Cultivo celular
Conjunto de procedimientos que hacen posible el mantenimiento de células, tejidos u órganos de
organismos pluricelulares in vitro, preservando al máximo sus características siológicas, bioquímicas y
genéticas.
Cultivo de órganos.
Mantenimiento de un órgano entero o parte del mismo en interfase en un medio de cultivo arti cial y una
atmósfera controlada.
Se utilizan para estudiar interacciones y relaciones intercelulares, respuestas globales a estímulos y
sustancias, estudios regenerativos, etcétera.
Mantenimiento durante un tiempo limitado de los distintos tipos celulares diferenciados presentes en el
órgano, así como la estructura histológica y la arquitectura del órgano.
Estos cultivos no pueden propagarse, ya que la mayor parte de los tipos celulares no proliferan.
Únicamente se produce crecimiento de algunas células indiferenciadas o embrionarias presentes en los
tejidos, fundamentalmente en la zona periférica, que no conservan la estructura tisular típica del órgano.
Cultivos de explantes
Adhesión de un fragmento de tejido a una super cie, placa o frasco de cultivo y nutrición del mismo con un
medio de cultivo.
En estas condiciones controladas, las células periféricas del explante se multiplican y proliferan migrando
por la super cie del soporte.
Cultivo de células.
A partir de suspensiones celulares que se introducen en un
recipiente adecuado junto con un medio de cultivo y se incuban
en las condiciones óptimas para que las células proliferen.
Es el cultivo celular más habitual.
Se realiza a partir de células de cualquier tipo de tejido: restos
ovulares, líquido amniótico, sangre periférica, médula ósea,
células madre, etcétera.
Dos tipos de cultivos de células en función de la procedencia de
la suspensión celular de partida:
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• Cultivos celulares primarios: La suspensión celular de partida se obtiene por disgregación de las
células de un tejido por métodos mecánicos o enzimáticos. De esta manera se obtiene una mezcla
celular compleja formada por los distintos tipos celulares presentes en el tejido.
• Cultivos celulares secundarios: La suspensión celular de partida se obtiene a partir de un cultivo
primario o de otro secundario mediante un subcultivo o pase. También se pueden obtener a partir
de una línea celular mantenida en congelación.
Aplicaciones de los cultivos celulares
Investigación básica:
• Cualquier aspecto relacionado con el metabolismo celular como ciclo celular, rutas metabólicas,
ujos de diferenciación, transformación, etcétera.
• Interacciones celulares: entre células con matriz extracelular o con el medio ambiente.
Investigación aplicada:
• Inmunología para la producción de anticuerpos monoclonales.
• Virología para la producción de vacunas.
• Farmacología para producción de fármacos.
• Toxicología para estudios de Citotoxicidad, carcinogénesis y mutagénesis.
Dos aplicaciones relativamente modernas y muy interesantes son:
• La ingeniería de tejidos, que pretende conseguir la producción in vitro de tejidos (cultivos
histotípicos) y órganos (cultivos, órganotípicos) funcionales para su uso en injertos y trasplantes.
• Estudios con células madre o stem cells, enfocada a la terapia celular.
Buenas prácticas de laboratorio.
• Mangas largas, no llevar anillos, relojes, pulseras, etcétera.
• Pelo largo recogido.
• Llevar calzado cerrado.
• No comer o mascar chicle.
• No guardar alimentos ni bebidas en los frigorí cos del laboratorio.
• Utilizar el EPI cuando sea necesario.
• Eliminar los guantes después del uso. No ir con ellos a otras zonas de laboratorio.
Técnica aséptica.
• Utilizar bata exclusiva para trabajar en cultivos.
• Trabajar en la cabina de seguridad biológica.
• No toser, estornudar, hablar, cantar, etcétera hacia el interior de la campana.
• Nunca pipetear con la boca. Usar aspiradores.
• Tener cuidado con los tapones y tapas de los recipientes, no permitir que el borde toque la
super cie de trabajo.
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• Antes de empezar a a ojamos todos los tapones de los recipientes.
• Recipientes tapados, no cerrados, cuando no se estén utilizando.
• Puntas estériles. Cambiarlas si se toca algo con ellas.
• Mantener las puntas de las pipetas dentro de la cabina.
• No tocar con la punta de la pipeta, el borde de la boca de los recipientes.
Mantenimiento de cultivos celulares
Cabinas de seguridad biológica: permiten mantener un área aséptica.
Antes de utilizar la cabina:
• Apagar la lámpara UV.
• Encender la luz.
• Encender el ujo laminar y dejar funcionar el ventilador durante 5 o 10 minutos antes de empezar a
trabajar.
• Utilizar guantes. Limpiarlos con el etanol, 70%.
• Limpiar la super cie de trabajo, con etanol 70%.
• Desinfectar y colocar el material necesario dentro de la cabina con etanol 70%.
Factores que intervienen en el cultivo.
Soporte físico.
3 aspectos relativos a los recipientes:
• Materia sustrato con el que están fabricados.
• Diseño o forma.
• Posibles tratamientos de la super cie.
El material con el que se fabrican los recipientes destinados a cultivos celulares debe permitir la adhesión
de las células, ser fácilmente esterilizarle y tener una mínima calidad óptica para poder visualizar el cultivo
con un microscopio invertido.
Los más utilizados son el vidrio y los plásticos.
• Placas multipocillo: Son placas con un número variable de pocillos con fondo habitualmente
plano y cubiertas por una tapa no hermética. Son útiles para realizar experimentos puntuales
simultáneos con distintas líneas celulares o diferentes condiciones de cultivo. No son aconsejables
para el mantenimiento de líneas celulares por su mala estanqueidad y porque presentan mayor
riesgo de contaminación.
• Placas de Petri.
• Frascos o botellas roux: Son frascos planos de tapón de rosca. Son idóneos para todo tipo de
cultivos monocapa y en suspensión y para el mantenimiento de líneas celulares. Ese tipo de
frascos se pueden realizar cultivos cerrados, enroscando totalmente el tapón o abiertos
enroscando parcialmente el tapón.
Medio de cultivo
Medio nutritivo que sustituye al medio natural en el que se encuentran las células siológicamente.
Son mezclas complejas que deben aportar a las células los nutrientes para su mantenimiento y todas las
sustancias necesarias para el completo desarrollo metabólico que permita la célula proliferar.
Además, deben reunir una serie de características sicoquímicas que generan condiciones micro
ambientales adecuadas para el desarrollo celular y permitan acumular temporalmente productos de
desecho del metabolismo celular.
Composición del medio de cultivo
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• Sales minerales: participan en la regulación del pH junto a la concentración de CO2 ambiental.
• Tampón: las células son muy sensibles a los cambios de pH.
• Glucosa: fuente de energía, puede incluirse como componente único o junto con otros hidratos de
carbono.
• Aminoácidos: como mínimo, presencia de todos los aminoácidos esenciales. Puede suplementarse
con otros aminoácidos a mayores en función del tipo celular.
• Vitaminas: in uyen en la tasa de crecimiento y en la supervivencia celular. Composición muy
variable entre líneas celulares.
• Indicador del pH: Ejemplo, rojo fenol.
• Suplementos orgánicos de bajo peso molecular.
• Hormonas y factores de crecimiento: suero animal que va a aportar también proteínas, hierro,
oligoelementos, factores de adhesión, inhibidores de proteasas, etcétera.
• Antibióticos y antifúngicos: Prevención de contaminación por bacterias, levaduras y hongos.
Importante controlar la concentración nal para evitar daños en las células. Los antibióticos más
utilizados son la gentamicina y la penicilina/estreptomicina, mientras que el antifúngico más
utilizado es la anfotericina B.
Características sicoquímicas del medio de cultivo.
• PH óptimo a 7,4. Rango 7,2-7,6.
• Osmolaridad: medios isotónicos o ligeramente hipotónicos con respecto a las células. Rango de
260 a 320 mOsm/kilogramo.
• Viscosidad.
• Tensión super cial.
Atmósfera gaseosa.
Mezcla de gases en las que se mantienen los cultivos. Sus dos componentes más importantes son el O2 y
el CO2.
Los componentes de la atmósfera del cultivo son controlados y suministrados por el incubador.
• O2: En general, la concentración de oxígeno atmosférico es su ciente para cubrir las necesidades
de cualquier cultivo celular. Solo algunos cultivos de órganos requieren una mayor concentración
de oxígeno, hasta un 95%, por la mala difusión de este elemento al interior del órgano.
• CO2: Regulación del pH. La concentración más habitual, 5% (rango 2-8%).
Condiciones de incubación.
• Temperatura: In uye en la tasa de crecimiento. La temperatura óptima de crecimiento suele ser la
misma a la que están sometidas siológicamente en los organismos de procedencia.
• Humedad: Debe ser su cientemente elevada para evitar la evaporación del medio de cultivo, lo que
produciría aumento de la concentración de los componentes y osmolaridad del mismo y
variaciones de pH.
Procedimientos de cultivo celular.
Disgregación celular.
Cuando se quieren cultivar células procedentes de un órgano o tejido, el primer paso consiste en obtener el
tipo celular de interés en suspensión. Para ello se tienen que separar las células entre sí y de la matriz
extracelular en la que se encuentran inmersas.
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• Métodos mecánicos: Basados en cortar, picar e incluso triturar suavemente fragmentos de
órganos o tejidos colocados en una placa de Petri con tampón o medio de cultivo en el que se
recogen las células disgregadas tras ltrado para retirar los restos del tejido.
• Métodos enzimáticos: Basados en el tratamiento del tejido, con enzimas proteolíticas que
digieren proteínas de la matriz extracelular, liberando las células englobadas en ella. Entre las
proteasas más utilizadas están la tripsina, la colegenasa, la dipasa, la papaína, la elastasa y la
pronasa.
• Combinación de ambos.
Selección de células.
Se basa en:
• Propiedades especí cas de las células, por ejemplo, su distinta adhesión a sustratos.
• Métodos inmunológicos de selección de células: Basados en el uso de anticuerpos especí cos que
reconocen las células de interés anclados a un soporte sólido.
• Método automatizado de selección de células: citómetro de ujo con capacidad de cell sorting.
Recuento y viabilidad celular.
Densidad celular: número de células por mL
Viabilidad celular o supervivencia celular: porcentaje de células vivas.
• El colorante vital permite distinguir células vivas de células muertas. Por ejemplo, el azul tripán
coloide de color azul que penetra en el interior de las células que tienen la membrana
citoplasmática a rota, pero que no atraviesa aquellas células con las membranas intactas.
Contaje: recuento de las células viables y no viables.
Este proceso se lleva a cabo en la Cámara de Contaje Celular o hemocitómetro: Cámara de Neubauer
Conservación de células: Las líneas celulares continuos e inmortales se pueden mantener en el tiempo
mediante pases seriados. Sin embargo, esto conlleva un gasto de recursos y tiempo. Es por esto que el
método más habitual de conservación de las líneas celulares es la congelación.
Descongelación de células: Procedimiento habitual del laboratorio de cultivos celulares para iniciar
cultivos secundarios a partir de líneas celulares mantenidas en congelación en nitrógeno líquido o a -80 °C.
Inicio del cultivo o siembra: Partiendo de una suspensión celular obtenida por disgregación, selección o
descongelación, el cultivo se inicia sembrando un número determinado de células.
Mantenimiento del cultivo: Incluye las diferentes operaciones para el control de la viabilidad y crecimiento
de los cultivos:
• Control, periódico microscópico (Microscopio invertido o de contraste de fases): Observación del
aspecto, crecimiento, con uencia y posibles contaminaciones.
• Cambio de medio: Para renovar los nutrientes consumidos por las células y retirar los productos de
desecho generados por el metabolismo celular. Se realiza cada dos 3 días y en cualquier caso,
siempre que se observe un cambio de color del medio (viraje del indicador del pH).
• Subcultivo o pases: Tras un cierto tiempo de cultivo, los cultivos en monocapa se encuentran en
situación de con uencia y los cultivos en suspensión alcanzan una densidad crítica. En ambos
casos el crecimiento se detiene y hay que realizar un su cultivo o pase con el objetivo nal de
expansión del cultivo.
Formas de crecimiento
En monocapa: Las células crecen adheridas sobre una super cie sólida, dependientes de anclaje.
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Momentos o etapas de desarrollo:
•Adhesión a una super cie: corresponde con el periodo de latencia de la curva de crecimiento.
•Proliferación y formación de colonias: corresponde con la fase exponencial de la curva de
crecimiento.
• Inhibición por contacto: con el paso del tiempo, las células ocupan toda la super cie disponible y
entran en con uencia, produciéndose un fenómeno conocido como inhibición por contacto, en el
que las células detienen su crecimiento, aunque se mantienen vivas. Se inicia la fase estacionaria
de la curva de crecimiento, en la que la morfología y la siología de las células se parecen más a la
de las células de origen.
Mantenimiento de células adherentes.
• Tripsinización: procedimiento de despegado de una monocapa de células de la super cie del
recipiente mediante una solución tripsina/ EDTA. La tripsina va a digerir las proteínas responsables
de la adhesión a la super cie y el EDTA retira del medio los iones Ca+2, que estabilizan la
interacción célula sustrato.
En suspensión: las células crecen manteniéndose dispersas en el seno del medio de cultivo y
proliferando.
Crecimiento típico de células sanguíneas, células hematopoyéticas, células madre, algunas líneas
tumorales y algunas líneas celulares transformadas.
Momentos o etapas de desarrollo:
• Adaptación al medio de cultivo: corresponde con la fase de latencia de la curva de crecimiento.
• Proliferación en suspensión: corresponde con la fase de crecimiento exponencial.
• Inhibición por densidad: momento crítico en el cual se alcanza un número crítico de células en
relación con el volumen del medio de cultivo, los nutrientes que quedan en él. En este momento,
las células dejan de crecer, aunque se mantienen vivas. Corresponde con la fase estacionaria de la
curva de crecimiento.
Contaminaciones
Las contaminaciones de cultivos celulares se re eren principalmente a la alteración del cultivo por la
presencia de microorganismos no deseados y que son omnipresentes en el ambiente.
Estos contaminantes, según la mayor frecuencia en la que se presentan, se pueden agrupar en: bacterias,
levaduras y hongos, micoplasmas y virus.
• Bacterias, levaduras y hongos.
Las bacterias y las levaduras son los contaminantes más habituales en cultivos a corto plazo, mientras que
los hongos son el contaminante más habitual en cultivos de largo plazo.
Estos organismos crecen perfectamente los medios de cultivo para células, pero mucho más rápido que
ellas, por lo que ocasiona la muerte del cultivo en muy poco tiempo.
La fuente de contaminación normalmente es ambiental o por malas prácticas de laboratorio.
• Micoplasmas
Son microorganismos procariotas sin pared celular que pueden infectar a cultivos y producir su muerte o
una alteración en el crecimiento de las células. Al carecer de pared celular, presentan resistencia frente a
antibióticos.
En muchas ocasiones, la contaminación procede de las propias líneas celulares continuas que se
suministran ya contaminadas o de los sueros animales.
Es importante tener líneas celulares libres de micoplasmas, porque pueden interferir en los resultados de los
experimentos.
• Virus.
La infección por virus, aunque es infrecuente, es grave.
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La fuente principal de contaminación viral solían ser los sueros animales, aunque en la actualidad, están
muy controlados.
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