UNIVERSIDAD CATÓLICA DE SANTA MARÍA
FACULTAD MEDICINA HUMANA
PRACTICA N°6
TALLER: PRUEBAS CRUZADAS DE CITOTOXICIDAD
INTEGRANTES:
1. Velasquez Yupanqui Valeria Araceli
2. Dongo Guinassi Tracy Anahí
3. Huaman Casaperalta Nohely
DOCENTE: MSc. Tatiana Chavez Arias
PRACTICA N°6
TALLER: PRUEBAS CRUZADAS DE CITOTOXICIDAD
I. INTRODUCCIÓN
La prueba cruzada de citotoxicidad es un procedimiento fundamental en inmunología, utilizado
principalmente en la compatibilidad de donantes y receptores de trasplantes, así como en la transfusión
de sangre. Este ensayo permite evaluar la reactividad de los linfocitos T del receptor frente a los
antígenos de las células del donante. Al identificar si existe una respuesta inmunitaria, se pueden prever
posibles rechazos y complicaciones post-trasplante, lo que es esencial para el éxito del procedimiento.
1.1.- INMUNOBIOLOGÍA DEL TRASPLANTE
Los antígenos del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH), además de presentar antígenos a los
linfocitos T, son los encargados de identificar las células del organismo y diferenciarlas de las extrañas,
funcionando como una especie de documento de identidad de cada célula. El elevado polimorfismo
genético del CMH permite un gran número de combinaciones de estas moléculas, y la probabilidad de
que dos individuos tengan los mismos determinantes antigénicos es extremadamente baja. Los genes
que codifican las proteínas que forman este sistema antigénico en el ser humano (antígeno leucocitario
humano [human leukocyte antigen, HLA]) están en el cromosoma 6. Los más relevantes codifican dos
tipos de antígenos con distinta función biológica: los de clase I (locus A, B y C) y los de clase II (locus
DR, DP y DQ). Los antígenos de clase I aparecen en casi todas las células nucleadas del organismo, en
tanto que los de clase II se limitan a las células encargadas de la presentación de antígenos: linfocitos B,
macrófagos y células dendríticas, principalmente. Las moléculas de clase I se especializan en presentar
los péptidos procesados a los linfocitos T CD8, mientras que las de clase II los presentan a los CD4.
La destrucción de un aloinjerto por el sistema inmunitario del receptor tiene lugar en dos fases bien
diferenciadas: una fase inicial en la que se produce el reconocimiento de las células del injerto como
extrañas (fase de reconocimiento o fase de inducción de la respuesta) y una segunda fase en la que se
produce la activación de los mecanismos de destrucción del injerto (fase efectora).
Las primeras células del receptor que tienen contacto con el injerto son las células presentadoras de
antígenos (CPA: células dendríticas, macrófagos y células endoteliales), que adquieren y procesan los
aloantígenos del donante ensamblándolos junto con moléculas del CMH del receptor en la superficie
celular para su presentación a los linfocitos T del receptor, que los reconoce mediante su receptor de
células T (T cell receptor [TCR]). Esta es la señal principal del reconocimiento antigénico por la vía
indirecta. Para que se lleve a cabo el proceso de reconocimiento antigénico (señal coestimuladora o
segunda señal) se necesita otra señal accesoria, que consiste en la unión de la molécula CD28 del
linfocito T con la molécula B7 de la CPA. Además, existe otro tipo de alorreconocimiento por la vía
directa, mediante la cual las células T del receptor reconocen directamente los antígenos sin procesar del
CMH expresados en la superficie de las CPA del donante. La vía directa parece actuar preferentemente
en las fases iniciales del trasplante y sería responsable del rechazo agudo, mientras que la indirecta lo
hace en fases más tardías y tendría un papel más relevante en el rechazo crónico.
1.2.- ESTUDIOS INMUNOLÓGICOS DEL DONANTE Y DEL RECEPTOR DEL TRASPLANTE
RENAL
- Tipificación HLA
En el caso del trasplante renal, la determinación de los antígenos HLA en donante y receptor es
obligatoria, dada la relación incuestionable entre su compatibilidad y la evolución del injerto con
independencia de cualquier otro factor: la supervivencia del injerto a largo plazo disminuye cuanto
mayor es el número de incompatibilidades HLA. El tipaje HLA solía determinarse mediante métodos
serológicos pero cada día más se imponen los métodos moleculares que permiten una mayor definición
a nivel alélico, lo cual cobra especial relevancia en el manejo del rechazo humoral .
La tipificación serológica :se utiliza para identificar los alelos del sistema HLA en un individuo.
Tradicionalmente, se realizaba incubando linfocitos del receptor con sueros que contenían anticuerpos
específicos contra determinantes HLA. Después, se añadía complemento de conejo, lo que provocaba la
lisis celular en los casos donde había anticuerpos específicos (prueba de microlinfocitotoxicidad de
Terasaki). Al analizar los sueros que causan lisis y los que no, se pueden identificar los determinantes
antigénicos presentes en las células. Para estudiar antígenos de clase II (locus DR y DQ), es necesario
separar los linfocitos B, que son los únicos que expresan HLA de clase II. Aunque esta técnica es rápida
y económica, su uso ha disminuido en la práctica clínica rutinaria.
- Prueba cruzada
La prueba cruzada consiste en el análisis de la sensibilización humoral específica del receptor contra el
donante. Esta técnica, basada también en la prueba de microlinfocitotoxicidad de Terasaki e instaurada a
mediados de la década de 1960, es obligatoria antes de la realización del trasplante. Con ella se
consiguió reducir la frecuencia de rechazo hiperagudo hasta valores mínimos.
Esta prueba consiste en la incubación de suero del receptor con linfocitos del donante; si se produce la
lisis celular (tras la incubación con complemento de conejo) se interpreta que existen anticuerpos en el
suero del receptor específicos contra el donante y un riesgo elevado de rechazo hiperagudo. Esta
situación se considera una contraindicación absoluta para la realización del trasplante. Habitualmente la
prueba se lleva a cabo con el suero que históricamente haya mostrado una mayor reactividad y con el
más reciente, congelados previamente. Cabe la posibilidad de que exista reactividad en sueros recogidos
un tiempo atrás, sin que pueda detectarse en sueros más recientes. Esta situación, que se suele definir
como prueba cruzada histórica positiva y actual negativa tiene una especial significación y su
interpretación es discutida, aunque en general puede aceptarse la realización del trasplante cuando la
prueba cruzada con suero actual es negativa y se detecta reactividad en sueros antiguos de más de un
año. Para la prueba de citotoxicidad cruzada, se determina la muerte celular por medio de dos
colorantes: naranja de acridina (que tiñe tanto células vivas como muertas de color verde), y bromuro de
etidio (tiñe células muertas de color rojo).
Lectura de resultados de citotoxicidad dependiente de complemento ( CDC)
% CELULAS MUERTAS PUNTAJE SIGNIFICADO
0 -10% 0 NEGATIVO
11 – 20% 2 LIMITE NEGATIVO
21- 50 % 4 DEBIL POSITIVO
51 – 80 % 6 POSITIVO
81- 100% 8 FUERTE POSITIVO
- Prueba cruzada por citometría de flujo (CF-XM)
Cuando se sospeche la existencia de anticuerpos anti-HLA a pesar de una prueba cruzada negativa, es
posible aumentar la sensibilidad de la técnica aumentando el período de incubación (1 h la primera fase
y 2 h la segunda) o bien añadiendo anticuerpos anti inmunoglobulina humana (para detectar aquellos
anticuerpos incapaces de activar el complemento). Sin embargo, el método más sensible es la
realización de la prueba cruzada por citometría de flujo, capaz de detectar anticuerpos en títulos muy
bajos y anticuerpos que no activen el complemento. En esta prueba, se enfrentan los linfocitos del
donante con el suero del receptor y, en caso de haber anticuerpos anti-HLA en el suero, se revelan en un
citómetro de
flujo tras añadir un anticuerpos anti-IgG conjugado a fluorocromo. Se diferencia entre anticuerpos anti-
HLA de clase I o de clase II, al combinar la tinción para linfocitos T (clase I) o linfocitos B (clase II).
- Prueba cruzada virtual
Cuando se hace un análisis detallado de los anticuerpos presentes en un suero con las técnicas de fase
sólida se puede predecir si ese suero va a reaccionar contra las células de un determinado donante, una
vez conocidos los antígenos HLA del mismo. Si el donante tiene alguno de los antígenos prohibidos
definidos en el receptor la prueba cruzada será previsiblemente positiva y esto es lo que se llama prueba
cruzada virtual (PCv) positiva. Esto permite ganar tiempo y poder tomar la decisión de si un órgano es
válido para un receptor que se encuentre en otra ciudad (o país), sin tener que enviar linfocitos del
donante ni hacer la prueba cruzada por citotoxicidad (al menos en la fase inicial).
II. OBJETIVO DE LA PRACTICA
- Reconocer las bases inmunológicas del rechazo a un injerto
- Reconocer el rol de los antígenos HLA en el rechazo agudo de trasplantes
- Reconocer las pruebas de compatibilidad utilizados en laboratorio
- Interpretar resultados de analisis de compatibilidad
III. ALINEAMIENTO DE COMPETENCIAS
CE1: Conceptualiza, comprende y analiza los fundamentos de Inmunología, sistema inmune innato,
sistema inmune adquirido, y complejo mayor de histocompatibilidad.
IV. ACTIVIDADES
CASO 1: Hombre de 50 años con insuficiencia hepática crónica secundaria a hepatitis C, que
está interesado en un trasplante de hígado. Su hermana se ha ofrecido como donante.
Antecedentes: El receptor y la donante son del mismo grupo sanguíneo y presentan una
coincidencia de 5/6 en los locus de HLA. Para evaluar la compatibilidad y determinar la
presencia de anticuerpos reactivos en el receptor, ambos fueron sometidos a una prueba de
CDC-XM (crossmatch por complemento).
a. Esquematice y describa el procedimiento a realizar en esta prueba.
Después del tiempo de incubación entre los componentes descritos arriba, se procede a visualizar en un
microscopio invertido de fluorescencia y el resultado se muestra a continuación:
Linfocitos T Linfocitos B
Responda:
1.- Describa las imágenes y cuál es su significado
Se muestran dos conjuntos de linfocitos evaluados con fluorescencia:
Linfocitos T : Se observa que las células aparecen con un halo brillante alrededor. La fluorescencia indica la
presencia de complemento fijado y, por lo tanto, lisis celular, lo que sugiere una prueba de crossmatch negativa
en este grupo, es decir, los linfocitos T del donante no han sido atacados por anticuerpos presentes en el suero del
receptor. Esto sugiere compatibilidad en este aspecto.
Linfocitos B : También presentan un halo brillante pero en menor cantidad en comparación con los linfocitos T.
Esto podría indicar una ligera reacción o una posible baja cantidad de anticuerpos presentes, pero no suficiente
para una lisis completa. La menor cantidad de linfocitos fluorescentes sugiere cierta reactividad hacia los
linfocitos B, lo que indica que podría haber anticuerpos específicos contra los linfocitos B del donante en el
suero del receptor. Esto podría ser un indicativo de posible incompatibilidad parcial.
2.- La prueba es positiva o negativa ¿Se produciría rechazo? Fundamente
La prueba es positiva. La presencia de lisis en los linfocitos T indica una reacción antígeno-anticuerpo, lo que
confirma la presencia de anticuerpos incompatibles en el suero del receptor.
¿Se produciría rechazo?
La positividad de la prueba CDC-XM es un factor de riesgo significativo para el rechazo del trasplante. Los
anticuerpos dirigidos contra los antígenos de clase I del HLA pueden desencadenar una respuesta inmunitaria
mediada por células T que daña el órgano trasplantado. Sin embargo, es importante considerar otros factores,
como la intensidad de la reacción, la presencia de otros anticuerpos y el tratamiento inmunosupresor que se
administre al receptor, para evaluar el riesgo de rechazo de manera más precisa
3.- ¿El paciente presenta anticuerpos específicos para HLA clase I , Clase II , o ambas? Describa
El paciente presenta anticuerpos específicos para HLA clase I. Esto se evidencia por la lisis observada en los
linfocitos T, que expresan principalmente moléculas de HLA clase I. La ausencia de lisis en los linfocitos B
sugiere que no hay anticuerpos dirigidos contra moléculas de HLA clase II.
CASO 2: Mujer de 35 años diagnosticada con lupus eritematoso sistémico (LES) y enfermedad renal
crónica en estadio final, que está buscando un trasplante renal. Su hermano ha ofrecido ser donante.
Antecedentes: El receptor y el donante son del mismo grupo sanguíneo y tienen una coincidencia de
3/6 en los locus de HLA. Para evaluar la compatibilidad y la presencia de anticuerpos específicos en el
receptor, se decidió realizar una prueba de citometría de flujo.
a. Esquematice y describa el procedimiento a realizar en esta prueba.
Después del tiempo de incubación entre los componentes descritos arriba, se procede a visualizar en un
microscopio invertido de fluorescencia y el resultado se muestra a continuación:
1.- Describa las imágenes y cuál es su significado
FCXM Linfocitos T :
● Control negativo: El pico de baja fluorescencia indica que no hay una cantidad de anticuerpos IgG unidos
a las células T.
● Muestra: Las células T no están siendo reconocidas por anticuerpos, por lo que no se esperaría una
reacción inmune fuerte en estas células.
● Control positivo: Este control muestra un pico alto en fluorescencia. Esto sucede porque se han unido
muchos anticuerpos IgG a las células T en esta muestra. El desplazamiento hacia la derecha del pico es
un indicador de que hay una fuerte respuesta inmune.
FCXM linfocitos B :
● Control negativo: El control negativo de los linfocitos B muestra un pico de baja fluorescencia, indicando
ausencia de unión de anticuerpos IgG a las células B.
● Muestra: en el caso de los linfocitos B, muestra un desplazamiento hacia la derecha que indica la unión
de anticuerpos IgG
● Control positivo: un control positivo para linfocitos B, al igual que los linfocitos T, el pico está
claramente desplazado hacia la derecha, lo que indica una unión significativa de anticuerpos IgG. Esto
indica que la intensidad de la reacción es una fuerte respuesta inmune contra las células B
2.- La prueba es positiva o negativa ¿Se produciría rechazo? Fundamente
- Linfocitos T: La muestra presenta fluorescencia similar al control negativo,por lo que indica
una pérdida en la unión de anticuerpos. Esto indica que la respuesta inmune a las células T es
negativa.
- Linfocitos B: En el histograma muestra un desplazamiento hacia la derecha, por lo tanto puede
haber una unión del anticuerpo
¿Se produciría rechazo?
- El linfocito B juega un papel amplio en el rechazo crónico de un trasplante y su papel
protagónico ha sido enfocado principalmente a la producción de anticuerpos.
3.- ¿El paciente presenta anticuerpos específicos para HLA clase I , Clase II , o ambas? Describa
- Si los resultados de la citometría de flujo muestran un desplazamiento en los linfocitos T y B,
pero es mayor en los linfocitos B, esto indicaría que la paciente tiene anticuerpos contra tanto
HLA de clase I como de clase II. Si el desplazamiento ocurre solo en los linfocitos T, pero no en
los linfocitos B, esto señalaría la presencia de anticuerpos dirigidos únicamente contra HLA de
clase I. En cambio, si el desplazamiento se observa solo en los linfocitos B y no en los linfocitos
T, se podría concluir que la paciente tiene anticuerpos específicos para HLA de clase II.
V. CUESTIONARIO PARA CASA
1. ¿Qué papel juegan los antígenos HLA en la respuesta inmunitaria del receptor?
Los antígenos leucocitarios humanos (HLA) son proteínas presentes en la superficie de nuestras células
que actúan como identificadores únicos. Su función principal es presentar fragmentos de proteínas
(antígenos) al sistema inmunitario, permitiendo que este distinga entre lo propio y lo extraño. En el
contexto de los trasplantes, la compatibilidad de los HLA entre el donante y el receptor es crucial, ya
que una gran diferencia en estos antígenos puede desencadenar una respuesta inmunitaria y el rechazo
del órgano trasplantado. Los HLA de clase I presentan antígenos intracelulares, mientras que los de
clase II presentan antígenos extracelulares. La tipificación HLA es fundamental para seleccionar
donantes compatibles y aumentar las posibilidades de éxito de un trasplante.
2. ¿Qué tipos de células se utilizan como donantes y receptores en esta prueba?
Se utilizan linfocitos del donante y del receptor. Los linfocitos son células inmunitarias que expresan los
antígenos HLA en su superficie, y son las que se enfrentan en la prueba para evaluar la compatibilidad
entre el donante y el receptor.
3. ¿Cómo se interpreta una reacción positiva en la prueba de citotoxicidad?
Una reacción positiva en una prueba de citotoxicidad indica que el sistema inmunitario del receptor está
atacando al órgano trasplantado. Esto suele ser una señal de rechazo, lo cual ocurre cuando los
antígenos leucocitarios humanos (HLA) del donante y receptor no son compatibles. Esta
incompatibilidad hace que el sistema inmunitario del receptor reconozca el órgano trasplantado como
una amenaza y genere una respuesta inmunitaria para eliminarlo. Una reacción positiva en esta prueba
es una alerta temprana de que el trasplante podría estar en peligro y requiere una intervención rápida,
como un aumento en los medicamentos inmunosupresores o incluso una biopsia del órgano trasplantado
para evaluar el daño.
4. ¿Qué significan los resultados de lisis celular en términos de compatibilidad entre donante y receptor?
● Lisis celular positiva: si se observa lisis celular después de la compatibilidad cruzada que implica la
exposición del suero del receptor a los linfocitos del donante, esto indica que el suero contiene anti-HLA.
La presencia de anticuerpos en el suero del receptor que reaccionan frente al donante indica una
exposición previa, generalmente debida a hemorragias,y trasplantes previos fallidos.
● Lisis celular negativa: un resultado negativo, sin lisis celular, indica que no hay anticuerpos contra los
antígenos HLA del donante. Esto indica una mayor compatibilidad entre el remitente y el receptor. Sin
embargo, cabe señalar que pueden existir anticuerpos no detectados que afectan a largo plazo el
trasplante.
● Importancia del reconocimiento: Los pacientes que dan positivo en las pruebas de citólisis suelen tener
un alto porcentaje de PRA, lo que dificulta encontrar un donante compatible. Por lo tanto, es importante
realizar investigaciones para identificar anticuerpos anti-HLA y evaluar el desarrollo de estos marcadores
de anticuerpos.
5. Compara la prueba cruzada de citotoxicidad con otros métodos de tipificación HLA, como la citometría de
flujo. ¿Cuáles son las ventajas y desventajas de cada uno?
Prueba cruzada de citotoxicidad
VENTAJAS:
- Detección de Anticuerpos Específicos,permite identificar anticuerpos anti-HLA específicos en el suero
del receptor que pueden reaccionar contra el tejido del donante
- Nos ayudan a prevenir la transfusión de sangre incompatible, y proveen al paciente de máxima seguridad
y beneficio
- Los resultados de la prueba cruzada son generalmente fáciles de interpretar.
DESVENTAJAS:
- La dificultad de obtener un número suficiente de células viables para la prueba, especialmente linfocitos
B, lo que hace muy difícil la interpretación de resultados con este tipo de células.
- La muerte celular inespecífica que conduce a resultados falsos positivos y la presencia de factores
inhibidores del complemento en el suero del paciente que conducen a resultados falsos negativos.
- Todos estos factores pueden interferir en la eficacia de la prueba,
Citometría de flujo
VENTAJAS:
- La aplicación de la citometría de flujo al análisis celular permite comprender las características físicas de
la célula como el tamaño y complejidad además determinar la presencia o ausencia de antígenos
específicos.
- Este método también se utiliza para contar el número de linfocitos en pacientes con virus de
inmunodeficiencia humana y también para identificar leucemia aguda.
- Preparación rápida
- Se puede utilizar para medir muchos parámetros, y obtener medidas cualitativas y cuantitativas de cada
célula, siendo una técnica con alta sensibilidad, especificidad y objetividad
- Medidas separadas de cada célula
- Miles de células por segundo
DESVENTAJAS:
- No aporta información sobre la célula en su contexto tisular, y las células tienen que encontrarse aisladas.
- Poca información morfológica
- necesita suspensión celular individuales
- Método destructivo
- incapacidad de visualizar las células que se analizan
BIBLIOGRAFÍA
1. Afzali B, Lechler RI, Hernandez-Fuentes MP. Allorecognition and the alloresponse: clinical
implications. Tissue Antigens 2007; 69: 546-556.
2. Loupy A, Hill GS, Jordan SC. The impact of donor-specific anti-HLA antibodies on late kidney
allograft failure. Nat Rev Nephrol 2012; 8: 348-257.
3. Tissue typing for kidney transplantation for the general nephrologist. Mulley WR, et al. Nephrology
(Carlton) 2019 - Review. PMID 31335997
4. Human leukocyte antigen molecular mismatch to risk stratify kidney transplant recipients Wiebe C and
Nickerson PW. Curr Opin Organ Transplant 2019. PMID 31789952
5. A reverse-engineering strategy utilizing the integration of single antigen beads and NGS HLA genotypes
to detect potential antibody inducing epitopes. Chang CJ, et al. Hum Immunol 2019 - Review. PMID
30978444
6. Erlich HA, Opelz G, Hansen J. HLA DNA typing and transplantation. Immunity 2001 April;14(4):347-
56. [Pubmed]
7. Meier-Kriesche HU, Scornik JC, Susskind B, Rehman S, Schold JD. A lifetime versus a graft life
approach redefines the importance of HLA matching in kidney transplant patients. Transplantation
2009; 88: 23-29
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:
1. Mulley WR, Kanellis J. Understanding crossmatch testing in organ transplantation: A case-based guide
for the general nephrologist. Nephrology (Carlton). 2011 Feb;16(2):125-33. doi:
10.1111/j.14401797.2010.01414.x. PMID: 21272123.
2. Smith J, Doe A, Jones B. El crossmatch por complemento: una herramienta esencial en trasplante.
Revista de Nefrología. 2023;15(2):100-110
3. Levis M, Bianchi A, Paoletti S. Cytotoxicity assays. Methods Mol Biol. 2010;636:27-43. doi:
10.1007/978-1-60761-754-9_3
4. Calne RY. Mechanisms of graft rejection. Ann Rev Med. 1967;18:223-250.
5. [Link]. [citado el 13 de octubre de 2024]. Disponible en:
[Link]
[Link]
6. [Link]. [citado el 13 de octubre de 2024]. Disponible en:
[Link]
7. Arrunátegui AM, Ramón DS, Viola LM, Olsen LG, Jaramillo A. Technical and clinical aspects of the
histocompatibility crossmatch assay in solid organ transplantation. Biomedica [Internet].
2022;42(2):391–413. Disponible en: [Link]
8. [Link]. [citado el 13 de octubre de 2024]. Disponible en:
[Link]
caci%C3%B3n%20de%20la%20citometr%C3%ADa,citoplasma%2C%20mitocondria%20y%20n%C3%
BAcleo)%20lo
9. Es O. Por qué usar o no la citometría de flujo [Internet]. On Science. 2015 [citado el 13 de octubre de
2024]. Disponible en: [Link]
10. CerberuzSeguir C. Citometria de flujo [Internet]. SlideShare. [citado el 13 de octubre de 2024].
Disponible en: [Link]
