UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
E.P DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA
PRÁCTICA N° 2
INTEGRANTES:
● Liset Marleny Crisóstomo Casasola
● Andrea Nicol Flores Yupton
● Marco Aurelio Reynoso Armas
● Heverth Alberto Luna Vela
● Benjamin Elias Villanueva Huaccache
● Alisson Mariel Montes Villar
● Jesús Miguel Flores Pinedo
● Emmanuel Oscar Albines Seclen
PROFESOR:
● Roger Alberto Palomino Huarcaya
Lima-Perú
2024
I. INTRODUCCIÓN
Se le denomina nutrición al conjunto de procesos y reacciones por el cual los
organismos vivientes, toman sustancias químicas del medio en el que habitan
con la finalidad de obtener energía necesaria para desarrollarse y
multiplicarse. A aquellas sustancias empleadas se le llaman nutrientes y
tienen 2 fines: fin energético cuando se emplea para el mantenimiento y fin
biosintético, cuando se utiliza para la síntesis de componentes (anabolismo).
(Lozano, et.al. 2021)
Cuando se trata de un fin energético, las bacterias se pueden clasificar en:
Litótrofas al emplear sustancias inorgánicas simples como SH2, NH3, Fe,
etc, y organótrofas al requerir sustancias orgánicas como carbohidratos,
lípidos, proteínas, etc. (Lozano, et.al. 2021)
Al hablar de un fin biosintético las podemos diferenciar en: Autótrofas
cuando la síntesis se realice a partir de sustancias inorgánicas simples como
el CO2 y heterótrofas cuando emplean una fuente orgánica. (Lozano, et.al.
2021)
Los avances en microbiología se deben a la optimización de los medios de
cultivo para los microorganismos, ya que un medio de cultivo artificial debe
reunir diversas condiciones para mantener a las bacterias vivas y en
desarrollo. Para el crecimiento bacteriano, se requieren un mínimo de
nutrientes, en el medio Agar o caldo: agua, una fuente de carbono, una
fuente de nitrógeno y algunas sales minerales. (Lozano, et.al. 2021)
Las bacterias pueden clasificarse de acuerdo a como obtengan la energía por
ejemplo, si la obtienen de fuentes inorgánicas se denominan Litótrofas, de
fuentes lumínicas Fotótrofas. Y basado en los procesos biosintéticos, por
como empleen las bacterias el carbono se clasifican en autótrofas,
heterótrofas y mixótrofas, las cuales pueden pasar de estado autotrófico a
heterótrofico y viceversa según las condiciones en las que se encuentren. Por
sus requerimientos nutricionales tenemos a las auxótrofas, estas perdieron la
capacidad de sintetizar metabolitos primarios generalmente por mutación
genética, comportándose de manera exigente frente a algún requerimiento
nutricional exógeno, y protótrofas cuando no son exigentes y se
autoabastecen. (Lozano, et.al. 2021)
Según las cantidades en que sean requeridos ciertos elementos químicos por
las bacterias, podemos clasificarlos en macronutrientes (como C, H, O, N, P,
S, K, Mg) y micronutrientes (como Co, Cu, Zn y Mo) los cuales se
encuentran combinados en la naturaleza, formando parte de sustancias
orgánicas y/o inorgánicas. (Lozano, et.al. 2021)
II. OBJETIVOS
- Demostrar los requerimientos nutricionales de las cepas: E. coli, A. ferroxidans,
S. cerevisiae y Lactobacillus sp.
- Analizar y explicar el crecimiento de la cepa en el medio cultivado
III. MATERIALES Y PROCEDIMIENTO
Materiales:
● Cultivo en caldo de Escherichia coli
● Cultivo en caldo de Acidithiobacillus ferroxidans
● Cultivo en caldo de Saccharomyces cerevisiae
● Cultivo en caldo de una cepa auxotrófica
● tubos con caldo nutricio
● tubos con caldo 9K
● tubos con medio mínimo de Davis
● placa petri con agar disuelto en agua
● placa petri con agar + sales minerales
● placa petri con agar + sales minerales + azúcar
● placa petri con agar + sales minerales + azúcar + fuente de nitrógeno orgánico
Procedimiento
El presente trabajo se enfoca en la evaluación del crecimiento bacteriano y en la
determinación de los requerimientos nutricionales mínimos de distintos
microorganismos, mediante el uso de medios de cultivo específicos. La identificación
de estos requerimientos permite entender mejor las características metabólicas y
ecológicas de los microorganismos estudiados, así como su capacidad de adaptación a
distintos ambientes
Experiencia 1: Evaluación del crecimiento en medios con fuentes de carbono orgánico
e inorgánico
En esta experiencia, se investigaron dos tipos de metabolismo bacteriano: el
heterotrófico y el quimiolitoautotrófico, utilizando las cepas de Escherichia coli y
Acidithiobacillus ferrooxidans.
1. Sembrado de Escherichia coli: Se inoculó una cepa de Escherichia coli en dos
medios distintos:
○ Caldo Nutricio (TSB): Un medio completo que contiene compuestos
orgánicos como fuentes de carbono, nitrógeno, y otros nutrientes
esenciales necesarios para el crecimiento de organismos heterótrofos
○ Caldo 9K: Un medio específico diseñado para soportar el crecimiento de
bacterias quimiolitoautótrofas, como Acidithiobacillus ferrooxidans, que
contiene sales inorgánicas y una fuente de energía inorgánica, como el
FeSO₄
2. Sembrado de Acidithiobacillus ferrooxidans: Se inoculó una cepa de
Acidithiobacillus ferrooxidans en los mismos medios:
○ Caldo Nutricio (TSB): Para determinar la incapacidad de crecimiento de
este microorganismo en un medio que no ofrece fuentes inorgánicas de
energía.
○ Caldo 9K: Que provee las condiciones necesarias para su crecimiento
quimiolitoautotrófico, utilizando compuestos inorgánicos como el hierro
ferroso (Fe²⁺) como fuente de energía
El objetivo de esta experiencia fue observar y comparar el crecimiento de ambos
microorganismos en medios con diferentes fuentes de carbono, para demostrar sus
características metabólicas distintivas.
Experiencia 2: Evaluación del crecimiento en un medio mínimo y un medio completo
En esta experiencia, se analizaron dos cepas de Escherichia coli: una cepa prototrófica y
una cepa auxotrófica, para evaluar su capacidad de crecimiento en medios con distintas
disponibilidades de nutrientes:
1. Sembrado de la cepa prototrófica de Escherichia coli:
○ Caldo Nutricio (TSB): Que proporciona todos los nutrientes esenciales,
permitiendo el crecimiento sin restricciones.
○ Medio Mínimo de Davies: Que contiene solo los nutrientes básicos,
como una fuente simple de carbono, nitrógeno, y sales minerales. Esta
cepa, al ser prototrófica, puede sintetizar todos los compuestos esenciales
a partir de estos componentes simples
2. Sembrado de la cepa auxotrófica de Escherichia coli:
○ Caldo Nutricio (TSB): Que incluye todos los nutrientes necesarios para
el crecimiento de esta cepa, que no puede sintetizar ciertos compuestos
esenciales debido a una mutación específica.
○ Medio Mínimo de Davies: Para determinar la incapacidad de la cepa
auxotrófica de crecer sin la suplementación de los nutrientes que no
puede sintetizar
Esta experiencia permitió evaluar las diferencias en los requerimientos nutricionales de
ambas cepas y su capacidad de adaptación a distintos ambientes con diferentes
disponibilidades de nutrientes.
Experiencia 3: Determinación de los requerimientos mínimos para el crecimiento
En esta experiencia se determinó la capacidad de crecimiento de cuatro
microorganismos —Lactobacillus sp., Acidithiobacillus ferrooxidans, Escherichia coli,
y Saccharomyces cerevisiae— en medios con diferentes combinaciones de nutrientes:
1. Preparación de placas: Se trazó en el fondo de cada placa Petri una división en
cuatro sectores, numerándolos del 1 al 4. Cada sector fue inoculado con uno de
los tres microorganismos estudiados, dejando un sector sin inocular como
control negativo
2. Inoculación de microorganismos: Se sembraron los siguientes
microorganismos en cada placa:
○ Lactobacillus sp., Acidithiobacillus ferrooxidans, Escherichia coli, y
Saccharomyces cerevisiae en medios con diferentes combinaciones de
nutrientes:
■ Medio con agua y agar: Este medio se utilizó como control, ya
que no proporciona fuentes de carbono o nitrógeno.
■ Medio con agua, agar, y sales: Para evaluar la capacidad de
crecimiento utilizando solo sales minerales.
■ Medio con agua, agar, sales, y fuentes de N₂: Para determinar si
las fuentes de nitrógeno son suficientes para el crecimiento.
■ Medio con agua, agar, sales, fuentes de N₂ y glucosa: Un medio
más completo que provee tanto una fuente de carbono como de
nitrógeno
3. Incubación y observación: Las placas se invirtieron y se incubaron a 37 °C
durante 48 horas. Posteriormente, se observó cada uno de los sectores
inoculados para evaluar la presencia o ausencia de crecimiento bacteriano
El propósito de esta experiencia fue determinar los requisitos nutricionales mínimos
necesarios para el crecimiento de los microorganismos y analizar cómo cada especie
bacteriana responde a la disponibilidad de diferentes nutrientes.
IV. RESULTADOS
Experiencia 1
En esta experiencia se cultivaron dos géneros bacterianos con distintos tipos de
metabolismo para evaluar sus requerimientos nutricionales, basándose en amplia
bibliografía. Los microorganismos seleccionados fueron Acidithiobacillus, conocido por
ser quimiolitoautótrofo, y Escherichia coli (E. coli), un heterótrofo.
Evaluación del crecimiento en medio con fuente de carbono orgánico y en medio
con fuente de carbono inorgánico.
Se observó la ausencia de crecimiento de Se observó crecimiento de Escherichia
Escherichia coli en medio 9K y de coli en medio TSB y de Acidithiobacillus
Acidithiobacillus ferrooxidans en TSB, lo ferrooxidans en medio 9K. Este
que se atribuye a sus respectivos requisitos comportamiento puede explicarse por la
nutricionales y características de adecuación de los medios a los
crecimiento. requerimientos nutricionales específicos
de cada organismo.
Experiencia 2
En este experimento, se evaluó el crecimiento de dos cepas de Escherichia coli: una
prototrófica (capaz de sintetizar todos los compuestos esenciales para su crecimiento a
partir de fuentes simples) y una auxotrófica (que tiene una mutación que le impide
sintetizar ciertos compuestos esenciales). Se sembraron ambas cepas en dos medios
diferentes: un Caldo Nutricio (que contiene todos los nutrientes necesarios para el
crecimiento bacteriano) y un Medio Mínimo de Davies (que sólo proporciona los
nutrientes básicos, obligando a las bacterias a sintetizar el resto).
Evaluación del crecimiento en un medio mínimo y en un medio completo
Se observó que la cepa prototrófica creció Observamos que la cepa auxotrófica solo
tanto en el caldo nutricio como en el creció en el caldo nutricio, donde se le
Medio Mínimo de Davies, ya que puede proporcionaron los compuestos que no
sintetizar todos los compuestos esenciales puede sintetizar. No creció en el Medio
por sí misma. Mínimo de Davies debido a su
incapacidad para sintetizar los nutrientes
faltantes.
Experiencia 3
En esta experiencia se sembraron Lactobacillus sp , A.ferrooxidans, E. coli y S.
cerevisiae en distintos medios de distinta conformación para evaluar su crecimiento.
Determinación de los requerimientos mínimos para su crecimiento
Lactobacillus sp. A.ferrooxidans E.coli S. cerevisiae
MEDIO:Agua y agar. Sin crecimiento Sin crecimiento Sin crecimiento Sin crecimiento
MEDIO:Agua y agar Sin crecimiento Sin crecimiento Se observó una Solo se observa
y sales colonia(arrastre crecimiento de una
de nutrientes de colonia de
medio anterior) Lactobacillus
(contaminación de
cepario).
MEDIO:Agua , agar, Sin crecimiento Sin crecimiento Sin crecimiento Sin crecimiento
sales y fuentes de N2
MEDIO:Agua y agar, Se observa Sin crecimiento Se observa Se observa
sales , fuentes de N2 y crecimiento. crecimiento pero crecimiento de
glucosa. con S.cerevisiae y
contaminación Lactobacillus por
presumible de contaminación de
Micrococcus. cepario.
Fig.5. Crecimiento de Lactobacillus sp, E. coli ,S. cerevisiae excepto de A.ferrooxidans.
V. DISCUSIÓN
En la primera experiencia se observaron las características metabólicas de
Acidithiobacillus ferrooxidans, demostrando su quimiolitoautotrofía a través de la
turbidez y cambios de color en el medio de cultivo debido a la oxidación de FeSO₄, tal
como reporta Wang et al. (2024). Por otro lado, Escherichia coli mostró crecimiento
heterotrófico en el medio TSB, utilizando compuestos orgánicos como fuente de
energía, como indica Sezonov et al. (2007). La comparación refleja la diversidad
metabólica, donde A. ferrooxidans utiliza compuestos inorgánicos, mientras E. coli
depende de nutrientes orgánicos.
En la segunda experiencia se evaluó el crecimiento de dos cepas de Escherichia coli:
una prototrófica y otra auxotrófica, sembradas en dos tipos de medios de cultivo: Caldo
Nutricio y Medio Mínimo de Davies. La cepa prototrófica, al ser capaz de sintetizar
todos los compuestos esenciales para su crecimiento a partir de nutrientes básicos,
mostró crecimiento tanto en el Caldo Nutricio como en el Medio Mínimo de Davies. En
cambio, la cepa auxotrófica, con una mutación que le impide sintetizar ciertos
compuestos necesarios, solo fue capaz de crecer en el Caldo Nutricio, ya que este medio
provee todos los nutrientes esenciales que no puede producir por sí misma. En el Medio
Mínimo de Davies, no hubo crecimiento de la cepa auxotrófica debido a la ausencia de
los nutrientes específicos que necesita.
Estos resultados confirman las diferencias en los requerimientos nutricionales entre
cepas prototróficas y auxotróficas. La capacidad de las bacterias prototróficas de
sintetizar todos los compuestos esenciales les permite adaptarse a entornos con recursos
limitados, mientras que las cepas auxotróficas dependen de un medio externo
enriquecido para sobrevivir. Este tipo de experimentos es fundamental para estudiar el
metabolismo bacteriano y las mutaciones que afectan la biosíntesis de nutrientes, lo cual
tiene importantes aplicaciones en la biotecnología y la microbiología industrial.
Con respecto a la tercera experiencia, se visualiza que es vital en el medio
macronutrientes como los compuestos carbonados principalmente y además compuestos
nitrogenados.Es por ello que no se observó crecimiento en la placa inoculada sin estos
componentes, salvo si el inóculo al ser grande le proporcionó un medio mínimo el cual
fue observado en E.coli. En el medio sin elementos carbonados no se desarrolló
crecimiento de las cepas debido a que las cepas empleadas a excepción de A.
ferrooxidans son quimioorganotrofos, esta última obtiene su energía a partir de la
oxidación del hierro ferroso, azufre y compuestos de azufre reducidos y que fija dióxido
de carbono atmosférico, el cual utiliza como única fuente de carbono. Además de ello,
esta necesita alta concentración de sales(sulfato de amonio, magnesio y hierro) y pH
muy ácido cercano a 2.(Orrantia,1997).Por otro lado, se observó crecimiento indebido al
empleo de cepario contaminado por lo que se sugiere mejorar técnicas asépticas.
VI. CUESTIONARIO
1. Establezca semejanzas y diferencias entre los organismos autótrofos.
ORGANISMOS AUTOTRÓFICOS ORGANISMOS HETEROTRÓFICOS
- Sintetizan materiales orgánicos a - Emplean fuentes orgánicas como
partir de sustancias inorgánicas la glucosa
- Son los productores y/o inicio de - Son los consumidores
la cadena alimentaria - Dependen de otros organismos o
- Dependen de la luz o sustancias fuentes externas para obtener
químicas del medio para obtener energía
energía - Necesitan energía para crecer y
- Necesitan energía para crecer y desarrollarse
desarrollarse
(Lozano, et.al. 2021) (Lozano, et.al. 2021)
2. De dos ejemplos de microorganismos autotróficos y prototróficos
AUXOTRÓFICOS
● Bacillus subtilis mutante para la síntesis de vitaminas (Anagnostopoulos y
Crawford, 1961).
● Escherichia coli (E. coli) mutante ante la exposición a luz UV
(Bachmann,1983).
PROTOTRÓFICOS
● Escherichia coli (E. coli) salvaje (Bachmann, 1983)
● Bacillus subtilis salvaje (Anagnostopoulos y Crawford, 1961)
3. ¿Cuáles son los componentes básicos que sostienen el crecimiento
bacteriano?
Los componentes que sostienen el crecimiento bacteriano son los nutrientes como el
carbono, nitrógeno y en menor medida fósforo (Brooks et al.,2006)
Otros componentes fundamentales son los llamados reguladores osmóticos como las
sales y también el pH del medio que será selectivo y específico a un cierto tipo de
microorganismo.
VII. CONCLUSIONES
Prueba 1.
La experiencia realizada permitió determinar los requerimientos nutricionales de dos
microorganismos, E.coli y A. ferrooxidans, por un lado E. coli necesita fuentes de
carbono orgánicas al ser heterótrofa, por lo que no se observó crecimiento en el
medio 9k (carente de fuentes orgánicas). De la misma forma, A. ferrooxidans no
tuvo crecimiento en el medio TSB (rico en compuestos orgánicos) ya que es una
bacteria quimiolitotrófica con requerimientos nutricionales diferentes (oxidando
compuestos inorgánicos).
Prueba 2
El ensayo realizado mostró los comportamientos de dos cepas de E. coli, una
prototrófica y la otra auxotrófica, la cepa prototrofica tuvo crecimiento en Caldo
nutricio y MMD al poseer sus rutas biosintéticas intactas siendo capaz de usar todos
los nutrientes que le proporciona el medio. Por otra parte, la cepa auxotrófica,
carente de uno o más genes que le permitan sintetizar compuestos esenciales no
crecerá en el MMD a menos que se le agregue los compuestos que no puede
sintetizar, sin embargo, su crecimiento en el Caldo Nutricio será exitoso ya que
medio rico que contiene proteínas, aminoácidos, vitaminas y otros nutrientes
orgánicos que la bacteria no puede obtener para si misma.
Prueba 3.
Este ensayo demostró que la presencia de una fuente de carbono ( como la glucosa),
una fuente de nitrógeno y un conjunto de sales minerales son esenciales para el
crecimiento de E. coli, S. cerevisiae y Lactobacillus. La cuarta placa ( agar + agua +
sales + fuente de N2 + fuente de carbono) fue la única que permitió el crecimiento
de los tres microorganismos. Esto quiere decir que estos nutrientes son
fundamentales para su desarrollo y que la ausencia de alguno de ellos podría limitar
su crecimiento. Los resultados indican que E. coli, S. cerevisiae y Lactobacillus
pueden crecer en un medio relativamente simple, lo que sugiere que son versátiles
con capacidad de utilizar diferentes fuentes de nutrientes. Es importante destacar
que este ensayo no exploró las necesidades específicas de cada especie, por lo que
se requieren investigaciones adicionales para determinar si existen requerimientos
nutricionales adicionales o preferencias por ciertos nutrientes.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
- Wang, Q., Long, H., Wang, H., & Lau Vetter, M. C. Y. (2024). Characterize the
growth and metabolism of Acidithiobacillus ferrooxidans under
electroautotrophic and chemoautotrophic conditions. Microorganisms, 12(3),
590. https://doi.org/10.3390/microorganisms12030590
- Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., & D'Ari, R. (2007). Escherichia coli physiology
in Luria-Bertani broth. Journal of bacteriology, 189(23), 8746–8749.
https://doi.org/10.1128/JB.01368-07
- Orrantia, E. (1997). Aislamiento y caracterización de cepas de Thiobacillus
ferrooxidans con alta resistencia a arsénico y su utilización en la recuperación de
oro a partir de concentrados de pirita y arsenopirita (Doctoral dissertation,
Universidad Autónoma de Nuevo León).
- Corrales, L., Lozano, L., & Trujillo, D. (2021). Las bacterias, su nutrición y
crecimiento: una mirada desde la química. Nova, 19(36): 49-94.
https://doi.org/10.22490/24629448.5293.
- Brock, T. D., et al. (2006). Biología de los microorganismos. 11va edición.
Madrid: McGraw-Hill.
- Anagnostopoulos, C., y Crawford, I. P. (1961). Gene linkage and chromosome
mapping in Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology, 81(5), 741-746.
