TEMA 16

Técnicas de separación

❑Introducción
❑Clasificación
❑Mecanismos
❑Cromatografía plana
❑Cromatografía en columna
❑Cromatografía de gases
❑Cromatografía de líquidos de alta resolución

Ana Belén Martínez Piernas. Departamento de Química Analítica

Introducción
Cromatografía: es una técnica de separación que se utiliza para la caracterización de mezclas complejas y cuyo objetivo
es separar los distintos componentes. Los analitos se separan en base a la distinta velocidad de desplazamiento cuando
son arrastrados por una fase móvil a través de un lecho cromatográfico que contiene a una fase estacionaria (sólida o
líquida).

• Fase móvil: fluye a través de una fase estacionaria, arrastrando con ella a los compuestos de la mezcla.
• Fase estacionaria: en la cual están retenidos los componentes de la muestra, y a través de la cual fluye la fase móvil
arrastrando a los mismos.

Inicio de análisis:
Fase móvil
Fase estacionaria
Más interacción con la fase estacionaria

Durante el proceso cromatográfico: Menos interacción con la fase estacionaria

Fase móvil Detector

Fase estacionaria
Introducción
Fundador de la cromatografía (1903)

Mijaíl Tsvet
Clasificación de los métodos cromatográficos
Los analitos
muy grandes
son excluidas
El analito se
adsorbe sobre la
fase estacionaria
sólida

Cromatografía de adsorción Cromatografía de exclusión

Los aniones móviles

son atraídos por los
cationes fijos de la
Los analitos se fase estacionaria
disuelven en la
fase estacionaria
líquida El analito se retiene
sobre la fase
estacionaria
(cambiador de iones)
por atracción
electrostática
Cromatografía de partición Cromatografía de intercambio iónico
Clasificación de los métodos cromatográficos

Tipo de cromatografía Fase estacionaria Fase móvil Interacción

Adsorción sólido líquido-gas fuerzas Van der Waals
Exclusión gel líquido tamaño partícula
Partición líquido líquido-gas solubilidad
Intercambio iónico resina líquido Fuerzas electrostáticas
Clasificación de los métodos cromatográficos
En función de la forma en la que se lleve a cabo:
• Plana: la fase estacionaria se coloca sobre una superficie plana.
• Columna: se utiliza un cilindro como soporte de la fase estacionaria y se hace pasar a través de él la fase móvil.

Cromatografía plana Cromatografía en columna

Clasificación de los métodos cromatográficos
1. Cromatografía plana

Fase estacionaria Adsorbente:

• Gel de sílice
• Poliamida
Papel Adsorbente en soporte
Soportes:
• Láminas de vídrio, plástico
o metálica
Cromatografía en papel Cromatografía en
capa fina
Clasificación de los métodos cromatográficos
1. Cromatografía plana

1 2 3

Fase
estacionaria

Fase móvil Muestra Analito A Analito B

• La fase móvil se desplaza por capilaridad.

• Sólo pueden emplearse líquidos como fases móviles.
Clasificación de los métodos cromatográficos
2. Cromatografía en columna:
• Cromatografía de líquidos • La fase móvil se desplaza por capilaridad, gravedad o presión.
• Cromatografía de gases • Pueden emplearse como fases móviles líquidos o gases.
• Cromatografía de fluidos supercríticos

Fase móvil

Carga de
muestra
Separación
muestra Interacción
fuerte
Fase
estacionaria Interacción
débil

Elución
analitos
[Link]
Cromatografía en columna
Teorías sobre la cromatografía en columna
Hay dos teorías para explicar el proceso cromatográfico en columna:
1. Teoría clásica o estática: propuesta en 1941, en la cual se asimila la columna cromatográfica con una columna de
destilación. Se considera un sistema estático en equilibrio, en el cual el analito recorre la columna mediante una serie
de equilibrios.
2. Teoría cinética o dinámica: propuesta en 1956 por Van Deemter, que considera el proceso dinámico de la separación.
La velocidad de la fase móvil tiene una incidencia en el avance de los analitos, su dispersión y, por tanto, en la eficacia
de la separación.
Cromatografía en columna
Consideraciones generales

Flujo fase móvil Elución analitos

Detector

Cromatograma
Señal detector

Pico cromatográfico

tiempo
Cromatografía en columna
Parámetros cromatográficos generales

Señal detector
tiempo
• Tiempo de retención (tR) de un componente: tiempo transcurrido entre el instante de la introducción de la
muestra en la columna y el momento en que dicho componente alcanza el máximo de señal en el detector.

• Tiempo muerto (tM o t0): tiempo necesario para que la fase móvil (o un constituyente no retenido ) llegue al
detector.
𝑡𝑅 − 𝑡𝑀
𝑘= Parámetros que influyen: fase móvil y fase estacionaria
• Factor de retención (k) de un componente: 𝑡𝑀
Cromatografía en columna
Parámetros cromatográficos: Resolución

Resolución: La resolución indica la capacidad de una

columna para separar los picos cromatográficos de interés.

Viene determinada por:

• Separación entre picos: tR2 – tR1
• Anchura de pico a línea base: Wb1; Wb2

La mayor eficiencia en la separación (resolución) se da cuando los picos cromatográficos son estrechos y están bien separados.
Cromatografía en columna
Parámetros cromatográficos: Resolución

+ Resolución – Resolución
Cromatografía en columna
Parámetros cromatográficos: Resolución

Resolución insuficiente.
Señal detector

Mejora debido al aumento de la separación entre picos

(diferencia en tiempos de retención).

Mejora debido a la disminución del ancho de banda.

tiempo
Cromatografía en columna
Eficacia de la separación cromatográfica
La eficacia de una columna para separar analitos es mayor a mayor número de platos teóricos (N). Las columnas con un
número alto de N son más eficientes porque generan picos más estrechos que una columna con un valor N más bajo.
H
𝐿
𝑁=
𝐻

Parámetros que influyen sobre la eficacia de una columna:

• Longitud de la columna (L): a mayor longitud, mayor eficacia.
• Tamaño de partícula (H): a menor tamaño de partícula, mayor eficiencia.
Cromatografía en columna
Eficacia de la separación cromatográfica

HETP: Poder de resolución de una columna (m)

A: Parámetro de difusión turbulenta (m)
B: Coeficiente de difusión (dispersion, m2/s)
C: Resistencia al coeficiente de transferencia de masa (s)
u: Velocidad lineal (m/s)

¿Qué ocurre si la velocidad no es la óptima?

Fenómenos de ensanchamiento de banda

Cromatografía en columna
Fenómenos de ensanchamiento de banda

El ensanchamiento de la banda depende de la velocidad de transferencia finita del analito entre la fase móvil y la fase estacionaria en cada
plato teórico. Este ensanchamiento se debe a un avance diferente de las moléculas de un mismo soluto a través de la columna.

No todas las moléculas de un mismo soluto fluyen de igual forma en el mismo instante de tiempo, es decir, no presentan un
comportamiento ideal. Este comportamiento no ideal se debe a tres factores:

1. Difusión en remolino: se debe a los distintos caminos que toman las moléculas del analito al atravesar la fase estacionaria.
2. Difusión longitudinal: se debe a que las moléculas del analito se mueven en distintas direcciones en la fase estacionaria debido a la
porosidad de las partículas que la forman.
3. Transferencia de masa entre las fases: se debe a que al pasar la fase móvil por un canal entre las partículas de la fase estacionaria, no
todas las moléculas del soluto se transfieren a igual velocidad entre la fase móvil y la fase estacionaria en cada plato teórico.
Difusión longitudinal Transferencia de masa entre las fases
Difusión en remolino Término B/u Término Cu
Múltiples trayectorias, término A
Cromatografía en columna
Modalidades de elución

• Isocrática: las condiciones cromatográficas permanecen constantes durante la separación.

• Gradiente: las características de la elución se van modificando durante la separación. Mejor resolución de mezclas
complejas.

Elución isocrática (rápida) Elución isocrática (lenta) Elución en gradiente

Cromatografía en columna
Tipos de análisis

• Análisis cualitativo: el tiempo de retención es característico de cada componente en cada sistema cromatográfico. La identificación
requiere el uso de patrones en las mismas condiciones cromatográficas.

• Análisis cuantitativo: se basa en la comparación del área (o altura de pico) del componente de interés con la de estándares de esta
sustancia de concentración conocida, admitiendo que existe una relación lineal entre el área o altura de pico y la concentración en un
determinado intervalo de concentraciones.

Patrón analítico Muestra

Cromatografía de gases
• Fase móvil: es un gas inerte que transporta a los solutos a través de la columna cromatográfica. Suele denominarse gas portador.
• Fase estacionaria:
• Un sólido (cromatografía gas-sólido). La retención ocurre por adsorción. Poco frecuente.
• Un líquido no volátil (cromatografía gas-líquido) inmovilizado o químicamente enlazado (fase enlazada) sobre la superficie de un
sólido inerte. Se trata de una cromatografía de partición. Los analitos se distribuyen entre las fases móvil (gaseosa) y estacionaria
(líquida). Muy usada.

Controlador Puerto de • La muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza

flujo inyección de la columna cromatográfica.
• La separación se basa en el equilibrio de
distribución de los analitos entre la fase
Registrador de señal estacionaria líquida (o solida) y la fase móvil
gaseosa.
Columna Detector

Horno de columna Factores que más influyen en la separación (para una fase estacionaria dada):
• Temperatura de la columna
Gas portador • Volatilidad de los analitos
Cromatografía de gases

Fase móvil: gas portador

Función:
• Transportar los componentes de la muestra a través de la columna
• Crear una matriz adecuada para el detector

Requisitos:
• Debe ser inerte para evitar interacciones (tanto con la muestra como con la fase estacionaria)
• Adsorción nula en la fase estacionaria
• Debe ser capaz de minimizar la difusión gaseosa
• Fácilmente disponible y puro
• Económico
• Adecuado al detector a utilizar

He es el gas mas utilizado, también N2, H2 y Ar

Cromatografía de gases

Sistema de inyección de la muestra

Inyector con/sin división de flujo (Split/splitless)
Función:
• Introducir la muestra en la cabeza de la columna cromatográfica Tapón de goma (septum)
Purga
Entrada gas
Requisitos: portador
• Debe permitir la introducción de una muestra de tamaño adecuado de
forma rápida. Bloque metálico Salida válvula split
calentado
Características Cámara de vaporización
• La muestra (1-2 µl) se inyecta a través del septum con una microjeringa. Tubo de vidrio
Cabeza de columna
Formas de inyección:
• Inyección splitless: la muestra inyectada se vaporiza en la corriente de gas
portador, y todo se introduce en la columna. Se aplica a muestras diluidas
(ej. análisis de trazas).
• Inyección split: la muestra inyectada se vaporiza en la corriente de gas
portador, y sólo parte de lo inyectado se introduce en la columna.
• Relación de split = (flujo col. + flujo salida válvula)/ flujo de columna Típica:
10:1, 100:1
Cromatografía de gases
Columna cromatográfica termostatizada
La columna contiene la fase estacionaria donde se produce la separación cromatografica. Se dice que es el corazón del cromatógrafo.

Ventajas de las columnas capilares:

• Mejor resolución
• Mayor sensibilidad
• Menor tiempo de análisis

Sección de una columna capilar de sílice fundida

Recubrimiento de poliimida
Tubo de sílice fundida
Fase estacionaria químicamente enlazada
Cromatografía de gases
Fases estacionarias: juegan un papel decisivo en la separación al interaccionar con los analitos.

• Sólidas: poco frecuentes. Compuestas por sílice (SiO2), alúmina (Al2O3) y tamices moleculares.
• Líquidas: muy frecuentes. Son fases enlazadas, ya que las moléculas de la fase líquida están unidas covalentemente al soporte sólido.
Minimizan la pérdida de fase estacionaria de la columna. Gran variedad de fases.

Requisitos:
• Baja volatilidad: T de ebullición al menos +100º T máxima de trabajo.
• Estabilidad térmica.
• Deben ser químicamente inertes (no reaccionar).

¿Cómo seleccionar una fase estacionaria en función de los analitos a determinar? → Selección empírica
• Selectividad: los componentes de la mezcla a separar deben disolverse de forma diferente
• Polaridad: debe ser semejante a la de los analitos que se quieren separar
• Compuestos polares: fases estacionarias polares, suelen tener grupos tipo –CN, -CO, -NH.
• Compuestos apolares: fases estacionarias apolares (cadenas CH)
Cromatografía de gases Isotérmico 45 ºC
Temperatura de la columna
Es una variable crucial en las separaciones por cromatografía de gases y afecta a la
distribución de los analitos entre la fase móvil y la estacionaria.

Isotérmico 145 ºC
• Isotérmicamente: no se modifica la temperatura durante el análisis. Poco
frecuente.
• Con rampa de temperatura (gradiente): se modifica la temperatura durante la
separación. Cuando se aumenta la temperatura de la columna se acelera la
elución. Mejor resolución de mezclas complejas. Muy frecuente.

T (ºC) T (ºC) Rampa de temperatura

tiempo (min) tiempo (min)

Cromatografía de gases

Detectores

Función:
Proporcionar una señal al producirse la salida de cada soluto de la columna cromatográfica.

Requisitos:
• Adecuada sensibilidad
• Buena estabilidad y reproducibilidad
• Respuesta lineal en un intervalo amplio de concentración
• Amplio intervalo de temperatura de trabajo
• Tiempo de respuesta corto

Clasificación
• Universales: responden de forma semejante a todos los compuestos (o muchos).
• Selectivos: responden a determinadas familias de compuestos.
Cromatografía de gases

Detectores

1. Detector de Ionización en llama (FID)

Fundamento: al quemarse en una llama, los compuestos orgánicos se disocian produciendo iones y electrones que pueden conducir la
corriente eléctrica. Se mide la intensidad de corriente entre dos electrodos situados a los lados de la llama.

Características:
• Casi universal: compuestos orgánicos combustibles. Los gases no combustibles,
como CO2, SO2, óxidos de nitrógeno (N2O, NO, NO2) y NH3 no producen respuesta
en este detector.
• Elevada sensibilidad.
• Amplio intervalo lineal de respuesta.
• Bajo ruido de fondo.
• Detector destructivo.
Cromatografía de gases

Detectores

2. Detector de captura electrónica

Fundamento: Emplea un emisor radiactivo para producir un flujo de electrones, que disminuye cuando salen de la columna especies
capaces de capturar electrones como son los compuestos con átomos de halógenos (Cl, Br, etc).

Características:
• Especifico y muy selectivo para especies electronegativas (ej: halógenos)
• No destructivo
• Elevada sensibilidad
Cromatografía de gases
Detectores
3. Ionización por impacto electrónico/espectrometría de masas (EI-MS)
Fuente de ionización EI:
La fuente de ionización proporciona iones de los analitos de interés (moléculas orgánicas) en fase gaseosa mediante la aplicación de un haz
de electrones de elevada energía. Una vez obtenidos estos iones, se utiliza una placa con carga positiva para repeler los iones y expulsarlos
del haz de electrones. Se aplica un potencial eléctrico elevado para atraer los iones al analizador de masas.

Fuente de ionización EI
Esquema general instrumento EI-MS

M + e- → M+ + 2e-
Cromatografía de gases
Detectores
3. Ionización por impacto electrónico/espectrometría de masas (EI-MS)
Analizador de masas
Una vez que los iones salen de la fuente de ionización, entran en el analizador de masas donde se aplican potenciales de radiofrecuencia
para separarlos de acuerdo con su relación de masa/carga (m/z) y llegan al detector.

Características:
• Proporciona mucha más información cualitativa que el resto de
detectores.
• Resuelven fácilmente iones que tienen una diferencia de masas de la
unidad.
• Alta sensibilidad y selectividad.
• Facilidad de uso.
• Barrido rápido.
• Amplio intervalo lineal de respuesta.
• Detector destructivo.
• Instrumentación costosa.
Cromatografía de gases
Aplicaciones

La principal aplicación de la cromatografía de gases es separar y analizar compuestos orgánicos volátiles.

• Análisis de plaguicidas (insecticidas, herbicidas y funguicidas) en aguas, suelos, alimentos, etc.
• Análisis de disolventes organoclorados en aguas, suelos, etc .
• Análisis de compuestos orgánicos en general.
Cromatografía de líquidos de alta resolución – Instrumentación general
La cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) emplea fases estacionarias de pequeño tamaño de partícula (entre 2
y 5 μm), y un sistema de alta presión para impulsar la fase móvil.

• Fase móvil: líquida.

• Fase estacionaria: puede ser un sólido o un líquido inmovilizado o químicamente enlazado sobre la superficie de un sólido inerte.

Van Deemter
Altura de plato (µm)

A menor tamaño de partícula (fase estacionaria) → Mayor eficacia de la columna → Mejor resolución

Flujo de fase móvil (mL/min)

Cromatografía de líquidos de alta resolución – Instrumentación general
Sistema convencional HPLC
Muestra

Inyector/ Válvula de inyección

Depósito de
Bomba de
fase móvil
propulsión
Columna
Detector
Señal

Registrador
de señal Deshecho
Cromatografía de líquidos de alta resolución – Instrumentación general
Elementos opcionales

Inyector
automático
Válvula de inyección
Fases móviles

Detector
Bomba B
Bomba A Columna

Deshecho Colector
Colector de de fracciones
fracciones

Mixer
Desgasificador
Sistema para trabajar en Válvula de purga
gradiente (2 o más disolventes)
Cromatografía de líquidos de alta resolución – Instrumentación general
Bomba de fase móvil

Función: Impulsar la fase móvil a través de la fase estacionaria

Requisitos:
• Generación de altas presiones (por encima de 6000 psi ~ 400 bar)
• Flujo libre de pulsos
• Intervalo de caudales de 0.1 a 10 mL/min muy reproducible (con control del 0.5%)
• Componentes resistentes a la corrosión (acero inoxidable o teflón)
• Debe permitir la desgasificación de los disolventes
Cromatografía de líquidos de alta resolución – Instrumentación general
Modalidades de elución

• Isocrática: la composición de la fase móvil permanece constante durante la separación.

• Gradiente: la composición de fase móvil se va modificando durante la separación. Mejor resolución de mezclas
complejas.

Elución isocrática (rápida) Elución isocrática (lenta) Elución en gradiente

Gradiente empleado
80 % AcN
45 % AcN
30 % AcN
 Cromatografía de líquidos de alta resolución – Instrumentación general
Válvula de inyección de muestra
Función: introducción de un volumen preciso de muestra en la corriente de fase móvil.
Requisitos:
• Inyección rápida para perturbar lo menos posible el régimen de circulación de fase móvil.
• Inyección reproducible.
Válvula de inyección rotatoria de 6 puertos
1. Posición carga de muestra 2. Posición inyección de muestra

Columna Columna

giro

Fase móvil Fase móvil

[Link]
Cromatografía de líquidos de alta resolución – Instrumentación general
Columna
La columna contiene la fase estacionaria donde se produce la separación cromatográfica. Se dice que es el corazón
cromatográfico.
Tipos de relleno de columna (fase estacionaria)
Las columnas de
HPLC son tubos
rectos de acero

Longitud: 5 – 30 cm Pelicular, Partícula porosa,

diámetro 30 – 40 µm diámetro 3 – 10 µm

• El control de la temperatura de la columna no es estrictamente necesario.

Diámetro: 2.3 – 10 mm
Cromatografía de líquidos de alta resolución – Instrumentación general
Detectores
Función: proporcionar una señal al producirse la salida de cada analito de la columna cromatográfica

Requisitos:
• Adecuada sensibilidad
• Buena estabilidad y reproducibilidad
• Respuesta lineal en un intervalo amplio de concentración
• Bajo ruido de fondo
• Tiempo de respuesta corto
• La celda de flujo debe tener un volumen mínimo para no provocar ensanchamiento de las bandas
• En caso de gradiente debe ser insensible a los cambios de composición de la fase móvil

La mayoría de los detectores responden a alguna propiedad característica de los compuestos a analizar.
Cromatografía de líquidos de alta resolución – Instrumentación general
Detectores
1. Detector espectrofotométrico: Mide la absorbancia en la región del ultravioleta-visible
(UV-Vis)

Requisitos:
• El analito debe absorber radiación. Se usa mucho la región UV donde absorben muchos
compuestos.
• La fase móvil no debe ser muy absorbente. Puede emplearse con gradiente si se utilizan
disolventes no absorbentes.
• Puede seleccionarse una longitud de onda o varias e incluso registrar espectros
completos.
Cromatografía de líquidos de alta resolución – Instrumentación general
Detectores
2. Detector espectrofluorimétrico: mide fluorescencia.

Requisitos:
• Muy sensible.
• Aplicable sólo a compuestos fluorescentes. Pueden realizarse reacciones de formación
de compuestos fluorescentes.
Cromatografía de líquidos de alta resolución – Instrumentación general
Detectores
3. Ionización por electrospray/espectrómetro de masas (ESI/MS): requiere de una fuente de ionización para volatilizar los
compuestos en estado líquido y formar iones antes de la entrada al detector. La más utilizada es la fuente de ionización por
electrospray (ESI). El acoplamiento de la ESI con MS proporciona información estructural sobre los componentes eluidos
permitiendo la identificación inequívoca de compuestos. Es casi universal.

Esquema ESI Analizador MS

Muestra líquida Capilar

Analizador de masas

3-4kV
Gota cargada

Evaporación Fisión Ion solvatado

del disolvente Características: ver diapositiva 31
Cromatografía de líquidos de alta resolución
Los analitos se
disuelven en la
Cromatografía de partición: es la mayoritariamente empleada en sistemas HPLC. Los solutos se fase
estacionaria
separan por su diferente solubilidad en las fases móvil y estacionaria. líquida

Fase estacionaria: líquido retenido sobre un soporte sólido o fases enlazadas unidas químicamente al
soporte sólido. Dependiendo de la polaridad de la fase estacionaria, se pueden clasificar en normal y reversa
Cromatografía de partición

Fase estacionaria polar Fase móvil apolar

Cromatografía de reparto en fase normal: analitos polares

Fase estacionaria apolar Fase móvil polar

Cromatografía de reparto en fase reversa: analitos apolares

Cromatografía de líquidos de alta resolución
Cromatografía de partición
Fase estacionaria polar Fase estacionaria apolar
Cromatografía en fase normal Cromatografía en fase reversa

Una vez fijada la fase

estacionaria, las
características del a fase
móvil son el factor clave
para la separación
cromatográfica.

Polaridades de los analitos: A < B < C

Cromatografía de líquidos de alta resolución
Aplicaciones
La principal aplicación es separar y analizar compuestos orgánicos de bajo peso molecular (<3000).

• Análisis de plaguicidas (insecticidas, herbicidas y funguicidas).

• Análisis de fármacos y productos de higiene personal.
• Análisis agroalimentario (compuestos naturales, contaminantes)
• Anaálisis ambiental (plaguicidas, contaminantes orgánicos, etc)