua 1 000 ml

C.3.3.2 Preparación
Se disuelven sucesivamente todos los componentes, o el medio completo deshidratado, en agua
hirviendo hasta su completa disolución. El medio se dispensa en recipientes adecuados. Se esteriliza
en autoclave a 121 °C durante 15 min. Después de la esterilización y enfriamiento, el pH debe ser
equivalente a 7,6 ± 0,2 cuando se mide a temperatura ambiente.

C.4 Medio de agar de caseína y soja digeridas – lecitina – polisorbato 80 (medio

SCDLPA) para la detección

C.4.1 Composición

– Peptona de caseína 15,0 g

– Peptona de soja 5,0 g

– Cloruro sódico 5,0 g

– Lecitina de soja 1,0 g

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– Polisorbato 80 7,0 g

– Agar 15,0 g

– Agua 1 000 ml

C.4.2 Preparación
Se mezclan y disuelven todos los componentes por calentamiento. Se dispensa el medio en recipientes
adecuados. Se esteriliza en autoclave a 121 °C durante 15 min. Después de la esterilización y
enfriamiento, el pH debe ser equivalente a 7,0 ± 0,2 cuando se mide a temperatura ambiente.

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Anexo D (Informativo)

Neutralizantes de la actividad antimicrobiana de los conservantes y

líquidos de lavado

Conservante Compuesto químico capaz de Ejemplos de neutralizantes y líquidos

neutralizar la actividad de lavado adecuados[6]127] (para los métodos
antimicrobiana del conservante de filtración a través de membrana)
Compuestos fenólicos: Lecitina, Polisorbato 80, 30 g/l + lecitina, 3 g/l.
parabenos, Polisorbato 80, Óxido de etileno condensado en alcohol graso,
fenoxietanol, Óxido de etileno condensado en 7 g/l + lecitina, 20 g/l + polisorbato 80, 4 g/l
feniletanol, alcohol graso, Caldo neutralizante D/E a
etc. Tensoactivos no iónicos Líquido de lavado: agua destilada; triptona
Anilidas 1 g/l + NaCl, 9 g/l; polisorbato 80, 5 g/l.
Compuestos de amonio Lecitina, saponina, polisorbato 80, Polisorbato 80, 30 g/l + dodecil sulfato sódico,
cuaternario dodecil sulfato sódico 4 g/l + lecitina, 3 g/l.
Tensoactivos catiónicos Óxido de etileno condensado en Polisorbato 80, 30 g/l + saponina, 30 g/l +
alcohol graso, lecitina, 3 g/l.
Caldo neutralizante D/E a
Líquido de lavado: agua destilada; triptona 1 g/l +
NaCl, 9 g/l; polisorbato 80, 5 g/l.
Aldehídos Glicina, histidina Lecitina, 3 g/l + polisorbato 80, 30 g/l + L-
Agentes liberadores de histidina, 1 g/l.
formaldehído Polisorbato 80, 30 g/l + saponina, 30 g/l + L-
histidina, 1 g/l +
L-cisteína, 1 g/l
Caldo neutralizante D/E a
Líquido de lavado: polisorbato 80, 3 g/l+ L-
histidina, 0,5 g/l.
Compuestos oxidantes Tiosulfato sódico Tiosulfato sódico, 5 g/l.
Líquido de lavado: tiosulfato sódico, 3 g/l.
Isotiazolinonas, Lecitina, saponina Polisorbato 80, 30 g/l + saponina, 30 g/l +
Imidazoles Aminas, sulfatos, mercaptanos, lecitina, 3 g/l.
bisulfito sódico, tioglicolato Líquido de lavado: triptona, 1 g/l + NaCl, 9 g/l;
sódico. polisorbato 80, 5 g/l.
Biguanidas Lecitina, saponina, polisorbato 80 Polisorbato 80, 30 g/l + saponina, 30 g/l +
lecitina, 3 g/l.
Líquido de lavado: triptona, 1 g/l + NaCl, 9 g/l;
polisorbato 80, 5 g/l.
Sales metálicas (Cu, Zn, Bisulfato sódico, L-cisteína Tioglicolato sódico, 0,5 g/l o 5 g/l.
Hg) Compuestos sulfhidrilos, ácido L-cisteína, 0,8 g/l o 1,5 g/l.
Compuestos órgano- tioglicólico Caldo neutralizante D/E a
mercuriales Líquido de lavado: tioglicolato sódico, 0,5 g/l.
a El caldo neutralizante D/E (Caldo neutralizante de Dey/Engley), véase el anexo C.

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Bibliografía

[1] ISO 18415, Cosmetics. Microbiology. Detection of specified and non-specified microorganisms.

[2] ISO 18416, Cosmetics. Microbiology. Detection of Candida albicans.

[3] ISO 21150, Cosmetics. Microbiology. Detection of Escherichia coli.

[4] ISO 22717, Cosmetics. Microbiology. Detection of Pseudomonas aeruginosa.

[5] ISO 22718, Cosmetics. Microbiology. Detection of Staphylococcus aureus.

[6] EN 1040, Chemical disinfectants and antiseptics. Quantitative suspension test for the evaluation of
basic bactericidal activity of chemical disinfectants and antiseptics. Test method and requirements
(phase 1).

[7] CTFA. Microbiology Guidelines, 2001 published by the Cosmetic, Toiletry and Fragrance
Association ISBN 1-882621-32-8.

[8] EP, Microbiological Examination of non-sterile products, 4th edition, 2002 published by the
European Pharmacopoeia.

[9] J.P 14, General tests. Microbial limit test, 2001 published by the Japanese Pharmacopoeia

[10] USP 28, Microbial limit test <61>, 2005 published by the U.S. Pharmacopoeia

[11] FDA. Bacteriological Analytical Manual, 8th edition, 1995 published by the U.S. Food and Drug
Administration,
http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm2006949.htm

[12] Singer S. The use of preservative neutralizers in diluents and plating media. Cosmetics and
Toiletries. 1987, 102 (December) p. 55

[13] COLIPA, Guidelines on Microbial Quality Management, 1997 published by the European Cosmetic,
Toiletry and Perfumery Association (COLIPA).

[14] Atlas R.M. Handbook of Microbiological Media. CRC Press, 1993.

[15] ISO 29621, Cosmetics. Microbiology. Guidelines for the risk assessment and identification of
microbiologically low-risk products.

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Tel.: 914 326 000
[email protected]
www.aenor.com

organismo de normalización español en:

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