UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA

LA MOLINA

FACULTAD DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

“PRODUCCIÓN DE PROTEÍNA CELULAR”

CURSO: Fermentaciones Industriales

ESTUDIANTE: Espinoza Alvarado Valeria del Milagro

CÓDIGO: 20131302

LIMA – PERÚ

2023
 I. INTRODUCCIÓN

Actualmente la Industria Alimentaria promueve el desarrollo e implementación de

tecnologías como la propagación industrial de microorganismos, que permitan obtener
productos para emplearlos en la preparación de alimentos con un alto valor nutricional, con
costos no tan elevados y así poder enfrentar la carencia alimenticia tanto en cantidad como
en calidad. Por ello es necesario la búsqueda de nuevos sustratos para la propagación de
microorganismos; es así como nace el término “Proteína Unicelular”, con el cual se
identifica a los alimentos derivados de microorganismos utilizados con fines alimenticios
por su alto contenido de proteínas (Castellano & Chicas, 2003).

Estos se pueden obtener en forma de productos finales o intermedios de la actividad

microbiana que son excretados al medio o extraídos industrialmente después de la célula.
Siendo la biomasa microbiana una fuente alimenticia de elevado contenido proteico
(Villalobos, 2004).

La producción de biomasa se puede dar por distintos microorganismos como las levaduras,
hongos y bacterias. Los primeros microorganismos utilizados como fuente de proteínas
fueron las levaduras, principalmente la Saccharomyces cerevisiae, que hoy en día es la
principal fuente de proteína unicelular (SCP) más utilizado a una escala industrual (Suárez-
Machín et al., 2016). El cual el medio a ser utilizado debe contar ciertas condiciones para
su crecimiento, principalmente la temperatura y el pH, causando efecto inmediato en la
producción de biomasa (Mas et al., 2017).

Dentro de las variables más importantes a controlar en la producción de biomasa está su

determinación o mejor dicho su contenido producido por el bioproceso, ya que esto nos
efectuará la eficiencia. Esta variable es clave para la determinación del consumo de
nutrientes dentro del proceso (Arnáiz et al., 2000).

La presente práctica tiene como objetivo evaluar el efecto de la temperatura sobre la

cantidad de biomasa formada en un sistema de fermentación batch.
 II. METODOLOGÍA

2.1. LUGAR DE EJECUCIÓN

Laboratorio de Biotecnología de la Facultad de Industrias Alimentarias de la Universidad
Nacional Agraria La Molina.

2.2. MATERIALES

2.2.1. Materias primas e insumos

 Microorganismo: levadura Saccharomyces cerevisiae
 Medio de cultivo selectivo para levadura. La composición del caldo de cultivo
selectivo para crecimiento de Saccharomyces cerevisiae (Regular el pH a 4.5), se
detalla a continuación:
- Agua destilada
- Glucosa 10 g/L
- Sulfato de amonio (NH4)2SO4 3.21 g/L
- Fosfato de potasio monobásico KH2PO4 0.59 g/L
- Sulfato de magnesio heptahidratado MgSO4.7H2O 0.46 g/L
- Extracto de levadura 5 g/L
- Ácido cítrico. H2O 7.81 g/L
2.2.2. Equipos e instrumentos
 Agitador Vortex
 Autoclave (SM, 12AA10)
 Balanza Analítica (AND, GH-202)
 Balanza de precisión (OHAUS SCOUT II)
 Campana de Flujo Laminar
 Centrífuga (Eppendorf, 5430R)
 Estufa (LMIM, LP303)
 Incubadora a 27°C
 Microfermentador de 500 ml
  Potenciómetro (HANNA, HI2211)
 Refractómetro 0 a 30° Brix (VWR®, BX Series)
2.2.3. Materiales
 Agitador magnético con calentador
 Beacker 1000 y 500 mL
 Magneto
 Matraz de 1000 y 50 ml
 Pipetas de 1, 2 y 10 mL
 Placas Petri
 Probeta 50 ml y 100 ml
 Tubos eppendorf de 2 ml
2.2.4. Reactivos
 Ácido clorhídrico concentrado
 Hidróxido de sodio 3 N
2.3 MÉTODOS

2.3.1. Métodos de análisis

a. Determinación de sólidos solubles: Sobre el prisma del refractómetro se vertió
gotas del medio (a temperatura ambiente), luego se cerró y se realizó la medición
de los sólidos solubles, antes y después del proceso de fermentación, según el
método 932.12 de la AOAC (2002).
b. Determinación de pH: Se midió el pH del medio de cultivo antes de la
inoculación, durante y al término del proceso, utilizando un potenciómetro. Según
el método oficial 981.12 (AOAC, 2002).
c. Determinación de biomasa: Para ello se procedió a tomar un volumen de muestra
de 2 ml cada cierto tiempo, en un tubo previamente pesado. Los 2 ml pasaron por
centrifugación a 4000 RPM por 10 min, luego se eliminó el sobrenadante y el
precipitado se llevó a una estufa a 104°C por 24 h. Posteriormente, se determinará
el peso seco de la biomasa (Rivas, 1998).

2.3.2. Metodología experimental

a) Producción de proteína unicelular:

Para la producción de biomasa de levadura se realizaron las operaciones unitarias
presentadas en la Figura 1.
 Insumos
Sacarosa 10g/L
Sulfato de amonio 3.21g/L
Fosfato de potasio monobásico 0.59g/L
Sulfato de magnesio heptahidratado 0.46 g/L PESADO
Extracto de levadura 5 g/L
Ácido cítrico. H2O 7.81 g/L

Agua 1L MEZCLADO

HCl CORRECCIÓN DE pH pH = 4.5

T° = 121 °C
ESTERILIZADO
t = 15 min

1 g levadura PREPARACIÓN DEL

50 ml medio INÓCULO
ENFRIADO T° = 21 °C

T° = 28 °C
INCUBADO
t = 24 h T° = 25 y 37 °C
t = 24 h
Inóculo FERMENTACIÓN pH = 4.5
Oxígeno diluido presente
Agitación = 120 RPM

4000 RPM
SEPARACIÓN t = 10 min
Medio
gastado

Proteína unicelular

Figura 1. Flujograma de procesos para la producción de proteína unicelular

A continuación, se detallan las operaciones unitarias:

a. Pesado
Se realizó el pesado de los insumos destinados para la preparación del medio de
cultivo: glucosa, fosfato de amonio, fosfato de potasio monobásico, fosfato de
magnesio heptahidratado, extracto de levadura, ácido cítrico.
b. Mezclado
Se añadió 1 L de agua destilada y junto lo que se pesó, se colocaron en un vaso
precipitado donde se realizó el mezclado. Se usó un agitador magnético para una
correcta disolución.
c. Corrección de pH
La disolución se llevó a un pH de 4.5, añadiéndole hidróxido de sodio.
d. Esterilizado
El medio de cultivo fue autoclavado a una temperatura de 121 °C por 25 minutos.
e. Enfriado
Se procedió a realizar el enfriado, hasta que baje la temperatura hasta 20 °C
aproximadamente.
f. Fermentación
Para esta operación se requirió la preparación del inóculo, que se realizó 24 horas
antes de iniciar el proceso de producción, para el cual se tomó 50 ml del medio de
cultivo. Una vez esterilizado y enfriado a temperatura ambiente, bajo condiciones
asépticas, se agregó al 1 gramo de levadura comercial. Se llevó a una estufa,
incubando a una temperatura de 28°C por 24 horas. Se realizó el acondicionamiento
del inóculo a pH de 4.5 y con unas jeringas estériles incorporadas se aplicó al
fermentador. El proceso de producción de biomasa se realizará en un
microfermentador, para lo cual se programó en el equipo temperaturas de 25 y 37
°C. Con presencia de oxígeno diluido y agitación constante a una velocidad de 200
RPM.
g. Separación
Se extrajeron 2 ml de la solución fermentada y se colocó en un tubo de ensayo para
llevar a la centrífuga a 4000 RPM por 10 minutos y eliminar el sobrenadante
obtenido. Así separar la proteína unicelular del sobrenadante.
2.3.3. Diseño Experimental

El diseño experimental empleado se muestra en la Figura 2.

ETAPA I ETAPA II
ETAPAS Producto
Preparación Fermentación
T °C
25 B1
Tratamientos
Medio de cultivo
37 B2
V. Respuesta:
pH Cantidad de biomasa
Análisis
°Brix °Brix
pH

Figura 2. Diseño experimental de la fermentación para la producción de biomasa

El diseño experimental presentado tiene como variable independiente la temperatura del
medio (25, 37°C) y como variables dependientes la cantidad de biomasa producida,°Brix y
pH.

2.3.4. Análisis estadístico

En el caso de contar con repeticiones de unidades experimentales, podría utilizarse un
análisis de varianza (ANOVA) con un factor, diseño completamente al azar (DCA), siendo
el factor la temperatura del medio, con tres niveles (25 y 37°C) y las variables respuestas
serían la cantidad de biomasa producida, °Brix y pH.
 III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En la Tabla 1, se presentan los resultados del consumo de grados Brix durante la

fermentación a las temperaturas mencionadas anteriormente (25 y 37°C).

Tabla 1. Consumo de Grados Brix del proceso de fermentación de cada temperatura

Fermentador 1 Fermentador 2
Temperatura (°C) 25 37
Consumo °Brix 1.4 1.4
Biomasa (g) 0.007 0.024

La levadura Saccharomyces cerevisiae tiene un rango de temperatura óptimo para su

crecimiento el cual según Uribe (2007), es de 25 a 37°C. Sin embargo, en la Tabla 1 se
observa que a una temperatura de 25°C se obtuvo menor cantidad de biomasa (0.007 g)
con respecto al otro tratamiento (0.024 g). Además, las temperaturas de 25 y 37°C
presentan igual consumo de grados Brix (1.4° Brix).
Según Torres (2013) los azúcares reductores son consumidos por la levadura
Saccharomyces
cerevisiae en la fermentación, es por ello que, a medida que pasa el tiempo, la
concentración
de sólidos solubles disminuye. Además, propone que el tiempo óptimo para la
fermentación
es de 24 horas, para así promover todo el consumo de estos azúcares y aumentar la
producción de proteína SPC. Por otro lado, menciona que a la existencia de azúcares
dentro
de la composición de los sustratos que no pueden ser metabolizados por la levadura son
provenientes de la hidrolisis de la celulosa y hemicelulosa.
Como se muestra en la Tabla 1, dicha levadura consumió la misma cantidad de °Brix, esto
hace inferir que consume la misma cantidad de glucosa a la temperatura de 25°C y 37°C o
que finalmente el medio presenta la misma cantidad de sólidos solubles (Poma, 2016).
Estos datos no coinciden con lo reportado por Suárez et al. (2016), que indican que a
mayor consumo de grados brix mayor debió ser la biomasa producida, lo cual debió ser
igual producción en ambos tratamientos de la presente práctica, además en la investigación
mencionada obtienen que la mayor cantidad de biomasa producida se da a los 25°C.

Según Muñoz y Catrilaf (2013), a mayor temperatura habrá menor cantidad de biomasa
producida, debido al descenso en el contenido de proteínas RNA; DNA y aminoácidos
libres e induce a la rigidez de la membrana celular, por otro lado, temperaturas muy bajas
provocan un estado de latencia en la célula, paralizando su desarrollo. Por el contrario, en
este caso a pesar de encontrarse dentro de la temperatura óptima, se produjo menor
cantidad a 25°C.
Por otro lado, Gómez et al. (2015), define la temperatura como una variable que limita el
tiempo de crecimiento microbiano, pues esta causa un efecto sobre las células, altas
temperaturas desintegran la membrana y la integridad de su pared, además la composición
lipídica de la membrana se regula en respuesta a la temperatura a la que es expuesta, cuyo
fin es obtener una fluidez óptima en el interior y exterior de la célula.

Según Pérez y Chaires (2011), la producción de biomasa puede verse afectado por
condiciones ambientales como el pH, temperatura, aireación, humedad, factores
metabólicos y fisiológicos propios de los microorganismos, cuando carecen de alguna
fuente nutricional o por el contrario presentan exceso de alguna de estas.
Otro factor importante es el control adecuado de los parámetros tales como porcentaje de
oxígeno disuelto, agitación y temperatura adecuada para el metabolismo del
microorganismo (Pilaguano & Katherine, 2020).

En la Figura 3 se aprecia los cambios de pH que se registraron en la fermentación durante

24 horas a las temperaturas de 25 y 37°C.
 Figura 3. Evolución del pH durante el proceso de fermentación

En la Figura 3 se puede observar que a una temperatura de 37°C se dió un drástico

descenso en pH, comparado a la temperatura de 25°C, sin embargo, en general tuvieron un
patrón similar de curva en la variación de pH durante todo el proceso de fermentación
Además, aproximadamente en las primeras cuatro horas es donde se da el mayor descenso
en las dos diferentes temperaturas, luego de ello se mantiene más estable la variación de
pH. También se tiene en cuenta los pH con los que comenzaron los procesos a diferentes
temperaturas, estos están dentro del rango óptimo para levadura Saccharomyces cerevisiae,
quien realiza un trabajo óptimo en medio relativamente ácidos en un rango de pH de 4-5
(Suárez et al., 2016).

En adición, Durango (2007), describe al pH como un factor fundamental en la producción

de biomasa, ya que durante el crecimiento debido a las reacciones metabólicas se
consumen los sustratos y se producen sustancias que por lo regular acidifican el medio,
incluso en ocasiones se llega a una inhibición por pH. Varilla (2018), reafirma lo
mencionado anteriormente, aludiendo que, durante la fermentación de levaduras, por las
actividades metabólicas se da un intercambio de protones en el medio.
Por último, Vicente et al., (1997) mencionan que, en fermentaciones de levaduras, la
actividad metabólica es la causa principal del intercambio de protones en el medio y la
cantidad de ácido o base consumidos se debe a la asimilación del nitrógeno bajo
condiciones respiratorias, mientras que la producción de etanol no contribuye
significativamente a la producción de protones.
 IV. CONCLUSIONES

4.1. Se obtuvo una mayor producción de biomasa en un sistema de fermentación batch,

a una temperatura de 37°C con 0.024 g en comparación de una temperatura de 25°C
con 0.007 g en un periodo de tiempo de 24 horas.
 V. BIBLIOGRAFÍA

AOAC (Association of Official Analytical Chemistry) (2002). AOAS Official Method

932.12. Solids (Soluble) in Fruits and Fruit Products.

AOAC (Association of Official Analytical Chemistry) (2002). AOAS Official Method

981.12 pH of Acidified Foods.

Arnáiz, C., Isac, L., & Lebrato, J. (2000). Determinación de la biomasa en procesos
biológicos. Métodos directos e indirectos. Tecnología del agua, 20 (205), 45-52.

Castellanos, V. & Chicas, J. (2003). Producción de proteína unicelular, utilizando agua de

cocimiento de maíz como medio de cultivo y estudio cinético del crecimiento de
“Candida utillis”. [Tesis de Licenciatura]. Universidad El Salvador.

Durango, L. (2007). Evaluación y escalamiento de la producción de levaduras nativas tipo

Saccharomyces spp. a nivel de laboratorio. UNIVERSIDAD EAFIT.

Ezequiel, S. (2020). Producción de biomasa de levaduras patagónicas seleccionadas para

su uso en enología. Universidad Nacional del Sur. Bahía Blanca, Argentina.

Ferreyra, M., Schvab, M., Gerard, L. & Cristina Verónica Davies, C. (2014). Nutritional
requirements of a Saccharomyces cerevisiae starter culture used in the elaboration
of wine from orange. Revista de la Sociedad Venezolana de Microbiología, (34), 38
-42.

Gómez, A., Basilio,J., Castañeda, L., Valverde,M., Wong, W., Santa,M & Linares, G.
(2015). Evaluación de harina de soya como fuente primaria en la producción de
biomasa de Saccharomyces cerevisiae. Agroindustrial Science. 5(1).

Mas, S., Ribeau, G., & Cabrera, C. (2017). Incremento de la biomasa de la levadura
Saccharomyces cerevisiae con aplicación de un campo magnético de intensidad
constante. ICIDCA. Sobre los Derivados de la Caña de Azúcar, 51(1), 43-46.
Muñoz, M. & Catrilaf G. (2013). Estimación de parámetros cinéticos de Saccharomyces
cerevisiae en sistema de fermentación batch bajo distintas condiciones de
crecimiento. Universidad Tecnológica de [Link].

Pérez, J. y Chaires, L. (2011). Evaluación del Efecto de Diferentes Diluciones de Agua de

Coco Suplementada con Biotina, para la Producción de Levadura (Saccharomyces
cerevisiae) a nivel Matraz y en Biorreactor de Tanque Agitado.

Pilaguano, D., & Katherine, J. (2020). Estudio cinético de la Saccharomyces cerevisiae en

medio aerobio en un biorreactor batch (Bachelor's thesis, Quito: UCE).

Poma, P. (2016). Efecto de tres niveles de concentración de levadura Saccharomyces

cerevisiae cepa CH 158 SIHA en la fermentación del zumo de aguaymanto
(Physalis peruviana L.).

Rivas Morales, C. (1998). Diseño de un medio de cultivo para la producción de biomasa de

Nocardia brasiliensis HUJEG-1 a escala piloto para la obtención de proteasas
caseinolíticas.

Suárez, C., Garrido, A., & Guevara, C. (2016). Levadura Saccharomyces cerevisiae y la
producción de alcohol. Revisión bibliográfica. ICIDCA. Sobre los Derivados de la
Caña de Azúcar, 50(1),20-28

Torres, G. (2013). Cuantificación del contenido de proteína celular (SCP) en la biomasa de

la levadura Saccharomyces cerevisiae producida a partir de residuos de cáscaras de
naranja (Citrus sinensis L var valencia) y papa (Solanum tuberosum) variedad
diacol capiro (r-12) para uso en la alimentación animal. [Tesis de pregrado].
Universidad Nacional Abierta Y A Distancia.

Uribe, L. (2007). Caracterización fisiológica de levaduras aisladas de la filosfera de mora.

Trabajo de grado para obtener el título de Microbióloga Industrial. Pontificia
Universidad Javeriana. Bogotá, Colombia.
Varilla, A. (2018). Estudio comparativo de la capacidad fermentativa entre las levaduras
Saccharomyces cerevisiae ITV-01 y Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red en la
producción de etanol. Instituto Tecnológico de Veracruz. México.

Vicente, A., et al. (1997). On-line estimation of biomass through pH control analysis in
aerobic yeast fermentation systems. EN: Biotechnology and Bioengineering. Vol.
58; Nº 4; p. 445-450.

Villalobos, A. (2004). Perspectivas actuales de la proteína unicelular (SCP) en la

agricultura y la industria. Agronomy Mesoamerican, 93-106.

Zumbado, W., Esquivel, P., & Wong, E. (2006). Selección de una levadura para la
producción de biomasa: crecimiento en suero de queso. Agronomía
Mesoamericana, 17(2), 151-160.
 VI. CUESTIONARIO

6.1. ¿Qué otros métodos de determinación de biomasa existen?

Según Arnáiz et al. (2000), existen métodos directos e indirectos para la determinación
de biomasa, los cuales se explican a continuación:

La masa se mide en peso seco por unidad de

Método gravimétrico volumen, ya sea sólidos en suspensión total o
volátiles.
se relaciona el número de microorganismos de una
Métodos
muestra con la turbidez presente midiéndolas en un
espectrofotométricos espectrofotómetro y expresándola en unidades de
absorbancia.
Métodos
Métodos El recuento de microorganismos se realiza en la
directos cuadrícula central de la cámara y se multiplica por
microscópicos de
la profundidad, obteniéndose el número de
recuento celular en microorganismos por unidad de volumen (número
de células/ml, generalmente)
cámaras
Se fundamenta en la capacidad de dichas células
Métodos de siembra viables de desarrollar una colonia visible en un
medio de cultivo apropiado.
Métodos Cualquier componente celular seleccionado para la
estimación de la biomasa viva de una muestra debe
indirectos
responder a tres criterios fundamentales: estar
Componentes
presente únicamente en células vivas, ser
celulares específicos rápidamente degradado cuando las células mueran,
ser relativamente constante en concentración
respecto a cambios en el estado fisiológico celular y
entre distintas especies.
Las medidas de alguna actividad enzimática pueden
considerarse como una alternativa a los métodos
Método bioquímico tradicionales. Los ensayos enzimáticos son simples
de realizar y sus resultados se obtienen
rápidamente.
La base de estos métodos es la medida del consumo
Método cinético de sustrato o de la formación de producto en
ensayos en discontinuo.
Método físico químico La medida de la demanda química de oxígeno
(DQO) o de la medida del carbón orgánico total
indirecto
(COT), son métodos muy usados para la estimación
indirecta de la biomasa suspendida o fijada. Son
muy sensibles y precisos, pero presentan las mismas
 importantes limitaciones que los SST y SSV.
6.2. Dé dos ejemplos de materias primas y sus respectivos microorganismos para
producción de biomasa.

Zumbado et al. (2006), utilizó diferentes tipos Kluyveromyces marxianus,

de microorganismos en suero de queso para la Candida kefyr y Saccharomyces
producción de biomasa. cerevisiae.

Ezequiel (2020), utilizo el bagazo de manzanas Levaduras convencionales:

Red Delicious generado en la elaboración S. cerevisiae
de jugos exprimidos regionales para
utilizar como un sustrato alternativo a las Levaduras no convencionales:
melazas de caña y remolacha azucarera en P. kudriavzevii
medios de cultivos destinados a la
propagación de biomasa de levaduras.