Bioloxía Molecular e Citoxenética

CULTIVOS CELULARES
Se puede definir el cultivo celular como el conjunto de procedimientos que hacen posible el
mantenimiento de células de organismos pluricelulares in vitro, preservando al máximo sus
características fisiológicas, bioquímicas y genéticas. También se define el cultivo celular como «el
resultado del crecimiento in vitro de células obtenidas de organismos multicelulares».

TIPOS DE CULTIVOS CELULARES

Se pueden diferenciar tres tipos de cultivos:

1- Cultivo de órganos

El cultivo de órganos consiste en mantener un órgano entero o parte de él en la interfase

entre un medio de cultivo artificial y una atmósfera controlada.
En estos cultivos, como pueden ser los cultivos de ganglios, de fragmentos hepáticos, de piel,
médula ósea, etc., se suelen mantener vivos, durante un tiempo limitado, los distintos tipos celulares
diferenciados presentes en el órgano, así como la estructura histológica y la arquitectura del órgano.
Se dice que el crecimiento es limitado porque la mayor parte de los tipos celulares no
proliferan. Únicamente se produce crecimiento de algunas células indiferenciadas presentes en los
tejidos, fundamentalmente en la zona periférica, que no conservan la estructura tisular típica del órgano.
Por eso su utilización hoy en día se centra en buscar las células embrionarias del tejido en
determinadas neoplasias de células germinales (teratoma) o para estudiar interacciones y relaciones
intercelulares, respuestas globales a sustancias, estudios regenerativos…

2- Cultivo de explantes

Las porciones de tejidos vivos, fragmentos tisulares o explantes son también susceptibles
de cultivo. El cultivo de explantes consiste en adherir un fragmento de tejido a una
superficie (placa o frasco de cultivo) y nutrirlo con un medio de cultivo adecuado.
En estas condiciones, las células periféricas del explante se multiplican y proliferan, migrando
por la superficie del soporte. Es el caso de cultivos de fragmentos de diferentes tejidos, como pueden
ser vellosidades coriónicas, tejidos epiteliales pequeños (biopsias de piel), etc.

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3- Cultivo de células

El cultivo de células se realiza a partir de suspensiones celulares, que se introducen en un

recipiente adecuado junto con un medio de cultivo y se incuban en las condiciones óptimas para
que las células proliferen.
El cultivo de células es de cultivo más habitual y se realiza a partir de muestras de cualquier
tipo de tejido, líquido amniótico, sangre periférica, células hematopoyéticas, células madre, etc.
Según la procedencia de la suspensión celular de partida, los cultivos de células pueden ser
primarios o secundarios.

 Cultivo celular primario. Para obtener un cultivo celular primario, la suspensión celular
de partida se obtiene disgregando las células de un tejido por métodos mecánicos,
químicos o enzimáticos. De esta manera se obtienen cultivos primarios de una mezcla
celular formada por los distintos tipos celulares presentes en el tejido (obtenidos de
explantes en una biopsia) o seleccionando un tipo celular concreto (linfocitos).
 Cultivo celular secundario. La suspensión celular de partida se obtiene a partir de un
cultivo primario o de otro secundario, mediante un subcultivo o «pase». También se
pueden obtener a partir de una línea celular mantenida en congelación.

APLICACIONES DE LOS CULTIVOS CELULARES

Los cultivos celulares tienen múltiples aplicaciones, tanto en investigación básica, como en
investigación aplicada.

En investigación básica permiten estudiar:

 Cualquier aspecto relacionado con el metabolismo celular: ciclo celular, rutas
metabólicas, flujos intracelulares, diferenciación, transformación, etc.
 En citogenética, se utilizan como material de trabajo cultivos celulares,
básicamente se toman muestras de tres tipos, procedentes de líquido amniótico, de
la sangre periférica y de la vellosidad corial. Cada uno de ellos se utiliza con
distintas estrategias, sobre todo en diagnóstico clínico, como diagnóstico prenatal
de ciertas cromosomopatías y aberraciones cromosómicas.

En investigación aplicada permiten estudiar todo lo relacionado con la ingeniería genética y la

biotecnología:
 Inmunología, para producción de anticuerpos monoclonales e inmunoterapia.
 Virología, para producción de vacunas.
 Farmacología, para producción de nuevos tratamientos.
 Toxicología, para estudios de citotoxicidad, carcinogénesis y mutagénesis.
 La ingeniería de tejidos que pretende conseguirla producción in vitro de tejidos
(cultivos histotipicos) y órganos (cultivos organotípicos) funcionales para su uso en
injertos y trasplantes.
 Estudios con células madre o stemcells, enfocados a la terapia celular. La
medicina regenerativa para el tratamiento de muchas patologías, disfunciones
hormonales como la diabetes o en enfermedades neurodegenerativas como el
Parkinson, el Alzheimer o el Huntington, lesiones cardiocirculatorias como el
infarto de miocardio o la isquemia vascular periférica y lesiones
musculoesqueléticas, articulares u óseas.

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PROCEDIMIENTOS DE CULTIVO CELULAR

En los laboratorios de cultivos celulares se realizan múltiples procedimientos, desde la
obtención de las células a partir de órganos, tejidos o suspensiones celulares, hasta la conservación y
almacenamiento de líneas celulares establecidas, pasando por el mantenimiento de los cultivos, la
realización de pases, estudios de viabilidad celular, etc.

El procedimiento sería el siguiente:

1- DISGREGACIÓN CELULAR

Cuando se quieren cultivar células procedentes de un órgano o tejido, el primer paso consiste
en obtener el tipo celular que nos interesa en suspensión. Para lo cual hay que separar las células entre sí
y de la matriz extracelular en la que se encuentran inmersas.

Métodos de disgregación celular:

Esta disgregación celular se puede realizar por métodos mecánicos o enzimáticos, aunque lo
normal es una combinación de ambos.

Métodos mecánicos

Los métodos mecánicos se basan en cortar e incluso triturar suavemente fragmentos de órgano o
tejido colocados en un placa de Petri con tampón o medio de cultivo, en el que se recogen las células
disgregadas tras filtrarlo para retirar los restos de tejido.

Un método mecánico muy útil es el cribado de células. Consta de los siguientes pasos:
1. Se colocan los trozos de órgano o tejido, previamente “picados”, sobre una malla de nailon
con un diámetro de poro suficientemente grande para permitir el paso de las células.
2. Se aplasta suavemente la masa de tejido.
3. La criba se acopla a un tubo con el diámetro adecuado, o sobre una placa de Petri.
4. Se lava con tampón o medio de cultivo, de manera que sobre la criba permanecen los
restos de tejido aplastado. Las células que se han separado del tejido pasan al tubo o placa
suspendidas en una disolución tampón o medio de cultivo.

Métodos enzimáticos

Los métodos enzimáticos se basan en el tratamiento del tejido con enzimas proteolíticas que
digieren las proteínas de la matriz extracelular, liberando las células englobadas en ella.

Entre las proteasas (enzimas proteolíticas) más utilizadas están la tripsina y la colagenasa, que
degradan las proteínas de la matriz extracelular. Estas soluciones enzimáticas se pueden combinar con
EDTA, que secuestra los cationes de Ca2+, del que depende la adherencia celular, por tanto favorece su
disgregación y a continuación mediante una suave agitación se obtiene una suspensión celular que
contiene las células del tejido disponibles para su cultivo. Es de las más habituales y el protocolo es
genérico para los otros tipos de disgregación celular (llamado disgregación celular con tripsina).

 tripsina caliente: pequeñas porciones de tejido se incuban con tripsina a 37°C y las células
disociadas deben recolectarse por centrifugación cada media hora. La tripsina se neutraliza con
suero en medio de cultivo
 tripsina fría: las porciones de tejido se incuban en tripsina a 4°Cdurante 6-18 horas permitiendo la
penetración y la digestión se puede hacer en un tiempo corto de20-30 min a 37°C.

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2- SELECCIÓN DE CÉLULAS

Tras la disgregación celular se obtiene:

o Una mezcla compleja que puede ser utilizada para iniciar el cultivo primario
o Lo más habitual es que se seleccione un tipo celular concreto para ser cultivado. Dicha selección
se basa en:
 Propiedades específicas de las células
 Dependen de la distinta adhesión de las células a los sustratos
 La suspensión celular se hacen pasar por columnas o filtros con distintos
sustratos de manera que las células de interés quedan retenidas en ellos
 Posteriormente se diluyen con un tampón adecuado que disminuye la adhesión
 Métodos inmunológicos
 Se basan en el uso de Anticuerpos específicos que reconocen las células de
interés anclados a un soporte sólido
 Hay varias maneras de hacerlo:
- Recubrir los pocillos de una placa multipocillo con un Ac específico.
La mezcla de células se incuba en los pocillos de manera que las
células de interés quedan adheridas sobre las superficie del pocillo y el
resto se eliminan mediante lavados
- Recubrir esferas de material inerte de cierto tamaño con el Ac.
Introducir las esferas en la mezcla de células de manera que las células
de interés quedan retenidas sobre la superficie de las esferas. La
solución se filtra reteniendo las esferas, pero no el resto de las células

En ambos casos las células se separan del soporte sólido cambiando el pH o

digiriendo los Ac mediante enzimas

3- COMPOSICIÓN Y PROPIEDADES DEL MEDIO DE CULTIVO

Los medios de cultivo son medios nutritivos que sustituyen al medio natural en el que se encuentra
la célula fisiológicamente.

Son mezclas complejas que deben:

 Aportar a la célula no solo nutrientes para su mantenimiento como organismo vivo, sino
todo tipo de sustancias necesarias para el completo desarrollo metabólico que permita a
la célula proliferar.
 Reunir una serie de características fisicoquímicas que generen condiciones
microambientales adecuadas para el desarrollo celular.

Composición del medio de cultivo:

La composición básica de los medios de cultivo celular incluye los siguientes elementos:
 Sales minerales. La base de un medio de cultivo es una solución salina equilibrada en la
que se disuelven el resto de los componentes. Entre las sales minerales que forman
parte habitual de los medios de cultivo están el cloruro sódico, cloruro potásico,
cloruro cálcico, fosfatos sódicos y bicarbonato sódico. La concentración de bicarbonato
sódico es especialmente importante por su papel en la regulación del pH en relación con la
concentración de CO2 ambiental.

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 Tampón. El medio de cultivo tiene que estar tamponado, puesto que las células son
muy sensibles a los cambios de pH. El tampón más utilizado ha sido el bicarbonato,
sin embargo, en la actualidad se aconseja el uso del tampón HEPES debido a su gran
poder tamponador en el rango de pH óptimo para el crecimiento celular (7,2-7,6).
 Glucosa. La glucosa se incluye en los medios de cultivo como fuente de energía, como
componente único o junto con otros hidratos de carbono.
 Aminoácidos. El medio de cultivo debe contener, como mínimo, todos los aminoácidos
esenciales. Se puede suplementar además con otros aminoácidos, dependiendo de las
necesidades de las células que se quiere cultivar.
 Vitaminas. La composición en vitaminas varía mucho de un medio a otro y va a
depender de la concentración de suero que se utilice. Las vitaminas son necesarias
porque influyen en la tasa de crecimiento y en la supervivencia de las células.
 Suplementos orgánicos de bajo peso molecular. En esta categoría se incluyen ácidos gra-
sos esenciales y otros lípidos.
 Indicador de pH. Dado que el pH del medio es un parámetro fundamental para la
supervivencia del cultivo, en la composición del medio se incluye un indicador de pH,
como el rojo fenol.
 Hormonas y factores de crecimiento. Esta categoría incluye multitud de componentes
esenciales para el crecimiento de las células, pero cuya proporción en el medio de
cultivo es muy difícil de estandarizar. Si se usan los factores de crecimiento o
mitógenos, sustancias que inducen a la división celular, la proporción debe ser siempre
la adecuada, ya que algunos pueden estimular la proliferación de muchos tipos celulares
y otros como la eritropoyetina o la fitohemaglutinina pueden ser específicos en muestras
de sangre.
La mayor parte de los medios de cultivo básicos, son medios no definidos y para
solucionar este problema se añade al medio de cultivo suero animal en proporción
variable (siendo lo más habitual 10%). El suero animal aporta hierro, oligoelementos
(cobre, selenio), factores de adhesión, inhibidores de proteasas, etc. Los más usados son
el suero de ternera y el suero bovino fetal para todo tipo de cultivos y el suero humano
para cultivar líneas celulares humanas.
Existe comercialmente una gran variedad de medios de cultivo, algunos se usan
directamente y a otros es necesario añadirle algún otro elemento. Por ejemplo el
RPMI es el más usado para la obtención del cariotipo en linfocitos de sangre
periférica, el medio Hams F10 se usa para cultivos en líquido amniótico y tejidos.
 Antibióticos y antifúngicos. La suplementación del medio de cultivo con
antibióticos y antifúngicos es esencial para prevenir la contaminación por bacterias,
levaduras y hongos.
Se pueden utilizar solos o en combinación, pero hay que controlar muy bien la
concentración final para evitar dañar las células.

Características físico-químicas del medio de cultivo:

En el medio de cultivo hay que controlar las siguientes características fisicoquímicas:

 pH. Las células en cultivo suelen crecer en un margen de pH relativamente estrecho. El
pH óptimo, como hemos dicho, para la mayoría de las células es de 7,4 (rango 7,2-7,6).
 Osmolaridad. Los medios de cultivo deben ser isotónicos o ligeramente hipotónicos
respecto de las células que se cultivan.
 Viscosidad. La viscosidad no suele ser un parámetro limitante para el crecimiento de
las células, depende principalmente de la concentración de suero que se use.

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 Tensión superficial. La tensión superficial debe mantenerse baja y no suele ser

problema en los cultivos tradicionales. Únicamente en ciertos cultivos especiales en
suspensión en los que se burbujea CO2 puede producirse espuma en el cultivo. Para
evitarlo se añaden agentes antiespumantes.
 La atmósfera gaseosa es la mezcla de gases en que se mantienen los cultivos, sus dos
componentes más importantes son el oxígeno y el CO2.

- Oxígeno. Todas las células requieren oxígeno para vivir. En general, la

concentración de oxígeno atmosférico es suficiente para cubrir las necesidades
de cualquier cultivo celular.
- El CO2 tiene un papel importante en los cultivos celulares, ya que puede influir
en el pH del medio cuando este está tamponado con un tampón bicarbonato.
Por esta razón cada medio de cultivo tiene una concentración recomendada de CO2,
en función de la cantidad de bicarbonato sódico que contiene. La concentración más
habitual es del 5%. Los incubadores o estufas, que ya hemos dicho, llevan
acoplados dispensadores de CO2 y un dispositivo que permite controlar la
concentración de este componente en la atmósfera de incubación.

Condiciones de la incubación:

El incubador es también el responsable de mantener las condiciones ambientales óptimas para el

crecimiento de las células, controlando dos parámetros: temperatura y humedad.
 Temperatura. La temperatura influye en gran medida en la tasa de crecimiento de las
células. La temperatura óptima de crecimiento suele ser la misma a la que están
sometidas fisiológicamente en los organismos de procedencia, por eso las células de
mamíferos crecen bien a 37 °C y otros como los insectos crecen a 28 °C.
 Humedad. La humedad ambiental es también un parámetro importante para el buen
crecimiento de las células. Debe ser suficientemente elevada para evitar la evaporación del
medio de cultivo, lo que produciría aumento de la concentración de los componentes.
Los incubadores actuales tienen dispositivos que inyectan agua estéril para conseguir
humedades relativas alrededor del 95%.

Una vez que tenemos las células en suspensión y se les añade el medio de cultivo
correspondiente, se introducen en un recipiente adecuado (frasco de cultivo) y se incuban en
condiciones óptimas de temperatura y humedad, de esta forma las células empiezan a crecer.

4- RECUENTO Y VIABILIDAD CELULAR

Para iniciar el cultivo celular es necesario conocer su densidad celular, es decir, el número de
células por ml.
Esto es debido a que el cultivo se inicia con un número concreto de células, dependiendo de la
superficie del recipiente que se vaya a utilizar. Además, hay que comprobar la viabilidad de esas células.
La viabilidad celular es el porcentaje de células vivas.
Ambos procesos, tanto el recuento, como la viabilidad celular, se realizan simultáneamente
diluyendo las células con un colorante vital y contándolas en una cámara de recuento o con métodos
automáticos como el cell-coulter, aparato utilizado para contar y medir el tamaño de partículas en
solución.

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Colorante vital:

Un colorante vital permite distinguir las células vivas de las muertas.

El colorante más habitual es el azul tripán, es un coloide de color azul, que se introduce en el
interior de las células que presentan roturas en las membranas, pero no atraviesa las células con las
membranas intactas.

En consecuencia, cuando se observa al microscopio una población de células teñida con azul
tripán, se ven dos tipos de células:
 Células de color azul, que se han teñido porque tienen rota su membrana citoplasmática.
Estas células se consideran no viables.
 Células blancas, en las que el colorante no ha podido penetrar porque su membrana
citoplasmática está intacta. Se considera que estas células están vivas y son viables para un
cultivo.

El contaje:

El contaje consiste en el proceso de recuento de las células blancas (viables) y azules (no viables),
y posteriormente calcular la proporción de células vivas y para ello las células se separan del so-
porte sólido cambiando el pH o utilizando determinados enzimas.
Se puede llevar a cabo en las cámaras de contaje celular o hemocitómetro.
La más utilizada es la cámara de Neubauer. Es un portaobjetos especial, de un grosor muy su-
perior a un portaobjetos convencional, que tiene en el centro una depresión central con dos surcos
laterales y tiene grabada una cuadrícula para los recuentos de dichas células.

Visualización microscópica de uno de los cuadrados de esquina de la

cámara de Neubauer (línea discontinua roja) cargada con una suspensión
celular teñida con azul tripán. En el cuadrado se observan 18 célulasazules
(no viables) y 30 células blancas (viables).

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5- EL SOPORTE FÍSICO

La mayor parte de las células en cultivo crecen adheridas a la superficie del recipiente en el que se
efectúa el cultivo. Por ello, a la hora de planificar un cultivo hay que tener en cuenta tres aspectos
relativos a los recipientes: el material o sustrato con el que están fabricados, su diseño o forma y los
posibles tratamientos de la superficie.

*Materiales para cultivo

El material con que se fabrican recipientes destinados a cultivos celulares debe permitir la
adhesión de las células, que sea fácil su esterilización y tener una mínima calidad óptica para poder
visualizar el cultivo con un microscopio invertido.

 Vidrio. Es reutilizable, fácil de limpiar y de esterilizar por calor en autoclave. Además,

tiene muy buena calidad óptica para observaciones microscópicas.
 Plástico desechable. Actualmente es el material más utilizado por su bajo coste, su
facilidad de esterilización por irradiación y su buena calidad óptica.
 Matrices tridimensionales. Se consigue con materiales que forman estructuras tridi-
mensionales porosas como los geles de colágeno o las esponjas de celulosa, recubiertas o
no por colágeno.
 Microesferas de poliacrilamida. Las células pueden crecer adheridas a estas microesferas
en el seno del medio de cultivo, aumentando la superficie de crecimiento disponible.

*Características y tipos de recipientes de cultivo

Existe una amplia variedad de recipientes para cultivo, el parámetro más importante es la
superficie útil de cultivo, porque con base en ese valor se calcula la cantidad de células que se siembran y
se prevé el número aproximado final de células. Entre los más habituales están los siguientes:

 Tubos Shell
Tubos pequeños con un cristal en el fondo sobre el que se pegan las
células. Se utilizan para cultivos rápidos y estudio inmunológico.

 Placas multipocillo
Son placas con un número variable de pocillos
(6 y 96 pocillos) con fondo habitualmente plano.
Tapa no hermética.
Útiles para experimentos puntuales con distintas líneas celulares o
diferentes condiciones de cultivo.

 Un tipo particular son las placas Transwel

Tienen cámaras independientes que encajan en los pocillos y
cuyo fondo consiste en una membrana plástica porosa. Son útiles
para realizar experimentos simultáneos con distintas líneas celulares
o diferentes condiciones de cultivo, pero presentan mayor riesgo de
contaminación. Muy usados para cultivo de células epiteliales

 Frascos o botellas roux (frascos T)

Son idóneos para todo tipo de cultivos, en los que la superficie de crecimiento es un
portaobjetos del mismo material que el resto del frasco.

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 Botellas para incubadores tipo roller.

Son botellas cilíndricas, con una gran superficie de crecimiento.

Específicas para incubar sobre rodillos que las hacen girar lentamente. Las células pueden
crecer en toda la superficie interior de la botella cuando se necesita gran expansión de la
línea celular.

 Biorreactor
Consiste en introducir las células en el medio de cultivo y reproducir las condiciones
adecuadas para el desarrollo de su metabolismo. Este aparato aumenta la actividad celular,
con tiempos de cultivo más cortos, lo que reduce los riesgos de contaminación.
La aireación y la agitación son los factores más críticos en un biorreactor. Esto se debe a
que una elevada agitación contribuye al deterioro de las células y un cultivo con deficiente
aireación dificulta el crecimiento celular.

*Posibles tratamientos de las superficies

Con la finalidad de posibilitar o mejorar la adhesión de las células a las superficies de estos
materiales de cultivo, se pueden tratar con proteínas naturales como colágeno y laminina, aunque también
se han ensayado en cultivos especificos otras proteínas sintéticas.
El tratamiento puede realizarse antes del cultivo, inundando el recipiente de cultivo con una solu-
ción estéril de la proteína, o bien añadiéndola al medio de cultivo como un componente más.

6- DESCONGELACIÓN DE CÉLULAS

La descongelación de células es un procedimiento habitual del laboratorio de cultivos celulares

para iniciar cultivos, en el caso de que se utilicen líneas celulares mantenidas en congelación, en
nitrógeno líquido a -80 °C.
La crioconservación nos permite almacenar alícuotas celulares indefinidamente en diferentes
viales en un medio de cultivo con alta relación suero/proteína y una sustancia crioprotectora.
Se almacenan en los laboratorios en los llamados “crioviales”, marcados con la línea celular de
procedencia, el número de pases, la densidad celular, la fecha de congelación, etc.

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7- INICIO DEL CULTIVO (SIEMBRA)

Partiendo de una suspensión celular obtenida por disgregación, selección o descongelación, el cultivo
se inicia sembrando un número determinado de células. Este procedimiento implica:

 Elegir el tipo de recipiente que se va a utilizar para el cultivo.

 En virtud del recipiente, establecer el número de células que se van a sembrar inicialmente.
 Hacer recuento de células viables en la suspensión.
 Transferir un volumen de suspensión que contenga el número de células deseado a un tubo
falcon y lavarlas con medio de cultivo completo precalentado a 37 °C.
 Diluir las células con el volumen adecuado de medio de cultivo completo e introducirlas en
el recipiente de cultivo específico, como los que hemos visto en el apartado anterior.
 Colocar el recipiente de cultivo en un incubador a la temperatura adecuada (normalmente
37 °C), con la proporción de CO2 requerida (del 5%, habitualmente) y 95% de humedad.

8- FORMAS DE CRECIMIENTO

Una vez que a las células se incuban empiezan a crecer. El crecimiento de las células en el
cultivo puede ser de dos formas: en monocapa y en suspensión.

 Crecimiento en monocapa:

El crecimiento en monocapa consiste en que las células crecen adheridas sobre una superficie
sólida, ya sea plástico o vidrio.
Este tipo de células se dice que son dependientes de anclaje, es decir, necesitan adherirse a una su-
perficie sólida para poder crecer. Es el método utilizado para el cultivo de la mayoría de las células.
En el crecimiento en monocapa se pueden distinguir diferentes etapas de desarrollo:

1. Adhesión a una superficie. Corresponde al periodo durante el cual las células se van adhi-
riendo al soporte y coincide con el llamado periodo o fase de latencia.

Colonias de células HeLa creciendo sobre una Cultivo de fibroblastos en confluencia

superficie plástica.

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2. Proliferación y formación de colonias. Una vez que las células se han pegado a la pared
del frasco de cultivo, empiezan a proliferar, expandiéndose por toda la superficie y formando
colonias celulares.
Esta etapa de crecimiento se corresponde con la llamada fase exponencial.

3. Inhibición por contacto. Con el paso del tiempo, las células ocupan toda la superficie
disponible y entran en confluencia, estableciendo contactos entre ellas. En este momento
se produce un fenómeno denominado inhibición por contacto y las células detienen su cre-
cimiento, aunque se mantienen vivas.
Se inicia la fase estacionaria, es en esta fase cuando la morfología y la fisiología de las
células se parecen más a las de las células de origen.
Para que las células reanuden su crecimiento se necesita hacer un subcultivo o «pase» de
parte de las células a un nuevo frasco de cultivo. El momento idóneo para realizarlo es el final
de la fase exponencial, antes de la fase estacionaria.

La “dinámica de crecimiento” de un cultivo, es decir, la concentración de células por los días de

evolución del cultivo, se corresponde con las diferentes fases, la fase de latencia es en las primeras 24
horas de evolución del cultivo, en las que no se produce crecimiento el número de células se mantiene
constante o incluso puede disminuir ligeramente. A continuación la fase de crecimiento exponencial,
dura aproximadamente 6-7 días y corresponde a la fase en la que el número de células aumenta de manera
exponencial hasta alcanzar un máximo llegando a la fase estacionaria donde el número de células
permanece constante.
No todos los tipos celulares tienen la misma facilidad para crecer en cultivo. En general, se puede
afirmar que un tipo celular será tanto más fácil de cultivar cuanto mayor sea la capacidad de sus células
de dividirse o diferenciarse en otras células, dependiendo de las condiciones de cultivo, tan diferentes a
las condiciones fisiológicas tisulares.

Curva de crecimiento de un cultivo

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 Crecimiento en suspensión:

Crecen sin necesidad de adherirse al sustrato, son independientes del anclaje y no presentan inhibición
por contacto. En el crecimiento en suspensión las células no necesitan pegarse a una superficie para crecer,
por lo que se mantienen dispersas en el seno de medio de cultivo y proliferando.
Este tipo de crecimiento es típico de células sanguíneas circulantes, células hematopoyéticas,
células madre, algunas líneas tumorales y algunas líneas celulares transformadas.
También en el crecimiento en suspensión se pueden distinguir diferentes momentos o etapas de
desarrollo:

1. Adaptación al medio de cultivo. Es un período, relativamente corto, en el que las células

se adaptan al medio y las condiciones de cultivo, antes de iniciar la proliferación. Se
corresponde con la fase de latencia.

2. Proliferación en suspensión. Una vez adaptadas, las células dispersas en el medio de

cultivo empiezan a proliferar aumentando exponencialmente su número, es la fase de
crecimiento exponencial.

3. Inhibición por densidad. Llega un momento en el cultivo en el que se alcanza un

número crítico de células en relación con el volumen de medio de cultivo y los nutrientes
que quedan en él. En ese momento se produce el fenómeno de inhibición por densidad
y las células dejan de crecer, aunque se mantienen vivas. Se corresponde con el final de
la fase exponencial y empezaría la fase estacionaria. Al igual que en los cultivos en
monocapa, es necesario hacer un “pase” o subcultivo para que el crecimiento se reanude.

9- COMPORTAMIENTO VITAL TRAS SUCESIVOS PASES

Los sucesivos pases a partir del cultivo primario, ya sea en monocapa o en suspensión, dan
origen a una línea celular primaria o a una línea celular continua.
El cultivo primario es el que se obtiene a partir de células o cualquier tipo de tejido de un
ser vivo, sin fase previa de crecimiento in vitro, normalmente se realiza a partir de tejidos
embrionarios y células tumorales (HeLa), dando los mejores resultados debido a que su grado de
diferenciación es menor y su capacidad de división mayor.

 Línea celular primaria

La línea celular primaria es aquella obtenida a partir de un tejido u órgano mediante un cultivo
primario y que se mantiene en cultivo mediante “pases” durante un tiempo limitado.
La población celular aumenta en cada pase, se multiplica el número de frascos de cultivo y
normalmente, a partir del tercer pase se estabiliza.
Esto significa que las células se hacen uniformes y homogéneas, manteniéndose las
características morfológicas y fisiológicas estables durante las sucesivas generaciones. Cuando el cultivo
primario se realiza a partir, por ejemplo, de un tejido o células recién extraídas vivas y crecen de
forma similar al tejido de origen, son células indiferenciadas similares al tejido de donde
proceden, con el cariotipo original.

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Senescencia
Las líneas celulares primarias tienen una vida finita, es decir, se mantienen en crecimiento
durante un número determinado de “pases”, característico de cada tipo celular (suele oscilar entre 20
y 100) y después entran en la denominada fase de senescencia. La fase de senescencia es la etapa en la
que las células van perdiendo su capacidad de dividirse y el cultivo acaba muriendo.
Esto es debido a un acortamiento progresivo de los telómeros en cada división. Si se acortan
los telómeros, las células van acumulando anomalías genéticas y perdiendo funciones. Se puede
conservar una línea celular primaria congelando las células antes de alcanzar la senescencia, a ser
posible, en los primeros “pases”. Hay que anotar siempre el número de pases del que proceden las
células congeladas, para saber aproximadamente cuántos pases les quedan antes de que el cultivo
muera.

 Línea celular continúa

Las líneas celulares continuas son aquellas que se obtienen a partir de un cultivo primario,
pero que se mantienen en cultivo por tiempo ilimitado mediante “pases seriados”. Si uno o varios tipos
de células de un cultivo primario se “resiembran” de una fase de crecimiento “in vitro”, se llaman
continuas o secundarias.
Normalmente esa producción tiene que evitar que el medio de cultivo se agote y el medio
utilizado determinará qué células se desarrollarán. Se diferenciarán genéticamente unas de otras, en
algunas ocasiones estas líneas aparecen espontáneamente en algunos cultivos y se mantienen durante
más pases de los esperados.
Esto es debido a la aparición en el cultivo de células inmortales, capaces de originar líneas
estables y permanentes. También se podrían inducir incorporando el gen de la telomerasa (enzima que
mantiene la integridad de los telómeros) de forma activa y reparar la pérdida de los telómeros en cada
división, así las células pueden proliferar indefinidamente.
Suelen aparecer como consecuencia de un fenómeno de transformación de las células normales,
relacionado con la pérdida de los mecanismos de control celular. Las células transformadas tienen
unas características especiales:

 Crecen indefinidamente en cultivo (son inmortales).

 Pierden la dependencia del anclaje para crecer, por lo que pueden crecer en suspensión.
 Pierden la inhibición por contacto.
 Pueden invadir tejidos y producir tumores.
 Al final acumulan anomalías genéticas, con múltiples aberraciones cromosómicas.

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10-MANTENIMIENTO DEL CULTIVO

El mantenimiento de los cultivos consiste en diferentes operaciones para el control de su

viabilidad y crecimiento. Las operaciones más habituales son el control periódico microscópico, el
cambio de medio y los subcultivos o pases.

 Control periódico microscópico

Los cultivos se controlan microscópicamente con la periodicidad que se estime oportuna

(normalmente entre 1 y 3 días), para lo cual se retiran del incubador y se examinan con un microscopio
invertido para observar la apariencia y el crecimiento de las células.

 Cambio de medio

La operación de mantenimiento más frecuente es el cambio de medio de cultivo, para renovar los
nutrientes consumidos por las células y retirar los productos de desecho generados por el meta-
bolismo celular.
El cambio de medio se suele realizar cada 2-3 días y, en cualquier caso, siempre que se observe
un cambio de color del medio (viraje del indicador de pH).
El cambio de medio nunca es total, sino que se cambian sólo 2/3 de su volumen. De esta
manera se consigue que posibles sustancias beneficiosas para el cultivo producidas y secretadas por
las células se mantengan en él. Una vez cambiado el medio se reanuda la incubación.

 Subcultivo o pase

Tras un cierto tiempo de cultivo (6-7 días), los cultivos en monocapa se encuentran en situación
de confluencia (muchas células y pocos nutrientes) y los cultivos en suspensión alcanzan una
densidad crítica. En ambos casos el crecimiento se detiene y hay que realizar un subcultivo o pase.
En los cultivos en suspensión, se realiza un recuento de viables y se calcula el factor de
dilución necesario para que la densidad celular sea la adecuada para reiniciar el crecimiento.
En los cultivos en monocapa es necesario despegar las células de la superficie del recipiente para
poder hacer el pase. Esto ya lo vimos y se puede hacer por métodos mecánicos, con un “rascador”, pero el
procedimiento más habitual es la tripsinización. La tripsina, es como si “frenara” y separara las células
del sustrato, porque digiere las proteínas responsables de la adhesión a la superficie y el EDTA retira del
medio los iones de Ca2+, que estabilizan la interacción célula-sustrato. Si se añade suero a continuación,
lo habitual es que el suero contenga un inhibidor de tripsina y el resultado es la expansión del cultivo.

11- CONSERVACIÓN DE CÉLULAS

El método habitual de conservación de líneas celulares, como ya hemos mencionado, es la

congelación.
Para llevarla a cabo se procede como si se fuese a realizar un pase:

Cuando se ha obtenido una suspensión de células, se lavan con medio de cultivo y

se hace un recuento de viables, se añade un crio-preservante, se realizan alicuotas
en criotubos y se procede a congelación progresiva:

o -20 °C durante 24 h.
o -80 °C durante más de 24 h.
o en nitrógeno líquido indefinidamente.

IES Frei Martín Sarmiento 14