PRÁCTICA 14 Análisis de los productos amplificados por PCR_Determinación Rh
FUNDAMENTO
Para entender bien el funcionamiento de la PCR hay que estudiar en profundidad cuatro aspectos:
-la composición de la mezcla de reacción. -la programación del termociclador.
-la preparación de las muestras. -el análisis de los productos amplificados.
En esta práctica nos centraremos en el análisis de los productos amplificados por PCR, para determinar
el factor Rh.
Tras la extracción de ADN de saliva/sangre, y la amplificación de los segmentos de ADN del gen D, vamos a
comprobar el factor Rh de las muestras mediante la electroforesis en gel de agarosa.
El locus Rh consiste en 2 genes estructurales: D y CcEe, los cuales codifican para la cadena del polipéptido
D y las proteínas C/c y E/e respectivamente.
Hemos realizado la amplificación de un fragmento del gen D (no el gen completo) en la práctica anterior. La
amplificación de este fragmento indicará que la persona es Rh+.
Debido a que los genes D y CcEe son altamente homólogos, es posible diseñar cebadores que se emparejan
en una región del gen D y también a una región del gen CcEe. Los individuos Rh+ producirán 2 fragmentos de
diferentes tamaños (1200 pb y 600 pb) y los individuos Rh- una única banda correspondiente al fragmento del gen
CcEe (1200 pb).
La presencia o ausencia del gen D en el genoma de un individuo, determina la presencia o no en la
membrana de los hematíes de una lipoproteína que constituye antígeno D. Los individuos son clasificados como Rh+
si contienen el antígeno D en la membrana de sus hematíes (esto es una visión bastante simple, en el módulo TAH
se verá con más profundidad).
El antígeno D es altamente inmunogénico e induce una respuesta inmune en muchas personas Rh- cuando
reciben una transfusión con sangre Rh+. Por esta razón, se realizan controles rutinarios en los donantes de sangre y
en los individuos que se van a someter a una transfusión, de forma que pacientes Rh- reciban exclusivamente
productos D negativo.
El sistema Rh está implicado en reacciones postransfusionales, enfermedad hemolítica del recién nacido,
anemias hemolíticas autoinmunes y otras reacciones hemolíticas.
MATERIALES
-Bata y guantes.
-Micropipetas automáticas y puntas apropiadas (mejor si son con filtro).
-Cubetas de electroforesis.
-Fuente de alimentación.
-Erlenmeyer o vaso para realizar el gel de agarosa.
-Cubeta y fuente de electroforesis.
-Balanza.
-Microondas o placa calefactora.
-Vaso de precipitado para residuos.
REACTIVOS:
-Agarosa 1%.
-Tampón de electroforesis.
-Agua ultrapura (realmente debería ser agua libre de nucleasas).
-Tampón de carga.
-Gelsafe.
MUESTRA:
-ADN amplificado de la práctica anterior.
-Controles positivo y negativo amplificados de la práctica anterior.
-Marcador de peso molecular.
PROCEDIMIENTO
PREPARACIÓN DEL TAMPÓN DE ELECTROFORESIS
-Preparar, si es necesario, TAE 1 X a partir de TAE 10 X (mediante dilución 1/10).
PREPARACION GEL DE AGAROSA
A) Preparación del molde
Coger el molde para hacer los geles y cerrar los extremos con los topes para que no se salga la agarosa. Después
colocar los peines necesarios para formar los pocillos.
B) Preparación del gel de agarosa
Dependiendo del tiempo que se dispone para la práctica el gel de agarosa puede prepararse otro día y conservarse
en nevera a 4ºC. Si se dispone del tiempo necesario se puede realizar el día de la práctica antes de realizar las
reacciones para dar tiempo a que solidifique y no se rompan los pocillos al extraer el peine.
1.b) Utilizar un vaso o erlenmeyer de 100 ml para preparar la solución del gel.
2.b) Pesar la agarosa:
-Para geles de 7 x 7 cm: Añadir 32 ml de Tampón de electroforesis 1X más 0,30 g de agarosa (1%), agitar la
mezcla para disolver los grumos de agarosa.
-Para geles de 7 x 10 cm: Añadir 42 ml de Tampón de electroforesis 1 X más 0,40 g de agarosa (1%), agitar
la mezcla para disolver los grumos de agarosa.
Asegurarse
que se ha añadido los 450 ml de agua destilada al Tampón de electroforesis 10 X
y se trabaja con el Tampón 1X.
3.b) Calentar la mezcla para disolver la agarosa, el método más rápido es la utilización de un microondas,
también puede utilizarse un placa calefactora, en ambos casos, para que la agarosa se disuelva se ha de llevar la
solución a ebullición. La solución final debe aparecer clara sin partículas aparentes.
4.b) Enfriar la solución de agarosa más o menos a 55ºC (para acelerar el proceso se puede enfriar colocando
el envase debajo de un grifo de agua y agitar). Si se produce mucha evaporación del líquido, añadir tampón de
electroforesis.
5.b) Tinción con GELSAFE. El GELSAFE se debe añadir a unos 55ºC ya que es termosensible antes de
añadir al molde. Es importante Agitar para que se distribuya por toda la solución. Una vez terminada la electroforesis
se comprobarán los resultados debajo de un transiluminador.
-Para geles de 7 x 7 cm: Añadir 3 μl de GELSAFE.
-Para geles de 7 x 10 cm: Añadir 4,5 μl de GELSAFE.
6.b) Añadir la solución de agarosa al molde. No se echa caliente porque la cubeta se puede agrietar.
7.b) Permitir que el gel solidifique. Para acelerar el proceso se puede poner el gel en una nevera. (Si la
electroforesis se realizará al día siguiente, conservar el gel a 4ºC).
CARGAR EL GEL Y ELECTROFORESIS
A) Preparación del gel para la electroforesis.
1) Después que el gel se ha solidificado con mucho cuidado sacar los topes.
2) Colocar el gel en la cámara de electroforesis correctamente orientada con los pocillos más cerca del polo
negativo (color negro).
3) Llenar la cámara de electroforesis con 300 ml de Tampón de electroforesis 1X. El tampón de
electroforesis se puede utilizar para 2 experimentos de electroforesis, una vez terminada la electroforesis guardar
este tampón utilizado en un envase diferente al suministrado para utilizarlo en una nueva electroforesis.
4) Asegurarse que el gel está completamente cubierto de tampón.
5) Sacar el peine o peines que ha formado los pocillos con mucho cuidado de no romper ningún pocillo.
6) Proceder a la carga del gel y llevar a cabo la electroforesis.
B) Muestras de electroforesis: Chequear el volumen de las muestras. Algunas veces pequeñas gotas de la muestra
puede estar en las paredes de los microtubos. Asegurarse de que toda la cantidad de muestra se encuentra uniforme
antes de cargar el gel. Centrifugar brevemente los microtubos de muestra, o golpear los microtubos contra una mesa
para obtener toda la muestra en la parte inferior del microtubo.
1) Cargar los microlitros indicados de cada muestra, utilizar para ello una micropipeta con su punta. Se aspira
y se expele varias veces con la micropipeta, para homogeneizar.
-En una de las calles o carriles se pondrá un marcador de peso molecular comercial*, con la finalidad de
comparar el tamaño del producto amplificado. Seguir las instrucciones del fabricante según se indica en la siguiente
tabla:
*GENERULER 1KB PLUS 50UG
-Elaborar un pequeño esquema de lo que hay en cada pocillo, si algún pocillo se ha estropeado se puede
dejar vacío.
2) Después que se han cargado las muestras, cuidadosamente colocar la cubierta del aparato de
electroforesis en los terminales de los electrodos.
3) Insertar la clavija del cable negro en la entrada de color negro de la fuente de corriente (entrada negativa).
Insertar la clavija del cable rojo en la entrada de color rojo de la fuente de corriente (entrada positiva).
4) Configurar la fuente de corriente a 75 voltios (30 minutos) o a 150 voltios (20
minutos). Vigilar el desarrollo del colorante del tampón de carga que indica cómo transcurre
la electroforesis. Atención: es necesario vigilar que el colorante del tampón de carga no sale
del gel, si esto sucede hay que parar la electroforesis.
5) Después de 10 minutos empezará a observarse la separación de las muestras.
6) Después de que la electroforesis ha terminado, apagar la fuente de corriente,
desconectar los cables y sacar la cubierta.
7) Colocar el gel en un transiluminador y hacer una foto para la interpretación de los resultados.
RESULTADOS e INTERPRETACIÓN
-Las moléculas cargadas viajaran a través de la electroforesis según su carga y tamaño.
-Como el ADN tiene una carga negativa a pH neutro migrará a través del gel hacia el
electrodo positivo durante la electroforesis.
-Comparar el tamaño de las bandas con el marcador.
-El control negativo no debe presentar ninguna banda.
-Las muestras de individuos Rh+ presentarán dos bandas correspondientes a fragmentos de
diferentes tamaños (1200 pb y 600 pb), ya que los cebadores también anillan en otra región
presente en todos los individuos (sirve de control de amplificación).
-Las muestras de individuos Rh- presentarán una sola banda que corresponde al fragmento
de 1200 pb.
-Anotar los resultados, identificando las muestras como Rh+ o Rh- y comparar con los
resultados del otro gel.
PREGUNTAS PARA RESPONDER TRAS LA PRÁCTICA
1. ¿En qué dirección migra el ADN en la cubeta de electroforesis?
2. ¿Qué función tiene el ADN marker?
3. ¿Cómo se visualizan las bandas de ADN tras la electroforesis?
4. ¿Qué función tiene el tampón de electroforesis?
5. Indica los cálculos realizados para realizar el gel de agarosa.
