CAPÍTULO

Proteínas catalíticas-enzimas
6 Junichi Fujii

OBJETIVOS DE APREN DIZAJE REACCIONES ENZIMÁTICAS

Tras leer este capítulo, el lector debe ser capaz de:
Factores que afectan a las reacciones
■ Describir las características de las reacciones enzimáticas enzim áticas
desde el punto de vista de la energía libre, el equilibrio
y la cinética.
Efecto de la tem p eratu ra
■ Explicar la estructura y la composición de las enzimas,
incluyendo el papel de los cofactores, así como los factores Las enzimas tienen una tem peratura óptima a la cual
que afectan a las reacciones enzimáticas. funcionan de la m anera más eficiente
■ Describir la cinética enzimática según la ecuación En el caso de un catalizador inorgánico, la velocidad de reacción
de Michaelis-Menten y el significado de la constante de
aumenta con la temperatura del sistema, y la temperatura elevada
Michaelis (Km).
puede utilizarse para acelerar una reacción. Por el contrario, las
■ Describir los elementos de la estructura de las enzimas
enzimas normalmente funcionan como catalizadores a una tempe­
que explican su especificidad para el sustrato y su actividad
ratura constante (ambiente o corporal). Sin embargo, en ensayos
catalítica.
in vitro, la actividad enzimática aumenta con la temperatura,
■ Describir los mecanismos reguladores que afectan
a las reacciones enzimáticas, incluyendo la regulación pero luego disminuye a altas temperaturas. Esto sucede porque
por efectores alostéricos y la modificación covalente. las enzimas, al igual que todas las proteínas, se desnaturalizan a
■ Diferenciar los principales tipos de inhibición enzimática desde temperatura elevada y pierden actividad.
el punto de vista de la cinética enzimática.
■ Describir la utilización terapéutica de los inhibidores Energía
enzimáticos y la utilidad diagnóstica de los análisis clínicos
enzimáticos.

Energía
de activación
de la reacdón
no enzimática
Energía de activación
de la reacción
INTRODUCCIÓN enzimática
Reactivos
Casi todas las funciones biológicas se realizan gracias
a reacciones quím icas catalizadas por catalizadores
biológicos llamados enzimas AG Energía disponible
Un metabolismo eficaz está controlado por vías metabólicas de la reacción a temperatura
y presión constantes
ordenadas, secuenciales y ramificadas. Las enzimas aceleran las
Complejo EP
reacciones químicas bajo condiciones fisiológicas. Sin embargo,
una enzima no puede alterar el equilibrio de una reacción, sólo
puede acelerar la velocidad de la misma mediante la disminu­ Coordenada de reacción
ción de la energía de activación de la reacción (fig. 6.1). La re­ Fig. 6.1 Curva de reacción en las reacciones enzimáticas y no
gulación de las actividades enzimáticas permite al metabolismo enzimáticas. Los principios básicos de una reacción que está catalizada
adaptarse rápidamente a las condiciones cambiantes. Aunque por una enzima son los mismos que los de cualquier reacción química.
casi todas las enzimas son proteínas, algunas moléculas de Cuando ocurre una reacción química, el sustrato debe adquirir una
energía de activación hasta un punto denominado «estado de transición
ácido ribonucleico, denominadas ribozimas, presentan también
de la reacción», en el cual el nivel de energía es máximo. Dado que el
actividad catalítica (cap. 3 2 ). Según el análisis del genoma
estado de transición de la reacción catalizada por la enzima tiene una
humano, se calcula que aproximadamente una cuarta parte de energía menor que en la reacción no catalizada, aquélla puede ocurrir
los genes humanos codifican enzimas que catalizan reacciones más rápidamente. Complejo ES, complejo enzima-sustrato; complejo EP,
metabólicas. complejo enzima-producto.

2 0 1 5 . Elsevier España, S.L.U. Reservados todos los derechos

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 CAPÍTULO 6 Proteínas catalíticas-enzim as 55

Efecto del pH o Ul/mg de proteína. La actividad específica de las enzimas es muy

variable entre los tejidos y depende de la función metabólica del
Toda enzima tiene un pH óptimo, puesto que en las
tejido. Por ejemplo, las enzimas implicadas en la síntesis del coles­
reacciones catalíticas participan aminoácidos ionizables,
terol tienen una actividad específica (Ul/mg de tejido) más elevada
como histidina, glutamato y cisteína
en el hígado que en el músculo, lo que coincide con el papel del
Las enzimas citosólicas tienen un pH óptimo en el intervalo de hígado en la biosíntesis del colesterol. La actividad específica de una
pH 7-8. La pepsina, que es secretada por las células gástricas y que enzima es útil para calcular su pureza; cuanto mayor es la actividad
actúa en el jugo gástrico, tiene un pH óptimo de 1,5-2,0; la tripsina específica de una enzima, mayor es su pureza u homogeneidad.
y la quimotripsina tienen un pH óptimo alcalino, compatible con
su actividad digestiva en el jugo pancreático alcalino; las enzimas
lisosomales suelen tener un pH óptimo ácido. La sensibilidad al pH Especificidad de reacción y de sustrato
de las enzimas se debe al efecto del pH sobre la carga iónica de las
La m ayoría de las enzimas son sum am ente
cadenas laterales de aminoácidos de las enzimas. Diversos solutos, específicas, tanto para el tipo de reacción catalizada
como sustratos, productos, iones metálicos y moléculas reguladoras, como para la naturaleza del sustrato o sustratos
también afectan a la velocidad de las reacciones enzimáticas.
La reacción catalizada por un enzima está determinada química­
mente por los residuos aminoácidos que se encuentran en el centro
Definición de actividad enzim ática catalítico de la enzima. En general, el centro activo de la enzima está
formado por el lugar de fijación del sustrato y por el centro catalítico.
Una unidad internacional (UI) de enzima cataliza La especificidad de sustrato está determinada por el tamaño, la es­
la conversión de 1 |xmol de sustrato en producto p or minuto tructura, las cargas, la polaridad y el carácter hidrofóbico de su lugar
A efectos de estandarización, la actividad de una enzima se mide de fijación. Esto se debe a que el sustrato debe fijarse al centro activo
bajo condiciones definidas (temperatura, pH y concentración de como primer paso de la reacción, y preparar así la catálisis. Enzimas
tampón, sustrato y coenzima). La tasa o velocidad (v) de una re­ muy específicas, como la catalasa y la ureasa, que degradan el H20 2
acción enzimática bajo estas condiciones se define como la velocidad y la urea, respectivamente, catalizan una única reacción química
de conversión del sustrato en producto por unidad de tiempo. Una específica, pero algunas tienen una especificidad de sustrato más
unidad de enzima es una medida de la cantidad de enzima. La uni­ amplia. Las serina proteasas constituyen un ejemplo característico
dad internacional (UI) utilizada habitualmente para una enzima es de este grupo de enzimas. Se trata de una familia de enzimas es­
la cantidad de enzima que cataliza la conversión de un micromol de trechamente relacionadas, como las enzimas pancreáticas, quimo­
sustrato en producto por minuto (1 UI = 1 (xmol/min). El k a t a l es tripsina, tripsina y elastasa, que en el centro catalítico contienen un
una unidad internacional para la cantidad de enzima que cataliza la residuo de serina reactivo. Estas enzimas catalizan la hidrólisis de
conversión de 1 mol de sustrato en 1 mol de producto por segundo los enlaces peptídicos de una proteína, sólo cuando el lado carboxilo
(1 kat = 1 mol/s). Dado que el katal generalmente es una cifra muy del enlace es aportado por determinados aminoácidos. Aunque
pequeña, normalmente se utiliza como unidad estándar de actividad tienen unas estructuras y mecanismos catalíticos similares, sus
la unidad internacional, una cifra mucho mayor. especificidades de sustrato son muy distintas a causa de los rasgos
estructurales del centro de fijación del sustrato (fig. 6.2 ).
La actividad específica de una enzima es una medida A todas las enzimas se les asigna un número de clasificación
del núm ero de Ul/mg de proteína enzimática (EC, enzyme classification) de cuatro dígitos para or­
La actividad específica de una enzima, una medida de la actividad ganizar a las diferentes enzimas que catalizan los muchos miles
por cantidad de proteína, se expresa en (xmol/min/mg de proteína de reacciones. El primer dígito indica una de las seis principales

Fig. 6.2 Características de los centros de

Phe
fijación del sustrato en las serina protea­
Quimotripsina
sas quimotripsina, tripsina y elastasa. En
la quimotripsina, un bolsillo hidrofóbico se fija
a residuos aminoácidos aromáticos como la
fenilalanina (Phe). En la tripsina, en el centro
de fijación del sustrato, la carga negativa del
residuo aspartato favorece la escisión en el lado
carboxilo de residuos de lisina (Lys) y argini-
na (Arg) cargados positivamente. En la elastasa, las
cadenas laterales de valina y treonina bloquean
el centro de fijación del sustrato y permiten la
fijación de aminoácidos de cadenas laterales
pequeñas o sin cadena lateral como la glici­
na (Gly). T lugar de hidrólisis enzimática

Bolsillo hidrofóbico

Sitio de escisión — Carbono (C) Nitrógeno (Ñ) Oxígeno (S)

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56 CAPÍTULO 6 Proteínas catalíticas-enzim as

clases de enzimas de la tabla 6.1. Los dos dígitos siguientes indican a la fracción proteica de la enzima. Con frecuencia se modifican
subclases y sub-subclases de sustratos; el cuarto dígito indica el nú­ durante la reacción enzimática, después se disocian de la enzima y
mero de serie de la enzima específica. Las isoenzimas son enzimas son recicladas por otra enzima; las oxidorreductasas, descritas en
que catalizan la misma reacción, pero difieren en su estructura el capítulo 9, tienen coenzimas que pueden ser oxidadas por una
primaria y/o en la composición de la subunidad. Las actividades enzima, y después reducidas y recicladas por otra. Algunas coen­
de algunas enzimas e isoenzimas con especificidad tisular se miden zimas, como la coenzima A, ayudan en el transporte de interme­
en suero con fines diagnósticos (fig. 6.3 y tabla 6.2). diarios de una enzima a otra durante una secuencia de reacciones.
La mayoría de las coenzimas son derivados de las vitaminas. Los
derivados de las vitaminas B, niacina y riboflavina, actúan como
Funciones de las coenzim as coenzimas en las reacciones de las oxidorreductasas. La estructura
y la función de las coenzimas se describen en capítulos sucesivos.
Las moléculas facilitadoras, conocidas como coenzimas, Los grupos prostéticos están firmemente unidos a una enzima,
desempeñan un cometido esencial en las reacciones a menudo de forma covalente, y permanecen asociados a la en­
catalizadas p or enzimas zima durante todo el ciclo catalítico. Para su actividad, algunas
Las enzimas con coenzimas unidas mediante enlace covalente o enzimas necesitan iones inorgánicos (metálicos), denominados
no covalente se denominan holoenzimas. Una holoenzima sin con frecuencia cofactores, como, por ejemplo, las enzimas de la
coenzima se denomina apoenzima. Las coenzimas se dividen en coagulación sanguínea que requieren Ca2+y las oxidorreductasas,
dos categorías. Las coenzimas solubles se unen de forma reversible que utilizan hierro, cobre y manganeso.

Tabla 6.1 Clasificación de las enzimas

CINÉTICA ENZIMÁTICA
Clase Reacción Enzimas

1. Oxidorreductasas Ared+Box -» Aox+Bred Deshidrogenasas, Ecuación de M ichaelis-M enten: un m odelo

peroxidasas sim ple de una reacción enzim ática
[Link] A-B+C —» A + B-C Hexocinasa,
transaminasas Las reacciones enzimáticas tienen m últiples pasos
y constan de varias reacciones parciales
3. Hidrolasas A-B+H20 -> A -H + Fosfatasa alcalina,
B-OH tripsina En 1913, mucho antes de conocerse la estructura de las proteínas,
Leonor Michaelis y Maud Leonora Menten elaboraron un modelo
4. Liasas X - A - B - Y - > A = B+XY Fumarasa, simple para examinar la cinética de las reacciones catalizadas
(sintasas) deshidratasa
por enzimas (fig. 6.4). El modelo de Michaelis-Menten asume que
5. Isomerasas A^ isoA Triosa fosfato isomerasa, el sustrato S se une a la enzima E, formando un intermediario
fosfoglucomutasa esencial, el complejo enzima-sustrato (ES), que luego reacciona en
6. Ligasas A+B+ATP —>A - B+ Piruvato carboxilasa, la superficie de la enzima y se descompone en E +P (producto). El
(sintetasas) ADP+Pi ADN ligasa modelo presupone que E, S y ES se encuentran en equilibrio rápido
uno respecto a otro, de modo que se alcanza rápidamente una

Análisis de isoenzimas
de la LDH por electroforesis en gel

A B C B Infarto agudo de miocardio C Hepatitis aguda

Suero Infarto agudo Hepatitis
normal de miocardio aguda
©
LDH, ------ —
LDH2 ------
i ni-L
i nu ___
LDH5
I aM a
0

Fig. 6.3 Patrones densitométricos de las isoenzimas de la lactato deshidrogenasa (LDH) en el suero de pacientes con diagnóstico
de infarto de miocardio o de hepatitis aguda. Las isoenzimas, que difieren ligeramente de carga, son separadas por electroforesis en acetato de
celulosa, se visualizan mediante un sustrato cromogénico y se cuantifican mediante densitometría. En estos pacientes también aumenta la actividad
total de la LDH sérica. La hemólisis libera LDH de los hematíes y repercute sobre la distribución de las isoenzimas y sobre el diagnóstico diferencial,
por lo que las muestras de sangre han de manejarse con cuidado. La determinación de la LDH para el diagnóstico del infarto de miocardio ha sido
sustituida actualmente por los análisis de las concentraciones plasmáticas de troponina y de otros biomarcadores.

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 CAPÍTULO 6 Proteínas catalíticas-enzim as 57

Tabla 6.2 Algunas enzimas utilizadas en el diagnóstico clínico

Enzima Fuente tisular Aplicación diagnóstica

AST Corazón, músculo Hepatopatía
esquelético, hígado,
cerebro
ALT Hígado Hepatopatía (p. ej., hepatitis)
Amilasa Páncreas, glándulas Pancreatitis aguda, obstrucción
salivales biliar
CK Músculo esquelético, Distrofia muscular, infarto
corazón, cerebro de miocardio
GGT Hígado Hepatitis, cirrosis
Glucosa (mmol/l)
LDH Corazón, hematíes, Linfoma, hepatitis
Fig. 6.4 Propiedades de la glucocinasa y de la hexocinasa. La gluco-
hígado
cinasa y la hexocinasa catalizan la misma reacción: la fosforilación de la
Lipasa Páncreas Pancreatitis aguda, obstrucción glucosa a glucosa-6-fosfato (Glc-6-P). Las enzimas presentan diferencias
biliar en sus propiedades cinéticas y tienen distribuciones hísticas y funciones
fisiológicas diferentes.
Fosfatasa alcalina Osteoblasto Enfermedad ósea, tumores óseos
Fosfatasa ácida Próstata Cáncer de próstata
(PSA)
CONCEPTOS AVANZADOS
ALT, alanina aminotransferasa, conocida antiguamente como glutamato
piruvato transaminasa sérica (SG0T);AST, aspartato aminotransferasa, PROPORCIÓN DE GENES
conocida antiguamente como glutamato oxaloacetato transaminasa DE ENZIMAS EN EL GEN O M A
sérica (SGPT); CK, creatina fosfocinasa; GGT, y-glutamil transpeptídasa; HUM ANO COM PLETO
LDH, lactato deshidrogenasa; PSA, antígeno prostético específico (calicreína 3).
Los datos originales se han obtenido de Venter et a l., Science
2001 ;291:1335, por lo que la clasificación no coincide exactamente
con la nomenclatura de la tabla 6.2. Aproximadamente una cuarta
parte de los genes codifican enzimas. En el total de 26.383 genes
APLICACIONES CLÍNICAS

0
humanos, los nombres de los grupos de enzimas con número y
ESPECIFICIDAD HÍSTICA DE LAS proporción (porcentaje en paréntesis) fueron los siguientes: trans-
ISOENZIMAS DE LA LACTATO ferasa, 610 (2,0); sintasa y sintetasa, 313 (1,0); oxidorreducta­
sa, 656 (2,1); liasa, 117 (0,4); ligasa, 56 (0,2); isomerasa, 163 (0,5);
DESHIDROGENASA
hidrolasa, 1.227 (4,0); cinasa, 868 (2,8), y enzima de ácidos nu­
Una mujer de 56 años ingresó en la unidad de cuidados intensivos. cleicos, 2.308 (7,5).
Había presentado febrícula durante 1 semana, con dolor torácico y
disnea durante las últimas 24 horas. No se apreciaron alteraciones
en la radiografía de tórax ni en el electrocardiograma. Sin embargo,
un análisis de sangre mostró los siguientes resultados: leucocitos,
12.100/mm3(valor normal, 4.000-9.000/mm3); hematíes, 240 x 104/ APLICACIONES CLÍNICAS
mm3 (valor normal, 380-500 x 1 0 4/mm3); hemoglobina, 8,6 g/dl (valor ISOENZIMAS
normal, 11,8-16,0 g/dl), y lactato deshidrogenasa (LDH), 1.400 Ul/I
(valor normal, 200-400 Ul/I). Las concentraciones de otras enzimas En el laboratorio clínico se determinan con frecuencia los perfiles
eran normales. Según estos resultados, el perfil de isoenzimas de de isoenzimas con fines diagnósticos (v. fig. 6.3). La definición de
© Elsevier. Fotocopiar sin autorización es un delito.

LDH y otros datos, finalmente se diagnosticó un linfoma maligno. las isoenzimas a menudo es funcional, es decir, se basa en métodos
de análisis simples y reproducibles basados en la especificidad de
Comentario. La LDH es una enzima tetramérica oxidorreductasa for­ sustrato y que en ocasiones no requieren un conocimiento preciso
mada por dos subunidades diferentes de 35 kDa. El corazón contiene de la estructura de la enzima.
principalmente la subunidad tipo H, y el músculo esquelético y el híga­ El término «isoenzima» se utiliza a menudo para referirse a: 1) va­
do contienen sobre todo la subunidad tipo M; estas subunidades están riantes genéticas de una enzima; 2) proteínas genéticamente in­
codificadas por genes distintos. A partir de estas subunidades pue­ dependientes y con escasa homología; 3) heteropolímeros de dos o
den formarse cinco tipos de isoenzimas tetraméricas: H4 (LDH,), más cadenas polipeptídicas unidas por enlaces no covalentes; 4) en­
H3M, (LDH2), H2M2 (LDH3), H,M3 (LDH4) y M4 (LDHs). Dado que las dis­ zimas no relacionadas que catalizan reacciones similares, como,
tribuciones de las isoenzimas difieren entre los distintos tejidos, es po­ por ejemplo, enzimas conjugadas con diferentes grupos prostéticos o
sible diagnosticar la lesión de un tejido haciendo un análisis de la LDH que requieren coenzimas o cofactores distintos, y 5) formas diferentes
total seguido de la determinación del perfil de isoenzimas (fig. 6.3). de una cadena polipeptídica única, por ejemplo, por variación de la
Véanse los valores hematológicos de referencia en la tabla 5.2 composición de hidratos de carbono, desaminación de aminoácidos
y en el Apéndice 1. o modificación proteolítica.

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58 CAPÍTULO 6 Proteínas catalíticas-enzim as

concentración estacionaria de ES, y que la descomposición del com­

plejo ES en E + P es el paso limitante de la velocidad de catálisis. CONCEPTOS AVANZADOS
La velocidad de esta reacción depende directamente de la energía GLUCO CIN ASA Y HEXOCINASA
de activación de la reacción catalizada por la enzima (ñg. 6.1 ).
La constante catalítica, k^t, conocida también como número de La hexocinasa cataliza en todas las células el primer paso del meta­
bolismo de la glucosa, la reacción de fosforilación de la glucosa por el
recambio, es una constante de velocidad que describe la rapidez
trifosfato de adenosina (ATP) para formar glucosa-6-fosfato (Glc-6-P):
con la que una enzima puede catalizar una reacción. La fecat se de­
fine com o el núm ero de m oléculas de su strato convertidas glucosa+ATP -> glucosa 6 - fosfato+ ADP
en producto por molécula de enzima y por unidad de tiempo.
Esta enzima tiene una Kmbaja para la glucosa (0,2 mmol/l) y es
La proporción de ES, respecto al número total de moléculas de
inhibida alostéricamente por su producto, Glc-6-P. Puesto que las
enzima [E]t, es decir, la relación [ES]/[E]t, limita la velocidad (v)
concentraciones normales de glucosa en sangre son de aproximada­
de una enzima, de manera que: mente 5 mmol/l y las concentraciones intracelulares de 0,2-2 mmol/l,
la hexocinasa cataliza de modo eficiente esta reacción (50-90% de
v=t„,[ES] V'máx) en condiciones normales (p. ej., en el músculo).
Los hepatocitos, que almacenan glucosa en forma de glucógeno,
y las células 0 del páncreas, que regulan el consumo de glucosa en
Puesto que E, S y ES se encuentran en equilibrio químico, la enzima
los tejidos y su almacenamiento en el hígado mediante la secreción
alcanza una velocidad máxima (Fmáx) a concentraciones de sus­
de insulina, contienen una isoenzima denominada glucocinasa.
trato [S] muy elevadas (saturantes), cuando [ES] « [E]t (enzima La glucocinasa cataliza la misma reacción que la hexocinasa, pero
total). Por tanto: tiene una Kmmás alta para la glucosa (10 mmol/l) y no es inhibida por
Para la disociación del complejo ES, la ley de acción de masas el producto Glc-6-P. Dado que la glucocinasa tiene una Kmmuy supe­
implica que: rior a la hexocinasa, a medida que las concentraciones de glucosa en
sangre aumentan después de una comida, la glucocinasa fosforila la
glucosa de un modo cada vez más eficiente (v. fig. 6.4). Una de las
„ [E][S]
funciones fisiológicas de la glucocinasa en el hígado es proporcionar
Glc-6-P para la síntesis de glucógeno, una forma de almacenamiento
de la glucosa. En las células 0 del páncreas, la glucocinasa funciona
Teniendo en cuenta que: como un sensor de glucosa y determina el umbral para la secreción
de insulina. Los ratones que no tienen glucocinasa en las células 0
[E]t =[E]+[ES] pancreáticas mueren a causa de hiperglucemia profunda durante los
primeros 3 días tras nacer, ya que su páncreas no secreta insulina.
puede observarse que:

[ES]_ [S]
mientras que aquellas con una Kmbaja operan de modo eficiente
[E]t K m+[ S] con cantidades pequeñas de sustrato.
El modelo de Michaelis-Menten se basa en las siguientes
donde Km = Kd suposiciones:
Por tanto, la velocidad de la reacción enzimática, v, se obtiene así:
■ E, S y ES están en un equilibrio rápido.
■ E y ES son las únicas formas presentes de la enzima.
V_ ^ [E ],[S ]
■ La conversión de ES en E + P es un paso irreversible
fc„+[S]
y limitante. Si bien todas las reacciones catalizadas por
enzimas en teoría son reversibles, normalmente se miden
Puesto que t [E]t corresponde a la velocidad máxima, Fmáx, que las velocidades iniciales, es decir, cuando la concentración
se alcanza a concentraciones elevadas de sustrato (saturantes), de producto es insignificante y, por tanto, la velocidad de la
obtenemos la ecuación de Michaelis-Menten: reacción inversa también lo es.

Es importante señalar que se han desarrollado modelos cinéticos

similares para describir la cinética de enzimas con múltiples sus­
tratos y productos.

El análisis de las ecuaciones anteriores indica que la

constante de Michaelis (K ,J se expresa en unidades de U tilización de las gráficas
concentración y corresponde a la concentración de sustrato de Lin ew eave r-B u rk y Eadie-H ofstee
en la que v es el 50% de la velocidad m áxim a, es decir,
[ES] = 1/2 [E ],y v = Vmáx/2 (JUj. 6.4) Análisis gráficos alternativos perm iten determ inar
Km es una constante útil para calcular la afinidad de una enzima con m ayor exactitud la K my la Vmáxde una enzima
por su sustrato. Las enzimas con una Kmalta necesitan una con­ En una gráfica de velocidad de reacción frente a concentración de
centración de sustrato elevada para que su actividad sea eficiente, sustrato, la primera se acerca a la velocidad máxima (V ^ ) de modo

[Link]
 CAPÍTULO 6 Proteínas catalíticas-enzim as 59

A Gráfica de velocidad frente a sustrato B Gráfica de Lineweaver-Burk C Gráfica de Eadie-Hofstee

Fig. 6.5 Curvas de cinética enzimática. Representaciones cinéticas de las propiedades enzimáticas. (A) Representación gráfica de Michaelis-Menten
de velocidad (VJ frente a concentración de sustrato [S]. (B) Representación gráfica de Lineweaver-Burk. (C) Representación gráfica de Eadie-Hofstee.

asintótico (fig. 6.5A), por lo que es difícil obtener valores precisos

de Fmáx y. por tanto, de Km(concentración de sustrato requerida APLICACIONES CLINICAS
para obtener la mitad de la actividad máxima) por extrapolación DETERM INACIÓN DE LA ACTIVID A D
simple. Para solucionar este problema se han desarrollado varias ENZIM ÁTICA EN MUESTRAS
transformaciones lineales de la ecuación de Michaelis-Menten. CLÍNICAS
En los laboratorios clínicos, la actividad enzimática se mide en pre­
G ráfica de Linew eaver-B urk sencia de concentraciones saturantes de sustrato(s) y de coenzima.
Se registran las velocidades iniciales para minimizar los errores de­
La gráfica de Lineweaver-Burk, o de dobles recíprocos, se obtiene
rivados de la reacción inversa. Bajo estas condiciones v~ Vmix, y la
a partir de los recíprocos de la ecuación de Michaelis-Menten actividad enzimática es directamente proporcional a la concentración
(fig. 6.5B). Reorganizando la ecuación, obtenemos: de enzima. La cantidad de enzima (actividad enzimática) se expresa
habitualmente en Ul/ml de plasma, suero o líquido cefalorraquídeo,
1_ 1 km 1 más que por mg de proteína. Para las comparaciones entre labora­
<— torios, deben estandarizarse las condiciones del análisis enzimático,
v~ F F [S]
por ejemplo, especificando las concentraciones utilizadas de sustrato
y coenzima, el tampón y su concentración, los iones y la fuerza iónica,
Esta ecuación proporciona una línea recta (y = mx + b), con el pH y la temperatura.
y = 1/v, x = 1/[S], m = pendiente, b = intersección con y. Por tan­ La mayoría de las muestras clínicas se recogen en ayunas, lo que
to, una gráfica de 1/vfrente a 1/[S] (fig. 6.5B) tiene una pendiente asegura la consistencia en la determinación de los analitos cuya
de Km/Vmáx, una intersección 1/v de 1 /Vmáx y una intersección concentración pueda variar durante el día o de otros, como glucosa
1/[S] de - 1 /K m. Aunque la representación gráfica de Lineweaver- o lípidos, cuyas concentraciones varían en respuesta a la ingesta
Burk se utiliza mucho en el análisis cinético de las reacciones de alimentos. Las muestras lipémicas son turbias y pueden ofrecer
enzimáticas, el hecho de calcular los valores recíprocos de los datos datos poco fiables por fluorimetría o espectrometría. Para evitar
estos problemas, deben extraerse los lípidos de las muestras clínicas,
induce a que un pequeño error experimental, especialmente a
normalmente con un disolvente orgánico.
concentraciones de sustrato bajas, pueda provocar un gran error
en los valores de Km y de Fmáx determinados gráficamente. Una
desventaja adicional es que los datos importantes obtenidos a
altas concentraciones de sustrato se concentran en una estrecha
región cerca del eje 1 /v.
MECANISMO DE ACCION ENZIMATICA
© Elsevier. Fotocopiar sin autorización es un delito.

G ráfica de Eadie-H ofstee

Las reacciones enzimáticas im plican a grupos funcionales
Una segunda forma lineal muy utilizada de la ecuación de en enzimas, coenzimas, sustratos y productos
Michaelis-Menten es la representación gráfica de Eadie-Hofstee El mecanismo de acción de las distintas enzimas varía signifi­
(fig. 6.5C), que se describe mediante la siguiente ecuación: cativamente. En algunos casos, la catálisis se realiza sobre el
sustrato unido a la enzima de manera reversible y no covalente.
v=V - K x — En otros casos se forma un intermediario covalente, y luego se
“ ” [S] libera de la enzima, y en otros toda la acción tiene lugar en una
coenzima que forma un enlace covalente con el sustrato. En
En este caso, la representación de v frente a v/[S] tiene un eje y otros capítulos del libro se describen los mecanismos de acción
(intersección de v) de Fmáx, una intersección del eje x (v/[S]) de de varias enzimas.
VmJ Km y una pendiente de —Km. La gráfica de Eadie-Hofstee no Las serina proteasas (v. fig. 6.2) son un ejemplo de enzimas
comprime los datos a concentraciones de sustrato elevadas. que forman un intermediario covalente con sus sustratos. Estas

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60 CAPÍTULO 6 Proteínas catalíticas-enzim as

enzimas escinden los enlaces peptídicos en las proteínas y, como enlaces peptídicos que contienen aminoácidos aromáticos, como
sucede en todas las reacciones enzimáticas, grupos funcionales la fenilalanina. En la figura 6 .7 se esquematiza el mecanismo
de las cadenas laterales de los aminoácidos participan en la de la reacción enzimática, que muestra la formación y escisión de
reacción catalizada por la enzima. En la familia de las serina un intermediario ligado a una enzima.
proteasas, un residuo de serina en el centro activo cataliza la La tripsina y la elastasa, otras dos enzimas digestivas con dife­
escisión del enlace peptídico. El grupo funcional de la serina, rentes especificidades de aminoácidos (fig. 6.2 ), son similares a
un alcohol primario, no es uno de los grupos funcionales más la quimotripsina en muchos aspectos. Alrededor del 40% de las
reactivos en química orgánica. Para aumentar su actividad en secuencias de aminoácidos de las tres enzimas son idénticas y sus
las serina proteasas, este residuo de serina forma parte de una estructuras tridimensionales son muy similares. Las tres enzimas
«tríada catalítica», en el caso de la quimotripsina: Asp102, His57 contienen la tríada catalítica aspartato-histidina-serina y son
y Ser195 (fig. 6.6). Las interacciones concertadas de los enlaces inactivadas por la reacción de los fluorofosfatos con el residuo
de hidrógeno entre estos aminoácidos aumentan la nucleoñlia de serina activo. El gas neurotóxico, diisopropilfluorofos-
del residuo de serina de manera que puede atacar al átomo de fato, forma un éster serina-diisopropilfosfato estéricamente
carbono carbonilo del enlace peptídico del sustrato. La quimo­ obstaculizado, que es hidrolizado muy lentamente e inhibe a las
tripsina es específica para la escisión en el lado carboxilo de los serina proteasas.

INHIBICION ENZIMATICA
Entre las num erosas sustancias que afectan a los procesos
metabólicos, los inhibidores enzimáticos tienen una especial
importancia. Muchos fármacos, naturales o sintéticos, actúan
como inhibidores enzimáticos. Además, los metabolitos de estos
compuestos también pueden inhibir la actividad enzimática.
Aunque la mayor parte de los inhibidores enzimáticos actúan de
manera reversible, también existen inhibidores irreversibles que
modifican permanentemente las enzimas diana. Mediante las re­
presentaciones gráficas de Lineweaver-Burk es posible distinguir
tres formas de inhibición reversible: competitiva, acompetitiva y
no competitiva.

° Hidró9eno ''v ¿ h ..v # Los inhibidores competitivos producen un aumento

0 Nitrógeno \ J aparente de la Km, sin m odificar la Vmax
Una enzima puede ser inhibida competitivamente por sustancias
Q ) Oxígeno ^er
cuya estructura química es similar a la del sustrato. Estos com­
Fig. 6.6 Modelo esquemático de una tríada catalítica de una serina puestos se unen al centro activo y compiten con el sustrato por el
proteasa. centro activo de la enzima; producen un aumento aparente en la

Fig. 6.7 Mecanismo de acción de la quimotripsina. El residuo de serina del centro activo ataca al grupo carbonilo del enlace peptídico en el lado
carboxilo de un residuo de fenilalanina. El péptido carboxiterminal se libera y el péptido aminoterminal sigue siendo un intermediario ligado a la
enzima; el péptido aminoterminal está unido covalentemente a la fenilalanina carboxiterminal esterificada con el residuo de serina del centro activo.
El enlace éster es hidrolizado en el segundo paso de la reacción para liberar el péptido aminoterminal y regenerar la enzima activa.

[Link]
 CAPÍTULO 6 Proteínas catalíticas-enzim as 61

S^ ES-
CONCEPTOS CLÍNICOS
V esi
TRATAM IENTO DE LA HIPERTENSIÓN
Sustrato Inhibidor CON UN INHIBIDOR DE LA ENZIMA
CONVERTIDORA DE ANGIOTEN SINA
W O
(IECA)
Un hombre de 50 años ingresó en el hospital con fatiga general, rigidez
de hombro y cefalea. Medía 1,80 m y pesaba 84 kg. Su presión arterial
era de 196/98 mmHg (valor normal, inferior a 140/90 mmHg; valor
óptimo, inferior a 120/80 mmHg) y la frecuencia del pulso de 74. Se le
La enzima (lugar
diagnosticó hipertensión y se le administró captopril (un IECA). A los
de unión especifico)
reconoce al sustrato 5 días de tratamiento la presión arterial volvió a valores casi normales.
y al inhibidor
Comentario. En el riñón, la renina convierte el angiotensinóge-
no en angiotensina I, que luego es escindida proteolíticamente a
angiotensina II por la enzima convertidora de angiotensina (ECA).
+ inhibidor La angiotensina II aumenta la retención renal de fluidos y de electroli­
tos, lo que contribuye a la aparición de hipertensión. En consecuencia,
la inhibición de la actividad de la ECA es un objetivo importante del
tratamiento de la hipertensión. El captopril inhibe competitivamente
la ECA y reduce la presión arterial. (V. también cap. 23.)
Control
no inhibido

H
Fig. 6.8 Inhibición enzimática competitiva. (A) Gráfica de velocidad
CONCEPTOS CLÍNICOS
frente a concentración de sustrato. (B) Mecanismo de la inhibición LA INTOXICACIÓN POR M ETANOL
competitiva. (C) Representación gráfica de Lineweaver-Burk en presencia PUEDE TRATARSE M EDIANTE
de un inhibidor competitivo. (D) Representación gráfica de Eadie-Hofstee
LA ADM INISTRACIÓN DE ETANOL
en presencia de un inhibidor competitivo. K'mes la Km aparente en
presencia del inhibidor.
Un hombre de 46 años acudió a urgencias 7 horas después de haber
consumido una gran cantidad de alcohol de contrabando. No podía
ver con claridad y presentaba dolor abdominal y lumbalgia. Las prue­
Km, pero ningún cambio en la Fmáx(ñg. 6.8). La inhibición no es el
bas de laboratorio indicaron acidosis metabólica grave, osmolalidad
resultado de un efecto sobre la actividad enzimática, sino sobre
sérica de 465 mmol/kg (intervalo de referencia, 285-295 mmol/kg) y
el acceso del sustrato al centro activo. El esquema de reacción de concentración sérica de metanol de 4,93 g/l (156 mmol/l). Mediante
la inhibición competitiva es: un tratamiento intensivo a base de una perfusión continua de etanol,
bicarbonato y hemodiálisis, sobrevivió y recuperó la visión.
E+S=F^ES->EfP
Comentario. La intoxicación por metanol es infrecuente, aunque
+i^ i
sumamente peligrosa. La intoxicación por etilenglicol es más habitual
y presenta unas características clínicas similares. En la intoxicación por
La constante de inhibición (K¡) es la constante de disociación metanol, el síntoma inicial más importante son los trastornos visuales.
del complejo enzima-inhibidor (El) y, cuanto menor es la K¡, En estos pacientes, los resultados de laboratorio consisten en acidosis
más eficiente es la inhibición de la actividad enzimática. Sin metabólica grave y aumento de la concentración plasmática de soluto
embargo, independientemente de la K¡, la v elocidad de la (metanol). El metanol es metabolizado lentamente a formaldehído,
© Elsevier. Fotocopiar sin autorización es un delito.

re a cció n catalizada por un a en /im a en p resen cia de un que, a continuación, es metabolizado con rapidez a formato por la al­
inhibidor com petitivo puede aum entarse increm entando cohol deshidrogenasa. Durante la intoxicación por metanol se acumula
la c o n c e n tr a c ió n de s u s tra to , porque el sustrato, a una formato, que es el responsable de la acidosis metabólica observada en
el estadio inicial de la intoxicación. En estadios posteriores, también
concentración más alta, compite de forma más eficaz con el
puede acumularse lactato a causa de la inhibición de la respiración por
inhibidor.
el formato. El etanol es metabolizado por la alcohol deshidrogenasa,
que fija etanol con una afinidad mucho mayor que el metanol o el
Los inhibidores acompetitivos dan lu ga r a una etilenglicol. Por tanto, el etanol es un producto útil para conseguir una
dism inución aparente de la Vmáx inhibición competitiva e impedir que el metanol y el etilenglicol sean
metabolizados a compuestos tóxicos. El metanol y el etilenglicol no me-
Un inhibidor acompetitivo se fija únicamente al complejo enzima-
tabolizados se excretan gradualmente por la orina. Así, el tratamiento
sustrato, pero no a la enzima libre. La siguiente ecuación muestra
precoz con etanol, junto con la administración de productos alcalinos
el esquema de reacción de la inhibición acompetitiva. En este caso, para combatir la acidosis y la hemodiálisis para eliminar el metanol y sus
K¡ es la constante de disociación para el complejo enzima-sustrato- metabolitos tóxicos, se asocia a un buen pronóstico.
inhibidor (ESI).

[Link]
62 CAPÍTULO 6 Proteínas catalíticas-enzim as

en el centro activo. Los aductos de mercurio a menudo pueden

: ES revertirse mediante compuestos tiol. En la ingesta accidental de
*E+ P metales pesados, a veces se administran como antídoto huevos o
clara de huevo. La proteína de la clara del huevo, la ovoalbúmina,
El inhibidor causa una disminución de la Vmáx, puesto que una es rica en grupos sulfhidrilo; atrapa los iones de metales libres e
fracción del complejo enzima-sustrato es desviada por el inhibidor impide que se absorban en el aparato gastrointestinal.
hacia el complejo ESI inactivo. La unión del inhibidor y el aumen­ En muchos casos se utilizan inhibidores irreversibles para iden­
to del complejo ESI también pueden afectar a la disociación del tificar los residuos aminoácidos del centro activo que participan en
sustrato, causando un descenso aparente de la Km, es decir, un la catálisis enzimática y, asimismo, para conocer mejor su mecanis­
aumento aparente de la afinidad por el sustrato. mo de acción enzimática. Mediante secuenciación o análisis espec-
trométrico de masas del péptido modificado, es posible identificar
Los inhibidores no competitivos pueden unirse a sitios el residuo aminoácido específico que ha sido modificado por el
de unión fu era del centro activo y m odificar tanto la K m inhibidor y que participa en la catálisis.
como la Vmáx de la enzima
Un inhibidor no competitivo puede fijarse tanto a la enzima libre
como al complejo enzima-sustrato, como, por ejemplo, el sitio CONCEPTOS AVANZADOS
alostérico. Por tanto, la inhibición no competitiva es más compleja
que otros tipos de inhibición y puede alterar tanto la Kmcomo la
INHIBICIÓN ENZIM ÁTICA:
Vmáxde una reacción enzimática. La siguiente ecuación muestra el
INHIBICIÓN DEL ESTADO DE
esquema de reacción observado para la inhibición no competitiva. TRANSICIÓN Y SUSTRATO SUICIDA
Las enzimas catalizan reacciones mediante la inducción del estado
E + S ^ ES E+ P de transición de la reacción. Por tanto, debería ser posible fabricar
moléculas que se uniesen fuertemente a la enzima imitando el es­
+ +
tado de transición del sustrato. Los estados de transición no pueden
ii T
1 aislarse independientemente, ya que no son disposiciones estables
de los átomos, y algunos enlaces sólo están parcialmente formados
11 11
o están rotos. Sin embargo, pueden sintetizarse análogos para algu­
El ESI nas enzimas que son estables, si bien tienen todavía algunas de las
características estructurales del estado de transición.
Muchos fárm acos y venenos inhiben las enzimas de modo La penicilina (fig. 6.9) es un buen ejemplo de un análogo del estado
irreversible de transición. Inhibe a la transpeptidasa que entrecruza las tiras de
peptidoglucanos de la pared bacteriana, el último paso de la síntesis
Las prostaglandinas actúan como mediadores fundamentales de
de la pared celular de las bacterias. Posee un anillo lactámico de 4 miem­
la inflamación. Bajo condiciones de inflamación, su síntesis es bros que simula el estado de transición del sustrato normal. Cuando la
iniciada por una oxidación mediada por la ciclooxigenasa, con penicilina se fija al centro activo de la enzima, se abre su anillo lactámico
una posterior ciclación del araquidonato (cap. 40). Los compuestos y se forma un enlace covalente con un residuo de serina presente en
que inhiben a la ciclooxigenasa tienen actividad antiinflamatoria. el centro activo. La penicilina es un potente inhibidor irreversible de la
El ácido acetilsalicílico (aspirina) inhibe la actividad de la cicloo­ síntesis de la pared bacteriana y hace que las bacterias sean osmótica­
xigenasa acetilando la Ser530, lo cual bloquea el acceso del araqui­ mente frágiles e incapaces de sobrevivir en el organismo.
donato al centro activo de la enzima. Otros antiinflam atorios
no esteroideos (AINE), como la indometacina, inhiben a la
ciclooxigenasa bloqueando de modo reversible el lugar de unión Cefalosporinas
del araquidonato.
El disulfíram es un fármaco que se usa en el tratamiento
- C — CH
del alcoholismo. El alcohol es metabolizado en dos pasos has­ I
I I
ta convertirse en ácido acético. La primera enzima, la alcohol P— N~.
y '
deshidrogenasa, produce acetaldehído, que es convertido pos­ y
teriormente en ácido acético por la aldehido deshidrogenasa. Esta
última enzima tiene un residuo de cisterna en el centro activo que
es modificado irreversiblemente por el disulfíram, provocando Anillo Anillo
P-lactámico de tiazolidina p-lactámico de dihidrotiazina
una acumulación de alcohol y de acetaldehído en la sangre. Los
pacientes que toman disulfíram se encuentran mal a causa de la Fig. 6.9 Estructura de la penicilina que muestra el enlace peptídico
acumulación de acetaldehído en la sangre y los tejidos, lo que les reactivo del anillo p-lactámico y la estructura central de las cefalos­
lleva a evitar el consumo de alcohol. porinas. Las penicilinas contienen un anillo p-lactámico fusionado a
Los r e a c t i v o s a l q u i la n t e s , com o la y od oacetam i- un anillo de tiazolidina. Asimismo, las cefalosporinas son otra clase de
compuestos que contienen el anillo p-lactámico fusionado con un anillo
da (ICH2CONH2)>modifican el residuo de la cisterna esencial del cen­
dihidrotiazínico de seis miembros. Gracias a su eficacia y a la ausencia
tro activo e inhiben así de modo irreversible la actividad catalítica de toxicidad, los compuestos p-lactámicos se utilizan con frecuencia
de algunas enzimas. Los metales pesados, como las sales de mer­ como antibióticos. Las bacterias con p-lactamasa, que destruye el anillo
curio y de plomo, también inhiben enzimas con residuos sulfhidrilo p-lactámico, son resistentes a estos antibióticos.

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 CAPÍTULO 6 Proteínas catalíticas-enzim as 63

la tripsina activa digiere otros zimógenos, como procarboxipepti-

REGULACIÓN DE LA ACTIVIDAD dasa, proelastasa y quimotripsinógeno, así como otras moléculas
de tripsinógeno (cap. 10). Durante la coagulación sanguínea y
ENZIMÁTICA la fibrinólisis (disolución de los coágulos) se observan cascadas
proteolíticas similares (cap. 7).
En las vías metabólicas de m últiples pasos, la velocidad
global de la reacción está limitada por el paso más lento
Para regular de la manera más eficiente una vía metabólica, lo
mejor es controlar las enzimas clave que participan en el «paso Regulación alostérica de las enzim as
limitante de la velocidad». Por regla general, en la regulación de la que catalizan los pasos lim itan tes
actividad enzimática participan cinco mecanismos independientes. en las v ía s m etabólicas
■ La expresión de la proteína enzimática a partir del gen
Las enzimas alostéricas m uestran curvas sigmoideas,
correspondiente cambia en respuesta a las variaciones
más que hiperbólicas, en las gráficas de velocidad
del entorno celular o a las demandas metabólicas.
de reacción fren te a concentración de sustrato
■ Las enzimas pueden activarse o inactivarse de modo
irreversible por enzimas proteolíticas. La curva de saturación de sustrato de una enzima «isostérica»
■ Las enzimas pueden ser activadas o inactivadas (forma única) es de tipo hiperbólico (v. fig. 6.5A). En cambio, las
de modo reversible por modificaciones covalentes, enzimas alostéricas a menudo presentan unas curvas de velocidad
como la fosforilación. de reacción frente a concentración de sustrato [S] en forma de
■ La regulación alostérica modula la actividad de las enzimas S (sigmoideas) (fig. 6.10). Una molécula de efector alostérico (otro
clave a través de la fijación reversible de moléculas lugar) se fija a la enzima en un sitio distinto y físicamente alejado
pequeñas en lugares distintos del centro activo; este proceso del centro de fijación del sustrato y afecta a la unión del sustra­
es relativamente rápido y, por tanto, representa la primera to (Km), a la Kcat, o a ambas. En algunos casos, el sustrato puede
respuesta de las células a las condiciones cambiantes. ejercer efectos alostéricos, lo que se conoce como efecto homo-
■ La degradación de las enzimas por proteasas intracelulares trópico. Si el efector alostérico es distinto del sustrato, se conoce
en el lisosoma, o por proteasomas en el citosol, también como efecto heterotrópico. Los efectos homotrópicos se observan
determina las vidas medias de las enzimas y, en consecuencia, cuando la reacción de una molécula de sustrato con una enzima
la actividad enzimática durante un período mucho más multimérica afecta a la fijación de una segunda molécula de sus­
prolongado. trato en un centro activo distinto de la enzima. La interacción
entre las subunidades hace que la fijación del sustrato sea coo­
A pesar de haberse llevado a cabo múltiples estudios, aún sigue perativa y que la curva v frente a [S] tenga forma sigmoidea. Este
siendo imposible deducir con precisión la actividad de enzimas con­ efecto es, en esencia, idéntico al descrito para la fijación del 0 2 a
cretas en el cuerpo, ya que numerosos factores, como las concen­ la hemoglobina (cap. 5), con la excepción de que, en el caso de las
traciones de sustrato, el pH y los efectores alostéricos, cambian enzimas, la fijación del sustrato ocasiona una reacción catalizada
con el tiempo en condiciones fisiológicas. Los avances tecnológicos por una enzima.
permiten en la actualidad medir cuantitativamente y de manera
simultánea miles de metabolitos en los tejidos; este campo en
desarrollo se denomina metabolómica (cap. 36). Aplicando los
instrumentos de la enzimología básica y de la metabolómica, a la
larga podremos medir el flujo endógeno a través de vías metabó­
licas complejas in vivo.

A ctivació n pro teolítica de las enzim as

ú d igestivas
-o
3 A lgunas enzimas se alm acenan en un compartimento
g u orgánulo subcelular específico en fo rm a de precursores
| inactivos
8 Varias enzimas digestivas se almacenan como zimógenos inac-
Aspartato (mmol/l)
§ tivos o proenzimas en las vesículas secretoras del páncreas. Los
I zimógenos son secretados al jugo pancreático después de una Fig. 6.10 Regulación alostérica de la aspartato transcarbamoilasa
•2 comida y se activan en el tubo gastrointestinal. El tripsinógeno (ATCasa). Gráfica de velocidad (v) frente a concentración de sustrato en
§ se convierte en tripsina por acción de la enteropeptidasa intes- presencia de un activador o de un inhibidor alostérico. La aspartato trans­
carbamoilasa (ATCasa) es un ejemplo de enzima alostérica. El aspartato
c2 tinal. La enteropeptidasa, localizada en la superficie interna
(sustrato) regula homotrópicamente la actividad de la ATCasa, dando
del duodeno, hidroliza un péptido N-terminal del tripsinógeno una cinética sigmoidea. La CTP, un producto metabólico final, inhibe
inactivo. La reordenación de la estructura terciaria da lugar a heterotrópicamente la ATCasa; en cambio, el ATP, un precursor, activa
© la forma proteolíticamente activa de la tripsina. A continuación, heterotrópicamente esta enzima.

[Link]
64 CAPÍTULO 6 Proteínas catalíticas-enzim as

CONCEPTOS CLÍNICOS CONCEPTOS CLÍNICOS

LA HEMOFILIA ESTÁ CAUSADA INTOXICACIÓN
POR UN DEFECTO EN LA ACTIVACIÓN POR INSECTICIDAS
DELZIM ÓGENO
Un hombre de 55 años estaba pulverizando un campo de arroz con
Un niño acudió al hospital a causa de una hemorragia muscular que un insecticida con fluorofosfatos orgánicos. Presentó un cuadro
afectaba al nervio femoral. Los resultados de laboratorio indicaron clínico brusco, con cefalea frontal, dolor ocular y disnea, es decir,
un trastorno de la coagulación sanguínea, una hemofilia A, causada los signos característicos de exposición excesiva a fluorofosfatos
por deficiencia del factor VIII. Se administró factor VIII al paciente orgánicos tóxicos. Una vez en el hospital, se le trató con una inyección
para normalizar la coagulación. intravenosa de 2 mg de sulfato de atropina, tras la que se recuperó
gradualmente.
Comentario. La formación de un coágulo sanguíneo es el resultado
final de una cascada de reacciones de activación de zimógenos. En Comentario. Los fluorofosfatos orgánicos forman complejos co­
el proceso participan más de una docena de proteínas diferentes, valentes entre el grupo fosforilo y la enzima tanto con las serina
conocidas como factores de la coagulación. En el paso final, el coá­ proteasas como con las esterasas como la acetilcolinesterasa, que
gulo sanguíneo se forma por la conversión de una proteína soluble, inhiben las enzimas de forma irreversible. Durante la actividad
el fibrinógeno (factor I), en un producto fibroso insoluble (fibrina) neuromuscular, la acetilcolinesterasa pone fin a la acción de la
que actúa como matriz del coágulo. Este último paso está catalizado acetilcolina (cap. 41) hidrolizándola a acetato y colina. La inhibición
por una serina proteasa, la trombina (factor lia). La hemofilia es un de esta enzima prolonga la acción de la acetilcolina y provoca una
trastorno de la coagulación sanguínea causado por un defecto en estimulación neuromuscular constante. La atropina bloquea de
alguno de los factores de la secuencia de la coagulación. La hemofi­ forma competitiva la unión de acetilcolina y la estimulación muscular
lia A, la forma más común de la hemofilia (85%), se debe a un defecto en la unión neuromuscular.
del factor de coagulación VIII (v. cap. 7).

dificulta la reacción de otro sustrato en otro centro activo. Dado

CONCEPTOS AVANZADOS que la afinidad de la enzima varía con la concentración de sus­
LOS ANÁLOGOS trato, no puede describirse mediante una cinética simple basada
DE LOS NUCLEÓSIDOS SE UTILIZAN en la ecuación de Michaelis-Menten. En su lugar, se caracteriza
COMO ANTIVIRALES por una concentración de sustrato que produce la mitad de la
velocidad máxima, [S]0,5, y el coeficiente de Hill (H) (cap. 5).
Los análogos de los nucleósidos, como el aciclovir y el ganciclovir, Los valores de H son superiores a 1 en los casos de cooperatividad
se han utilizado en el tratamiento de las infecciones por el virus positiva e inferiores a 1 en los casos de cooperatividad negativa.
del herpes simple (VHS), el virus de la varicela-zóster (VVZ) y el
En la mayoría de las enzimas alostéricas, las concentraciones de
citomegalovirus (CMV). Se trata de profármacos que son activados
sustrato intracelulares se encuentran cerca de la [S]0,5, de modo
por fosforilación y que ponen fin a la síntesis de ADN viral inhi­
que la actividad de la enzima responde a ligeras variaciones en la
biendo en el virus la reacción de la ADN polimerasa. La timidina
cinasa (TK) de los virus, más correctamente una nucleósido cina- concentración de sustrato.
sa, fosforila estos compuestos hasta su forma de monofosfato. El modelo empleado más a menudo para explicar el compor­
A continuación, las cinasas celulares añaden fosfatos y forman tamiento alostérico, el llamado m odelo co n ce rta d o , fue es­
los compuestos trifosfato activos, que durante la replicación del tablecido por Monod, Wyman y Changeaux (fig. 6.11). Lo mismo
ADN son inhibidores competitivos de la ADN polimerasa viral que ocurre cuando el 0 2 se fija a la hemoglobina, en ausencia de
(cap. 32). sustrato, la enzima tiene una afinidad baja por éste y se encuentra
Mientras que la TK viral tiene una especificidad de sustrato baja en el estado T (estado tenso). La otra conformación de la enzima es
y fosforila eficientemente a los análogos de los nucleósidos, las nu­ el estado R (estado relajado). La fijación de moléculas del efector
cleósido cinasas celulares tienen una especificidad de sustrato alta
alostérico desplaza la fracción de la enzima de un estado al otro.
y apenas los fosforilan. Por tanto, las células infectadas por virus
En este modelo, en el estado R todos los centros activos son iguales
tienden a detenerse en un estadio específico del ciclo celular, el punto
de control G2-M (cap. 42); en cambio, las células no infectadas son
y, además, todos tienen una afinidad por el sustrato mayor que en
resistentes a los análogos de los nucleósidos. el estado T. Puesto que la transición entre el estado T y el esta­
do R ocurre al mismo tiempo para todas las subunidades, éste es el
denominado modelo concertado (en dos estados). Asimismo, Kosh-
land, Némethy y Filmer han propuesto un modelo alternativo,
el denominado modelo secuencial (en múltiples estados).
Cooperatividad positiva y negativa
Dicho modelo postula que cada subunidad cambia independien­
La cooperatividad positiva indica que la reacción de un sus­ temente hasta adoptar una conformación distinta y también que
trato con un centro activo facilita la reacción de otro sustrato en subunidades diferentes tienen distintas afinidades por el sustrato.
otro centro activo. Por el contrario, la cooperatividad n eg a­ Actualmente se sabe que los dos modelos son aplicables a diferen­
tiva indica que la reacción de un sustrato con un centro activo tes enzimas.

[Link]
 CAPÍTULO 6 Proteínas catalíticas-enzim as 65

A Regulación alostérica homotrópica j' Astado T (^ ^ 1Estado R □ Sustrato

Modelo concertado

Modelo secuencial

B Regulación alostérica heterotrópica

Positiva Negativa

■y1 Efector d=d Efector

Fig. 6.11 Representación esquemática de la regulación alostérica. (A) En la regulación homotrópica, el sustrato actúa como efector alostérico.
Se presentan dos modelos. En el modelo concertado, todas las subunidades pasan simultáneamente del estado T (tenso; baja afinidad por el sus­
trato) al estado R (relajado; alta afinidad por el sustrato); en el modelo secuencial, cambian uno a uno con cada reacción de fijación de sustrato.
(B) En la regulación heterotrópica, el efector es distinto del sustrato y se fija en un centro estructuralmente distinto de la enzima. Los efectores positivo
y negativo estabilizan la enzima en el estado R y el estado T, respectivamente.

obtener un cromóforo coloreado. El color obtenido es directamente

MEDICIÓN ENZIMÁTICA proporcional al contenido de glucosa de la muestra. Existen ver­
siones fluorimétricas de este método con una alta sensibilidad y
DE LA GLUCOSA SANGUÍNEA en un analizador comercial se utiliza un electrodo de oxígeno para
medir la velocidad de descenso de la concentración de oxígeno
Análisis con glucosa oxidasa/peroxidasa en la muestra, que también es directamente proporcional a la
concentración de glucosa.
En el laboratorio clínico, numerosos compuestos se miden
con métodos enzimáticos automatizados
En el análisis más habitual se utiliza una mezcla de glucosa oxidasa y Tiras reactivas y glucómetros
peroxidasa (fig. 6.12). La glucosa oxidasa es muy específica para la
glucosa, pero sólo oxida el P-anómero del azúcar, que representa Los diabéticos norm alm ente monitorizan sus niveles
aproximadamente el 64% de la glucosa en disolución. Por tanto, de azúcar en sangre varias veces al día con tiras reactivas
la mezcla del análisis se suplementa con mutarrotasa, que cataliza y medidores de glucosa
rápidamente la interconversión de los anómeros, mejorando la Las tiras reactivas de glucosa están impregnadas con un reactivo
sensibilidad del análisis en aproximadamente un 50%. El H20 2
© Elsevier. Fotocopiar sin autorización es un delito.

de glucosa oxidasa/peroxidasa (GOP). En la versión manual de este

producto de la reacción de la oxidasa se utiliza luego en una re­ análisis, la intensidad del cambio de color en una tira reactiva está
acción catalizada por peroxidasa para oxidar un cromógeno y relacionada con la concentración de glucosa, normalmente en una
escala de 1 a 4. Los glucómetros modernos utilizan una pequeña
gota de sangre (~ 1 |xl) y electrodos amperométricos para medir la
corriente producida por la reacción de oxidorreducción catalizada
(coloreado) ] por la glucosa deshidrogenasa (GDH), que oxida la glucosa a ácido
glucónico, pero reduce una coenzima en lugar del oxígeno. Estos
© ( 2 ucosaoxidasa] ( Peroxidasa
análisis suelen utilizarse cuando es necesario obtener mediciones
' Ádd0 I X > J Crom°9e"° 1 rápidas o frecuentes de la glucemia. Cuando se compararon los
glucónicoj l v [ (incoloro) J análisis con GOP y GDH a grandes alturas en una escalada al Kili­
manjaro, el análisis con GOP, que depende del oxígeno ambiental,
Fig. 6.12 Análisis con glucosa oxidasa/peroxidasa para la gluce­
mia. El color producido en este análisis es directamente proporcional a mostró un mayor error. Ambos métodos fueron menos exactos a
la concentración de glucosa sanguínea. las temperaturas bajas de una gran altitud.

[Link]
66 CAPÍTULO 6 Proteínas catalíticas-enzim as

Fig. 6.13 Análisis con glucosa oxidasa/peroxi-

dasa; métodos de punto final frente a métodos
cinéticos. (A) Análisis gráfico de un método de punto
final. (B) Las absorbancias finales (punto final) se re­
presentan como una función de la concentración de
glucosa, produciendo una línea recta. (C) Las velocida­
des iniciales de las reacciones se calculan con múltiples
mediciones al inicio del análisis (líneas discontinuas
en A) y se representan frente a la concentración de
glucosa. Cuando se obtienen gráficas no lineales, se
analizan con un ordenador.

Tiempo (min)

Análisis cinéticos
APRENDIZAJE ACTIVO
Los análisis cinéticos son más rápidos que los análisis
de punto fin a l 1. En una secuencia de varias reacciones enzimáticas, ¿cuál es el paso
en el que puede controlarse mejor el flujo de sustrato a través de
En el análisis descrito en la figura 6.12 y representado gráficamen­ la vía metabólica? Asimismo, en una vía metabólica de múltiples
te para varias concentraciones de glucosa en la figura 6.1 3 A, se pasos, ¿qué efecto tiene un inhibidor de una enzima que cataliza
deja continuar la reacción hasta su punto final, es decir, hasta que la reacción limitante sobre la concentración de sustratos?
se ha oxidado toda la glucosa, y después se mide el cambio de color. 2. La mayor parte de los fármacos están diseñados para inhibir en­
El color que resulta se representa luego frente a un estándar para zimas específicas de los sistemas biológicos. El fármaco Prozac
determinar la concentración de glucosa sanguínea (fig. 6.13B). ha tenido un gran efecto sobre el tratamiento médico de la de­
Los analizadores cinéticos de alto rendimiento calculan la concen­ presión. Revisar la historia del desarrollo del Prozac, explicando la
tración de glucosa en una muestra midiendo la velocidad inicial ■ importancia de la especificidad en el mecanismo de acción de los
fármacos.
de la reacción. Por ejemplo, el análisis de las curvas cinéticas de la
3. Exponer algunos ejemplos de inhibidores enzimáticos reversibles
figura 6.1 3 A indica que en el método de la glucosa oxidasa tanto
e irreversibles utilizados en medicina.
el punto final como la velocidad inicial dependen de la concen­ 4. Los ratones knockout (KO) carecen de un gen específico. Comentar
tración de glucosa. Por tanto, para calcular la concentración de el impacto de estos ratones en el desarrollo de fármacos en la
glucosa (fig. 6.13C), el analizador puede medir el cambio en la industria farmacéutica.
absorbancia (o algún otro parámetro) en las primeras fases de
la reacción y compararla con la de una solución estándar. Estas
determinaciones se realizan en analizadores de inyección de flujo
o centrífugos para asegurar el rápido mezclado de los reactivos y
la muestra. ■ En esta regulación participan m odificaciones covalentes
Los analizadores cinéticos son intrínsecamente más rápidos y no covalentes que permiten un control metabólico
que los análisis de punto final porque calculan la concentración eficiente. La actividad enzim ática puede ser inhibida
de glucosa antes de que el análisis llegue al punto final. Estos (o activada) por com puestos sintéticos (fárm acos),
métodos funcionan porque la glucosa oxidasa y la glucosa des­ com puestos exógenos (toxinas) y com puestos endógenos
hidrogenasa tienen una Kmalta para la glucosa. A las concentra­ (efectores alostéricos).
ciones de glucosa halladas en la sangre, la velocidad de reacción ■ Los análisis cinéticos de las reacciones enzim áticas son
de la oxidasa es proporcional a la concentración de glucosa, es útiles para valorar el papel biológico de las enzim as
decir, en la región de primer orden de la ecuación de Michaelis- y conocer sus mecanismos de reacción.
Menten donde la concentración de sustrato es menor que la Km ■ Los análisis de enzim as en sangre tam bién son útiles
(v. flg. 6.4). para diagnosticar y m onitorizar algunas enferm edades.

RESUMEN
LECTURAS RECOMENDADAS
■ La m ayor parte del m etabolismo está catalizado por
catalizadores biológicos llamados enzim as. Las actividades Androutsopoulos VP, Hernandez AF, Liesivuori J, et al: A mechanistic overview of
health associated effects of low levels of organochlorine and organophosphorous
catalíticas de las enzim as son claras a la tem peratura
pesticides, Toxicology, 2 0 1 2 , doi: 1 0 .1 0 1 6 / [Link] x .2012.09.011.
corporal y se hallan estrictam ente reguladas por varios Christenson RH, Duh SH: Methodological and analytic considerations for blood
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