UNIVERSIDAD NACIONAL MIECAELA BASTIDAS DE APURÍMAC

FACULTAD DE INGENIERÍA
ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA
AGROINDUSTRIAL

TALLER IV

Docente: ING. Alex Ernesto Muñoz Cáceres

Integrante:

- Katy Hilaria Diaz Gutiérrez (222067)

ABANCAY- PERÚ
2024

I. INTRODUCCIÓN
La microbiología es el estudio de los organismos microscópicos (celulares y
subcelulares), principalmente de aquellos que se encuentren por debajo del poder de
resolución del ojo humano, estos seres tienen un rango de tamaño de 10-5 a 10 mm,
por ende, es necesario el manejo experimental para observar, describir su morfología
y taxonomía. Para ello se debe tener habilidades de manejo de los instrumentos de
laboratorio (principalmente el microscopio), saber las técnicas básicas de preparación
de una muestra fija de bacteria para tinción, que es un procedimiento preliminar a la
mayoría de métodos de tinción a bacterias. Se aprenderá a realizar el método de
tinción simple con colorantes básicos en cual consiste en destacar el microorganismo
completo para que se vean las formas y las estructuras básicas.

II. MARCO TEÓRICO

La gran mayoría de microorganismos son casi incoloros cuando se les observa a través
de un microscopio óptico estándar, para una visualización de bacterias de manera
adecuada y de sus estructuras internas, se requieren tinciones biológicas. La
introducción de tinciones a mediados del siglo XIX influyó mucho sobre los principales
avances en microbiología. En tamaño y forma las bacterias de importancia médica son
microorganismos muy pequeños que se presentan en tres formas generales: esféricos
designados como cocos, organismos en forma de bastón designados como bacilos, y de
formas espirilas, dentro de estas tres mencionadas anteriormente se encuentran otros
microorganismos que adoptan variantes morfológicas designadas como formas
pleomórficas. Las tinciones consisten en preparaciones acuosas u orgánicas de
colorantes o grupos de colorantes que proporcionan una variedad de colores a los
microorganismos y a los tejidos vegetales y animales, u otras sustancias de importancia
biológica (Koneman, 2008).
a.1. Los colorantes
Se pueden clasificar según su origen o según su comportamiento químico.
Según su origen:
a. Naturales. Son los colorantes extraídos de animales y sobre todo de plantas. Por
ejemplo, la hematoxilina.
b. Artificiales. Son los colorantes preparados en mayor parte de alquitrán de hulla.
Según su comportamiento químico:
Los colorantes son las sales compuestas por un ion positivo y un ion negativo, uno de
los cuales esta coloreado y se conoce como cromóforo. (Tortora, 2007).
 a. Ácidos o aniónicos. El color de los colorantes ácidos, está en el ion negativo.
Son los colorantes citoplasmáticos. Estos no son atraídos por la mayor parte de
los tipos de bacterias porque la superficie bacteriana con carga negativa repele
los iones negativos del colorante, de modo que este tiñe el fondo en lugar de la
estructura bacteriana. Es ejemplo de colorante acido la fucsina ácida.
b. Básicos o catiónicos. El color de los denominados colorantes básicos está en el
ion positivo. En un pH de 7 las bacterias presentan una carga levemente
negativa. Por lo tanto, el ion positivo coloreado en un colorante básico es atraído
hacia la célula bacteriana con carga negativa. Los colorantes básicos entre los
que se encuentran el azul de metileno y el cristal violeta o violeta de genciana, se
utilizan con más frecuencias que los colorantes ácidos.
c. Neutros. Son sales compuestas de un color ácido y un color básico. Por
ejemplo, cosinato.
d. Indiferentes. Son los colorantes insolubles en agua y solubles en alcohol donde
no predomina ni la carga positiva ni la carga negativa. Pero no tienen carácter
neutro, colorantes de los lípidos, por ejemplo, el Sudan III, negro Sudán.
(Granados, 1997).
a.2. Fijación
Todas las técnicas de tinción exigen una preparación previa antes de proceder a la
tinción en sí. Hay que seguir tres pasos: extensión, desecación y fijación. De estos
depende la calidad de las tinciones (García, 1994).
a. Extensión
Consiste en formar una película de la muestra sobre un portaobjetos
perfectamente limpio y desengrasado (conservado en alcohol). La deposición de
la muestra debe ocupar aproximadamente una superficie de 1cm2 los
portaobjetos suelen flamearse antes de su uso para eliminar los restos de grasa y
suciedad.
La forma de realizar la extensión depende del estado físico en que se encuentre
la muestra: para muestras líquidas basta con depositar una gota en el centro del
portaobjetos y extenderla con un asa; para muestras sólidas, o colonias
procedentes de un cultivo, se deposita con antelación sobre el portaobjetos una
pequeña gota de agua, o mejor de solución salina, en la que se efectúa una
emulsión.
 b. Desecación
Siempre debe realizarse al aire. Puede favorecerse colocando e portaobjetos
sobre el calor suave de una llama de un mechero, pero tomando precauciones
para no forzar el proceso de secado.
c. Fijación
El proceso de fijación produce la muerte simultánea de los microorganismos y
su adherencia al portaobjetos por su coagulación de sus proteínas plasmáticas
mediante calor. También preserva diversas partes de los microorganismos en su
estado natural con distorsión mínima. Se aplica el colorante, se lo lava con agua
y se lo seca con papel absorbente. Si no se realizara la fijación el colorante
podría arrastrar los microorganismos del portaobjetos (Tortora, 2007)
a.3. Técnicas de tinción Las principales ventajas de la técnica de tinción
son:
 Observar más adecuadamente su morfología.
 Proporcionar el contraste preciso y suficiente en cada caso, lo que permitirá
diferenciar distintos tipos morfológicos.
 Establecer una información completaría sobre sus estructuras internas y/o
externas que no podrían ser observadas por examen en fresco.
 Conocer sus características tintoriales orientándonos hacia un grupo taxonómico
u otro en la clasificación bacteriana.
Las tinciones pueden ser:
a. Simples. Utilizan un solo colorante. Se basan en el hecho de que las células
tienen una composición química diferente a la de su entorno, de modo que
ambos se comportan de forma diferente frente a un colorante. El colorante tiñe
las células (azul de metileno, safranina) o no (nigrosina).
b. Diferenciales. Se basan en el hecho de que distintos tipos de células tienen
distinta composición química, y por lo tanto reaccionan de forma diferente frente
a una tinción, lo que permite clasificar los microorganismos en diferentes
grupos, según su capacidad de tinción. En este apartado están dos tinciones de
importancia taxonómica y médica: la tinción de Gram y la de ácido-alcohol
resistencia (de Ziehl-Neelsen). Estas tinciones utilizan más de un colorante.
c. Selectivas. Se basan en el hecho de que distintas estructuras celulares tienen
distinta composición química, de modo que se tiñen selectivamente con ciertos
 colorantes. Ejemplo: tinción de esporas, de flagelos, de paredes celulares, de
corpúsculos metacromáticos. Pueden utilizarse uno o más colorantes.
II.4. Técnica de tinción simple
Esta es una técnica que utiliza un colorante, todas las células se observan del color del
colorante empleado. Aunque los diferentes colorantes se unen de forma específica a las
distintas partes de las células el propósito principal de una tinción simple es destacar el
microorganismo completo para que se vean las formas y las estructuras celulares
básicas. El colorante se aplica al extendido fijado por un tiempo determinado, se lava, se
seca y examina.
II.5. Factores que afectan a toda técnica de tinción
 Pureza del colorante
 Concentración del colorante
 El pH del colorante
 Conservación del colorante
 Elaboración del colorante
 Técnica empleada
 Temperatura
 Cantidad de muestra
 Realizar correctamente el frotis
 Tiempo de tinción
 Soluciones mordientes
II.6. Observación de los microorganismos con microscopio de alto poder
amplificador
Se usa mayormente ocular que aumentan de 10 y objetivo de inmersión, dispositivos
que brindan amplificaciones de casi 1000 diámetros. Es sabido que el vidrio y el aire no
tienen la misma refracción, se emplea aceite de inmersión para que no exista aire entre
la preparación y el objetivo. Se procede entonces a descender el objetivo hasta la gota
de aceite de manera que no quede aire entre el portaobjetos y la lente (Witton, 1965).

III. PARTE PROCEDIMENTAL

EJERCICIO N. 1 PREPARACION DE UNA MUESTRA FIJA DE BACTERIAS
PARA TINCIÓN
Previo al desarrollo de una técnica de tinción, el material al ser observado debe ser
fijado, es decir adherido a una lámina de vidrio sobre la cual ha de realizarse la tinción.
Si la preparación no es fijada, la muestra tiende a perderse durante el procedimiento de
tinción. El procedimiento de fijación mata al microorganismo, coagula el protoplasma
celular y provoca su adhesión a la lámina de vidrio. Un agente de fijación ideal preserva
la estructura de la célula en la forma y posición normal sin causar la aparición de
artefactos (estructuras no presentes en la célula viviente). Aunque el calentamiento es el
agente de fijación de uso más común, el alcohol y otros agentes químicos también
pueden ser usados satisfactoriamente.
A. MATERIALES.
 Asa de kôlle
 Lamina porta objetos
 Mechero de alcohol
 Piseta con agua

B. PROCEDIMIENTO
1) Primero limpiamos todo el espacio donde se trabajó la práctica.
2) Prendimos el mechero y esterilizamos el asa kòlle en la flama del mechero hasta
que se pusiera al rojo vivo.
3) Dejamos enfriar el asa para evitar que al tomar la muestra los microorganismos
sean destruidos, después acercamos al mechero el tubo de cultivo, quitándole el
tapón y flamear rápidamente la boca del mismo.
4) Colocamos una gota de agua destilada sobre una lámina de porta objeto
completamente limpia. Con ayuda del asa de kòlle colocamos sobre la gota una
pequeña porción de la muestra a fijar.
5) Distribuimos la gota cargada con la muestra en la lámina hasta formar una
película delgada luego secamos la lámina al aire a una razonable distancia sobre
la llama del mechero.
6) Cuando la película estuvo seca, pasamos la lámina a través de la llama del
mechero unas 2 a 3 veces para así fijarlo con calor, cuidando que la película este
hacia arriba y que la lámina no se recaliente. La sobre exposición al calor puede
alterar la forma y estructura del microorganismo.

EJERCICIO NRO. 02 TINCION SIMPLE CON COLORANTES BASICOS

La tinción simple constituye una técnica sencilla y directa que, a través del uso de un
colorante, nos permite constatar y diferenciar los microorganismos de su entorno. Los
colorantes básicos, los cuales se utiliza más comúnmente para teñir microorganismos,
difieren en el grado de reactividad con las células, estas generalmente tiene una
superficie cargada negativamente cuando el pH del medio es cercano a la neutralidad,
entonces se aplica el azul de metileno ( ion positivo) que reacciona con la pared celular
por medio de enlaces iónicos débiles que están cargadas negativamente a la tasa más
baja, tomando de 50 a 60 segundos para teñir apropiadamente una preparación
microbiana. El cristal violeta es más reactivo y generalmente requiere solo 10 segundos.
Su reactividad es tan grande que ciertamente puede dificultar una tinción apropiada,
sobre todo cuando la muestra contiene abundante materia orgánica.
C. MATERIALES.
 Laminas fijadas de microorganismos
 Aceite de inmersión
 Colorantes básicos
 Azul de metileno
 Cristal violeta
 Papel secante
 Piseta de agua
D. PROCEDIMIENTO
1) Colocamos las láminas fijadas de microorganismos sobre el soporte para tinción.
2) Agregamos 5 a 6 gotas de cada colorante dejando que actúen por un tiempo de
30 segundos para el azul de metileno; 10 segundos para el cristal violeta.
3) Una vez cumplido el tiempo para los colorantes, lavamos cada lámina con agua
destilada.
4) Secamos las láminas al aire o dentro del papel secante.
5) Examinamos las preparaciones teñidas bajo el objetivo de inmersión (100X) de
un microscopio compuesto.
IV. DISCUSIÓN
 Según Koneman (2008), menciona que como la mayoría de las bacterias carecen
de coloración, es importante teñirlas para poder observarlas al microscopio y
determinar su tamaño, morfología y disposición relativa, por tal motivo se
utilizó azul de metilo como colorante para la Staphylococcus sp, aunque no se
trató de un colorante rápido su uso dificultó una tinción apropiada, dando como
resultado una baja nitidez.
 Según Granados (1997) menciona que, existen distintos factores que afectan a
las técnicas de tinción, como el no realizar correctamente el frotis o variar el
 tiempo de tinción, estos factores pudieron haber afectado la observación de
Staphylococcus.
 Según Madigan (2004) a las bacterias esférica u ovoide se les denomina cocos, a
las de forma cilíndrica bacilos. Para el caso de la Staphylococcus se observó en
forma de cocos, para la E. Coli se trata de una forma ovoide, que también
incluye la forma cocobacilo. En el caso del Bacillus obtuvimos una forma de
bastón.
 Según Madigan (2004) son las características físicas y químicas que un
microorganismo necesita para su favorable crecimiento las que generan las
comunidades microbianas o agrupaciones donde realizan sus procesos
metabólicos. Se observó que la E. Coli no se forma agrupaciones porque su
tendencia a permanecer unidas es bastante baja.
 Los Staphylococcus forman en agrupaciones de racimos, es por eso que en la
muestra teñida de azul de metilo se observó varias colonias de estos
microorganismos en grupos con forma de racimos.
V. CONCLUSIÓN
 Los colorantes son muy importantes para la observación de microorganismos ya
que proporciona contraste entre el este y el medio que lo rodea, permitiendo
diferenciar su morfología.
 Aunque se había recomendado usar el colorante azul de metilo para la tinción de
la Staphylococcus sp, se tuvo dificultad para una observación nítida.
 La técnica de tinción simple nos ayuda a ser visibles las formas, tamaños y
agrupaciones variadas que presentan las bacterias.

VI. Bibliografía
 AGUILAR P., J. y F. SENENT. 1986. Cuestiones físicas. Reverté Editorial.
Primera Edición. Sevilla. COVADONGA. 2010. Técnicas básicas de
Microbiología. Observación de bacterias. Madrid. Disponible
en:[Link]/[Link]/biologia/article/download/819/834consu
ltada el 01 de setiembre del 2013.
 GARCIA, P; FERNANDEZ, M y PAREDES, F. 1994. Microbiología clínica
práctica. 2ª edición. Editorial Universidad de Cádiz servicio de
publicaciones. Cádiz.
 GRANADOS, R; VILLAVERDE, C. 1997. Ciencia de la Salud
Microbiología. Editorial Paraninfo. España.
 KONEMAN, E; ALLEN, S y JANDA.2008. Diagnostico Microbiológico.
Texto y Atlas en color. 6ª edición. Panamericana Editorial. Buenos Aires.
 MADIGAN, M. et al. 2004. Biología de los microorganismos. Brock.
Pearson-Prentice Hall Editorial. 10ª edición. Madrid.
 PRESCOTT, L. et al. 2002. Microbiología. Mc Graw Hill Editorial. 5ta
edición. Madrid.
 TORTORA, [Link] al. 2007. Introducción a la microbiología. Panamericana
Editorial. 9ª edición. Buenos Aires.
 WITTON. 1997. Microbiología. Primera edición. Compañía Editorial
Continental, SA. México.