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Guía de Uso del Microscopio en Biología

El microscopio guía de laboratorio

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CÓDIGO:

UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FDOC-090


VERSIÓN: 01
EMISIÓN:
02/03/2020
GUÍA DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO PÁGINA
1 DE 12

FACULTAD: Ciencias básicas


DEPARTAMENTO: Biología
PROGRAMA: Biología
NOMBRE DEL CURSO: Biología General
NOMBRE DE LA PRÁCTICA: El Microscopio

1. OBJETIVOS

• Reconocer las diferentes clases microscopios e identificar cada una de las partes
del microscopio óptico.
• Conocer los cuidados básicos que se debe tener en cuenta en el uso y manejo del
microscopio
• Describir y comprobar las propiedades básicas del microscopio.
• Comprender las ventajas y desventajas del uso de la microscopía electrónica en el
estudio de la biología.
• Analizar la importancia y beneficios que este instrumento aporta a los
investigadores en el avance de las ciencias biológicas.

2. INTRODUCCIÓN

El término célula se le atribuye a Robert Hooke (1665), quien utilizando un microscopio óptico
notó que el corcho estaba formado por muchas estructuras regulares en forma de
compartimientos. A partir de ese momento, la aplicación de la microscopía en el estudio de
materiales biológicos en los siguientes 200 años reveló que las plantas y animales estaban
formados por células. En los últimos años se han logrado grandes avances en la comprensión
de la estructura y funcionamiento celular, los cuales han sido posibles en gran parte gracias a
la utilización de técnicas e instrumentos que permiten cortar células y analizar las funciones de
los componentes individuales. Los avances de la microscopía han permitido examinar
detalladamente las estructuras celulares.

El microscopio hace posible la observación y examen de seres microscópicos que están fuera
del poder de resolución del ojo humano que es de 0,2 mm. El microscopio aumenta la imagen
hasta el nivel de la retina, para captar la información. Hay varios tipos de microscopios, los

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más usados y conocidos son los microscopios simples o lupas, los microscopios compuestos y
el microscopio binocular estereoscopio, luego podemos encontrar otros más especializados
como el microscopio electrónico, que usa como fuente de funcionamiento un chorro de
electrones.

El microscopio es un instrumento óptico que amplifica considerablemente la imagen de objetos


pequeños y microorganismos, y permite observar sus detalles estructurales que son
imperceptibles a simple vista. Su desarrollo revela claramente el carácter social del
conocimiento por la acumulación gradual de experiencias a través de generaciones, y la
forma cómo los instrumentos tecnológicos se perfeccionan cada vez más; razón por la cual,
no se puede señalar un inventor único del microscopio.

Séneca (60 años AC), hablaba que un glóbulo de cristal de agua “Ayuda en la visión de aquellas
cosas difíciles que frecuentemente escapan al YO”. Era necesario crear una herramienta que
permitiera al hombre su mirada, no sólo para satisfacer su curiosidad, sino para perfeccionar
el sentido de la vista mediante métodos físico-ópticos y electromagnéticos desarrollados por la
sociedad en el tiempo. Los primeros microscopios fueron lentes biconvexas usadas en la antigua
Roma y China, instrumentos que perfeccionados a través de la historia.

La primera referencia al precursor del microscopio compuesto data de 1542, con los telescopios
rudimentarios de Nicolás Copérnico, que le permitieron su teoría heliocéntrica. Los progresos
en microscopia óptica durante los siglos XVI, permitieron el estudio serio de objetos
microscópicos por parte de Anton Van Leeuwenhook, introduciéndole al desconocido mundo
de la microbiología, ampliándose en forma paralela los conocimientos de la Biología y de la
estructura celular.

Entre los informes de Leeuwenhook se encuentran descripciones de protozoarios, bacterias,


espermatozoides, glóbulos rojos y núcleo de glóbulos rojos de peces, además de algunos
tejidos musculares. Robert Hooke, utilizando un microscopio similar al de Leeuwenhook estudió
algunos tejidos vegetales y fue el primero en emplear el término célula para describir los poros
o espacios entre las paredes muertas de células del corcho.

En el siglo XIX muchos de investigadores emplearon intensamente el microscopio para el


estudio de la célula, y encontraron poco a poco y cada uno por su lado los diferentes elementos
subcelulares y cuya recopilación ha permitido hacer una descripción completa del

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modelo teórico celular. A principios del siglo XX, empieza a superarse la etapa descriptiva de
la célula y se entra en el estudio de las funciones y detalles; que fueron más evidentes al
perfeccionarse el diseño y construcción de nuevos microscopios, apoyados en el desarrollo de
otras ciencias, fundamentalmente la electrónica, química, bioquímica y física.

Bajo el mismo principio del microscopio óptico, se desarrolla la microscopía con la creación
del microscopio electrónico en 1931, basado en el descubrimiento del electrón de Thompson
(1927) y en los trabajos de Broglie (1924), relacionando el movimiento de electrones con la
construcción de las lentes magnéticas de Busch y Gabor (1925). Por lo tanto, el microscopio
electrónico es producto de la acumulación de experiencias y conocimientos a lo largo de más
de 27 siglos de historia.

CLASES DE MICROSCOPIOS.

La microscopía se inició con los trabajos de Leeuwenhoek (1632-1723) que utilizó un


microscopio simple, mientras que otros investigadores como Hooke emplearon microscopios
compuestos primitivos. Luego que Lister introdujo los microscopios acromáticos (1827), la
microscopía de luz ha desarrollado niveles extraordinariamente altos.

El microscopio está constituido por un sistema combinado de lentes ensambladas que


proporcionan pequeños y grandes aumentos. La lupa ha sido la lente más simple que
proporciona imágenes reales, derechas y más grandes que el objeto, siendo ésta una lente
de corta distancia focal.

Con un microscopio compuesto se obtienen imágenes reales invertidas y más grandes que el
objeto. El microscopio estereoscopio es usado para observaciones tridimensionales, y entrega
imágenes virtuales, derechas y más grandes que el objeto. Los microscopios modernos, han
sufrido modificaciones específicas que permiten observaciones detalladas de objetos
microscópicos, existiendo hoy una gran variedad de clases de microscopios ópticos y
electrónicos.

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MICROSCOPÍA ÓPTICA

4.1.1. Microscopio óptico estándar (de campo claro)

El conocimiento actual sobre la estructura celular se obtuvo con ayuda del microscopioóptico.
Antón Van Leeuwenhoek está unido a los inicios de la microscopía, pues él fabricó los mejores
lentes de su época. El estudio de microorganismos se puede hacer con el microscopio óptico
o el microscopio electrónico. En la mayor parte de los trabajos investigativos de rutina se usa
el microscopio óptico.

La microscopía directa es uno de los métodos más utilizados actualmente para la identificación
de los diferentes tipos de microorganismos. El trabajo de laboratorio en biología incluye como
parte fundamental el estudio microscópico de especímenes y materiales frescos sin teñir y
preparaciones teñidas. Para este proceso es indispensable tener un buen conocimiento en el
manejo del microscopio; que cuenta con sistemas de soporte, aumento, iluminación y ajuste.

El microscopio de campo claro está integrado por dos series de lentes (ocular y objetivo) que
se utilizan para magnificar las estructuras que se examinan y permitir así observar sus detalles.
Estos funcionan conjuntamente para producir la imagen aumentada. Además de la
magnificación, es la resolución la que permite observar dos puntos adyacentes como unidades
distintas, por lo tanto, el grado de resolución es lo que limita lo que puede ser observado con
el microscopio.

El sistema de aumento de un microscopio óptico está compuesto por: (1) El ocular, ubicado
en el extremo superior del tubo del ocular, cuyo poder de aumento se encuentra marcado en
la parte superior del ocular (5x, 10x); y (2) los objetivos, acoplados al revolver, y pueden ser
cambiados de posición con sólo rotarlos. El poder de aumento de cada objetivo se encuentra
en la manga del lente, así: Objetivo 10x, 40x, 100x. Para calcular el aumento total de la imagen
observada, se multiplica el poder de aumento del objetivo por el número de aumentos del
ocular.

Existen dos clases de objetivos: Los objetivos secos, de menor aumento, se utilizan para
observaciones corrientes. Entre el objeto que se examina y la lente frontal hay una capa de
aire; y los objetivos de inmersión, que se reconocen fácilmente porque son más largos y tienen
una lente frontal pequeña y más curvada. Llevan impresa las letras OIL u OEL INM, y

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para su utilización es necesario el uso de aceite de inmersión que llena el espacio entre la
preparación y el objetivo.

Los microscopios ópticos tienen un poder de resolución de 0,2 (200 nanómetros), de modo
que mejora unas 500 veces el poder de resolución del ojo humano (100). El microscopio
electrónico tiene un poder de resolución de 0.001. Este poder de resolución está en función
de la longitud de onda de la luz y de la propiedad del lente que integra el objetivodenominada
apertura numérica (AN) que es una medida de la capacidad de captación de la luz por la lente.

2. Microscopio invertido
El microscopio invertido permite observar organismos o tejidos en cultivo sin una preparación
previa, favoreciendo el monitoreo del estado de crecimiento, comportamiento y demás
parámetros involucrados en el desarrollo del cultivo. Con el microscopio invertido se pueden
observar cultivos enteros o grandes muestras bajo estados naturales y con menores
condiciones de estrés. La observación se realiza a través de la base de recipientes con espesor
y características ópticas variables, tales como placas de Terasaki, frascos Corning, frascos Roux,
cajas de Petri. Una desventaja del microscopio invertido es su limitada magnificación, debido a
que los objetivos más potentes son de 40X y 60X.

4.1.3. Microscopio de barrido confocal


microscopio de barrido confocal, que combina el microscopio de fluorescencia con imagen
electrónica y puntos de luz suministrados por láser dirigido al espécimen en particular, con el
fin de obtener imágenes tridimensionales. Gracias a que utiliza los métodos electrónicos permite
enfocar un plano escogido de una muestra fina eliminando la luz que proviene de las zonas
fuera de foco superior o inferior a este plano, obteniéndose imágenes detalladas de secciones
del interior de una estructura intacta.

1.4. Microscopio de inmunofluorescencia


Es una técnica inmunohistoquímica, que consiste en conjugar colorantes fluorescentes con
anticuerpos o antígenos. Este preparado se expone después a los anticuerpos o antígenos
específicos en cortes de tejidos, frotis de microorganismos, células o cultivo de tejidos en capa
única. Cuando la reacción es positiva y se expone a la luz ultravioleta, se producirá fluorescencia
observable bajo el microscopio de inmunofluorescencia. Esta técnica tiene múltiples
aplicaciones en diagnóstico e investigación. Se ha utilizado en estudios

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bacteriológicos, virales, parasitológicos; así como en el estudio de la distribución intracelular de


las moléculas.

1.5. Microscopio de contraste de fases


La microscopia de contraste de fases, al igual que del microscopio de interferencia nos da la
posibilidad de observar con nitidez células vivas y sin ninguna preparación. Cuando la luz
pasa a través de una célula viva, la fase de la onda luminosa varía con relación al índice de
refracción de la célula. El microscopio de contraste de fases y de fases interferencial,aprovecha
los efectos de interferencia que se producen cuando se combinan estos dos grupos de ondas,
creando una imagen de la estructura celular. Ambos tipos de microscopios ópticos se utilizan
habitualmente para visualizar células vivas.

[Link] de interferencia de Nomarski


La microscopia de interferencia o técnica DIC (Diffential-Interference Contrast) Nomarski,
permite la visualización de especímenes mucho más densos gracias a que la imagen proyectada
es tridimensional. Una de las grandes ventajas del microscopio de contraste de fases, de
interferencia y de campo oscuro, estriba en que permiten observar las células en acción, y se
pueden estudiar los movimientos implicados en procesos como la mitosis o la migración celular.

[Link] de campo oscuro


El microscopio de campo oscuro está constituido por un microscopio óptico al cual se le
acondiciona un condensador especial, que tiene como fin producir una difracción de los rayos
luminosos enviándolos lateralmente sobre el objeto en forma de un cono luminoso, y de esta
forma tampoco penetran directamente al objetivo. Esta técnica permite ver partículas dispersas
en un medio homogéneo y hace posible la observación del movimiento Browniano de las
partículas. Se puede utilizar para la observación de preparaciones sin [Link] los
bordes destacados de las muestras. Técnica valiosa para observar microorganismos de tipo
Treponema pallidum, espiroquetas con diámetros superior a 0.2 µm.

2. MICROSCOPIA ELECTRÓNICA

4.2.1. Microscopio electrónico de transmisión


Con el desarrollo del microscopio electrónico hacia la década de 1930 por Ersr Ruska y Max
Knoll, se llegó al territorio celular desconocido hasta el nivel del manómetro, pero el escaso
poder de penetración del haz de electrones hizo necesario el desarrollo de técnicas que

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dejaran las muestras a examinar de extraordinaria finura (una millonésima de centímetro) y


su examen debe realizarse bajo intenso vacío; además de la construcción de instrumentos
necesarios para reducir las muestras a cortes ultra finos.

2.2. Microscopio electrónico de barrido MEB


El microscopio electrónico de barrido (MEB) se basa fundamentalmente en un campo magnético
que permite enfocar los rayos catódicos (electrones) y obtener una imagentridimensional para
el examen de la superficie de las estructuras celulares, permitiendo la observación y la
caracterización de materiales orgánicos e inorgánicos. Proporciona aumentos de 200.000
diámetros.

3. PROCEDIMIENTO

3.1. Conociendo el microscopio óptico

Tome un microscopio óptico proporcionado por el laboratorio de biología, y desarrolle las


siguientes actividades:
1. Identifique y ubique las partes del microscopio óptico (mecánicas, ópticas y fuentes de
iluminación). Elabore un diagrama del microscopio indicando cada una de sus partes.

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2. Describa cada una de las partes del microscopio y su funcionamiento.

3. Ubique el ocular e indique su poder de aumento.

4. Localice los objetivos, describa su ubicación e indique su capacidad de aumento de cada


uno de ellos. Explique la forma cómo calcular el aumento de la imagen del objeto
observado.

3.2. Uso y manejo del microscopio.

1. Prepare el microscopio adecuadamente, ilumine el campo visual y coloque el objetivo de


menor aumento. Verifique el funcionamiento de los tornillos macrométrico y
micrométrico.

2. Prepare muestras de diferentes materiales, móntelas en el microscopio y observe. Puede


utilizar los siguientes materiales: fibras de lana, algodón, granos de polen, epidermis de
cebolla, polvillo de alas de mariposas, células de corcho o cualquier otro material que
usted considere adecuado.

3. Para realizar el enfoque, acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación,


empleando el tornillo macrométrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a
través del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparación
pudiéndose dañar alguno de ellos o ambos. Luego, mirando ahora sí, a través de los
oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparación con el tornillo
macrométrico y, cuando se observe nítida la muestra, girar el micrométrico hasta
obtener un enfoque fino.

4. Observe al microscopio las muestras preparadas con menor y mayor aumento.


Esquematice o dibuje a lápiz sus observaciones. Anote sus conclusiones.

Para el empleo del objetivo de inmersión (100x), use preparaciones fijas previamente
coloreadas. Baje totalmente la platina del microscopio y siga los siguientes pasos:

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a. Subir totalmente el condensador para ver claramente el círculo de luz que nos indica
la zona que se va a visualizar y donde habrá que colocar la gota de aceite.
b. Girar el revólver hacia el objetivo de inmersión y colocar una gota mínima de aceite
de inmersión sobre la muestra en la lámina portaobjetos. Luego, terminar de girar
suavemente el revólver hasta la posición del objetivo de inmersión
c. Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la lente toca
la gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara
a la lente.
d. Ahora, enfocar cuidadosamente con el tornillo micrométrico. La distancia de trabajo
entre el objetivo de inmersión y la preparación es mínima, aun menor que con el
objetivo de 40x, por lo que el riesgo de accidente es grande.
e. Una vez se haya puesto aceite de inmersión sobre la preparación, ya no se puede
volver a usar el objetivo 40x sobre esa zona, pues se mancharía de aceite. Por tanto,
si desea enfocar otro campo, hay que bajar la platina y repetir la operación.
f. Una vez finalizada la observación de la preparación se baja la platina y se coloca el
objetivo de menor aumento girando el revólver. En este momento ya se puede retirar
la preparación de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo deinmersión en
posición de observación.
g. Debe limpiar el objetivo de inmersión con mucho cuidado, empleando un papel
especial para óptica. Comprobar también que el objetivo 40x está perfectamente
limpio.

3.3. Estudio de las propiedades del microscopio

1. Recorte una letra minúscula de una revista o periódico. Prepare una muestra con ella
para observación. Use la letra más pequeña que pueda encontrar, y debe ser diferente
de o y x.

2. Monte la preparación al microscopio, enfoque y observe con menor aumento (10x).


Realice con detalle el dibujo de la imagen observada. Compare la imagen del
microscopio con la observada a simple vista. Tenga en cuenta la posición de la letra,
indíquela.

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3. Enfoque y observe con el objetivo de mayor aumento (40x). Dibuje nuevamente la


imagen observada. Compare los dibujos de las imágenes observadas a simple vista,
menor aumento y mayor aumento.

4. Enfoque la letra con el objetivo de menor aumento. Ahora desplace el carro del
microscopio en diferentes direcciones (derecha, izquierda, arriba y abajo). Anote sus
observaciones. Explique qué ocurre en cada desplazamiento. Consigne susconclusiones.

RECOMENDACIONES PARA EL MANEJO ADECUADO DEL MICROSCOPIO

Al finalizar el trabajo de laboratorio, es necesario dejar puesto el objetivo de menor aumento


en posición de observación, asegúrese de que la parte mecánica de la platina no sobresale
del borde de la misma y no olvide dejarlo cubierto con su funda, esto evitará que le caiga polvo
que puede dañar las lentes y afectar la vida útil del microscopio.

Cuando no esté utilizando el microscopio, se debe mantener cubierto con su funda para evitar
que se ensucien las lentes. Si no se va a usar de forma prolongada, se debe guardar en su caja
dentro de un armario para protegerlo del polvo.
Nunca debe tocar las lentes con las manos. Si se ensucian, limpiarlas muy suavemente con
un papel de filtro o, con un papel de óptica.
Nunca deje el portaobjetos puesto sobre la platina si no se está utilizando el microscopio
Después de utilizar el objetivo de inmersión, debe limpiar el aceite que queda en el objetivo
con pañuelos especiales para óptica o papel de filtro. En cualquier caso se pasará el papel por
la lente en un solo sentido y con suavidad. Si el aceite se secó y se pegó en el objetivo, es
necesario limpiarlo con una mezcla de alcohol-acetona (7:3) o xilol. No abusar de este tipo de
limpieza, porque si se aplican estos disolventes en exceso se pueden dañar las lentes y su
sujeción.
El cambio de objetivo se hace girando el revólver y dirigiendo siempre la mirada a la preparación
para prevenir el roce de la lente con la muestra. Nunca cambiar de objetivo agarrándolo por el
tubo del mismo, ni hacerlo mientras se está observando a través del ocular.
Mantener seca y limpia la platina del microscopio. Si se derrama sobre ella algún líquido, secarlo
con un paño. Si se mancha de aceite, limpiarla con un paño humedecido con xilol.

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4. MATERIALES, EQUIPOS, REACTIVOS.

• Fibras de lana y algodón* • Microscopio compuesto


• Flores diferentes con polen* • Portaobjetos*
• Ala de mariposa* • Cubreobjetos*
• Hojas de lirio acuático* • Goteros
• Corcho* • Cuchillas*
• Cebolla pequeña* • Aceite de inmersión
• Papel periódico*
Nota: El material marcado con asterisco debe llevarlo el estudiante.

5. EQUIPOS DE PROTECCIÓN PERSONAL Y/O COLECTIVA.

• Bata
• Polainas

6. MANEJO DE RESIDUOS PELIGROSOS.

En este laboratorio no se genera ningún tipo de residuo peligroso

7. CUESTIONARIO O ACTIVIDADES COMPLEMENTARIAS.

1. Indague sobre los fundamentos de los diferentes tipos de microscopios ópticos y


electrónicos.

2. ¿Por qué el microscopio electrónico tiene mayor poder de resolución que el microscopio
óptico?, ¿Qué procesos fundamentales permiten la alta resolución de un microscopio de
barrido confocal?

3. ¿En qué casos se utiliza el microscopio de inmunoflorescencia?, ¿Qué ventajas se tiene


el uso del microscopio de inmunofluorescencia?

4. Explique la trayectoria del rayo de luz a través del microscopio y ¿por qué se invierte la
imagen que observamos?

5. ¿Por qué se usa aceite de inmersión para utilizar el objetivo de 100x?


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6. Explique las principales propiedades básicas del microscopio de luz: poder de aumento,
poder de penetración o profundidad de foco, poder de definición, poder de resolución,
campo visual del microscopio.

7. ¿Cómo se determina el aumento total del microscopio óptico compuesto?

8. Establezca la diferencia existente entre los objetivos secos y los objetivos de inmersión.
¿Qué material se usa para la inmersión y cuál es su importancia? Qué importancia tiene
el índice de refracción del aceite de inmersión?

8. BIBLIOGRAFÍA

• [Link] (historia del microscopio).


[Link] (microscopia)
[Link] (curso biología celular).
[Link] (manual biología celular).
• [Link] (cortes histológicos).
• [Link]

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