Tema 4: Laboratorios de biología molecular y

citogenética
 Laboratorio de biología molecular
• La técnica básica que se lleva a cabo en un laboratorio de biología molecular es la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

• AI ser considerada como la herramienta molecular por excelencia, la

estructuración del laboratorio, los flujos y las formas de trabajo se van a organizar
alrededor de esta técnica.

• se trata de una técnica de laboratorio que nos permite, a partir de una cantidad
mínima de ADN, obtener millones de copias iguales de esta. Veremos que este
proceso se llama amplificación de ADN.

Extracción de ADN PCR(amplificación) electroforesis

Secuenciación
 Equipamiento
• Tanto en el laboratorio de biología molecular como en el de citogenética y cultivo celular se puede
hablar de dos tipos de equipamientos: un equipamiento específico y un equipamiento genérico.

• Equipamiento especifico

El equipamiento especifico del laboratorio de biología molecular es el que permite realizar las
técnicas exclusivas de este tipo de laboratorio. Este equipamiento cuenta con una infraestructura
principal, necesaria para la realización de la PCR y para el análisis de los productos de amplificación
que se obtienen. Consta de:
– El termociclador.
– El equipo de electroforesis
– El documentador de geles.

• También forman parte de este equipamiento los aparatos automáticos necesarios para la
realización de procesos específicos, como son:
– La extracción de ácidos nucleicos.
– La secuenciación de los fragmentos que son objeto de estudio. Esta función la cumplen los
aparatos denominados secuenciadores.
 Termociclador
• Es el aparato en el que se lleva a cabo la PCR.

• Es un aparato básico en cualquier laboratorio de biología

molecular. Permite realizar secuencialmente un número
elevado de ciclos programables con temperaturas diferentes y
distintos tiempos de incubación, controlado por un
microprocesador.
• Las partes mas destacables del termociclador son el bloque
incubador y la tapa termostatizada

• El bloque incubador. Es la parte más importante. Se trata de un

soporte metálico con múltiples pocillos para colocar los tubos
de reacción de PCR.

Es capaz de mantener de manera homogénea en todo su volumen,

durante los tiempos que se requiera, las distintas temperaturas que
se programan para cada fase y en cada uno de los ciclos de PCR. El
rango de temperatura que pueden alcanzar estos bloques va de 4 °C
a 96 °C.

• La tapa del bloque incubador. Es una tapa termostatizada a

102-105 °C que, una vez cerrada entra en contacto directo con
la tapa de los tubos de reacción. Esto evita que el agua de la
mezcla de reacción de PCR se evapore por efecto de las
temperaturas alcanzadas en el bloque incubador y se condense
en la tapa, más fría, con la consiguiente concentración de los
reactivos en la mezcla que alterarla el desarrollo de la reacción.
 El equipo de electroforesis
• Otro proceso que se lleva a cabo en el laboratorio de
biología molecular y que precisa de un equipo
específico es la electroforesis en gel.

• Básicamente este proceso sirve para separar moléculas

de ácidos nucleicos de distintos tamaños, y permite por
ejemplo analizar los productos amplificados en una PCR
y purificar esos fragmentos de tamaños concretos de
ADN.

• Se lleva a cabo aplicando un campo eléctrico en una

disolución tampón (pH 7,5-7,8) en la que se sumerge
una matriz que contiene las muestras de ácidos
nucleicos. Estos migran con mayor o menor velocidad a
través de la matriz en función de la carga neta que
poseen (negativa a ese pH), su tamaño y su
conformación tridimensional.

• La matriz que se utiliza es un gel de agarosa o bien de

poliacrilamida. El uso de uno u otro y la concentración
de los componentes dependerá del tamaño de las
moléculas que queremos separar y de la resolución que
queramos obtener
 Electroforesis
• La localización final de los ácidos nucleicos en el gel se realiza
con un agente intercalante fluorescente como el bromuro de
etidio.

• El equipamiento que permite efectuar la electroforesis consta

de:

1. Soporte plástico o cama donde solidificar el gel.

2. Cubeta de electroforesis. Se compone de:

1. Un soporte central para la «cama» con el gel. Dos

zonas de depósito de tampón de electroforesis en
cada uno de los extremos.
2. Electrodos positivo y negativo en cada extremo
3. Fuente de alimentación, que suministre corriente
eléctrica continua a la cubeta de electroforesis.
Debe permitir seleccionar voltaje o amperaje y
graduar su intensidad.

3. Documentador de geles

Después de terminar la electroforesis se podrán visualizar los

resultados mediante la utilización del documentador de geles
El documentador de geles es un equipo que permite visualizar
las bandas de ácidos nucleicos en el gel después de la
electroforesis y obtener una fotografía de él.
 Documentador de geles
• Este equipo consta, básicamente de :

• Un transiluminador. Consiste en una fuente de luz ultravioleta (con una longitud de onda de entre 245-
365 nm) situada por debajo de una superficie transparente al UV donde se coloca el gel. Cuando la luz
UV agente intercalante emite fluorescencia, visualizándose las bandas correspondientes a las
moléculas de ácidos nucleicos.

• Una cámara fotográfica o sistema de captación de imágenes. La visualización se realiza con una cámara
fotográfica conectada por un software específico. Con esta cámara es posible visualizar el gel en la
pantalla de un monitor, mejorar las condiciones de la imagen, obtener fotografías y realizar
mediciones.
 Equipamiento genérico
• El equipamiento genérico es común con otro tipo
de laboratorios, aunque algunos aparatos puedan
tener características o adaptaciones especiales
para aplicaciones concretas de biología molecular.
En este sentido cabe destacar los siguientes
equipamientos:

1. La cabina de bioseguridad. En los laboratorios de

biología molecular se deben utilizar cabinas de
flujo laminar que protegen de contaminación a la
muestra, a la persona manipuladora y al medio
ambiente. Su utilización es particularmente
importante cuando se trabaja con ARN
(extracción y purificación de ARN, preparación de
reactivos, manipulación de las muestras con ARN,
etc.), puesto que las ARNasas son omnipresentes
y pueden degradar el ARN de una muestra
rápidamente.

Son también imprescindibles si se trabaja con

cultivos celulares.
 Equipamiento genérico

2. El sistema de purificación de agua. El laboratorio de biología molecular requiere

un suministro de agua ultrapura

En el mercado hay muchos equipos de purificación de agua basados en distintas

tecnologías, como electrodesionización, resinas de intercambio iónico, ósmosis
inversa, filtración, etc. La elección de uno u otro dependerá del consumo diario
de ambos tipos de agua.

Cuando el consumo de ambos tipos de agua es muy bajo, se pueden adquirir

como si se tratara de un reactivo más.

3. El espectofotómetro: La medida de la concentración de ácido nucleico de una

muestra y de su pureza requiere lecturas de absorbancia en un rango de
longitudes de onda comprendidas entre 230 y 320 nm, por lo que se requiere un
espectrofotómetro que cubra ese rango. Dado que en Ocasiones la cantidad de
muestra es muy pequeña, se han diseñado espectrofotómetros específicos para
cuantificar ácidos nucleicos que utilizan cantidades mínimas de muestra (1 µl)
basados en cubetas capilares.
 Equipamiento genérico

4. Microscopio de luz transmitida y fluorescencia

• En biología molecular, un microscopio de fluorescencia es imprescindible para
interpretar las técnicas de hibridación in situ fluorescente.
• Debe estar dotado con los filtros de fluorescencia adecuados para los fluorocromos
utilizados y es aconsejable que tenga un sistema de captación de imágenes.

5. Autoclave.
• Es imprescindible si se trabaja con microorganismos y aconsejable en cualquier caso.
Aunque la casi totalidad del material fungible que se utiliza en el laboratorio se puede
adquirir estéril, la utilización del autoclave puede disminuir en gran medida los costes de
las tareas del laboratorio.

6. incubador o estufa.
• Las características de los incubadores que se usan en el laboratorio de biología
molecular dependen de las muestras que se estudien y de las técnicas que se apliquen.
• Si se trabaja con bacterias se necesitarán estufas de cultivo de microbiología. Si se
trabaja con cultivos celulares se requerirán incubadores con CO2 y humedad controlada.
 Equipamiento genérico

7. Baño termostático, termobloque y placa calefactora.

Esta clase de equipamiento con temperatura regulable es básico para realizar todo tipo de
incubaciones, digestiones y tratamientos enzimáticos.
• La placa calefactora, en concreto, es importante que pueda alcanzar de manera homogénea y
estable temperaturas de 95 grados para desnaturalizar el ADN de células y tejidos

8. Centrífuga y microcentrífugas
• tienen que tener rotores que permitan centrifugar desde tubos de 50 ml a Eppendorf de 0,2 ml. Lo
ideal es que alguna sea refrigerada.

9. Neveras y congeladores de -20 a -8 0.

• Una infraestructura de frío con neveras y congeladores es fundamental para conservar los reactivos
y las muestras
• La mayor parte de los reactivos(sobre todo las enzimas) se conserva a -20°C
• La conservación de todas las muestras de ARN y el almacenamiento a largo plazo de las muestras
de ADN debe realizarse a -80°C
 Equipamiento genérico
10. Incubador de CO2 :El incubador de CO2 es el aparato que proporciona las condiciones
ambientales óptimas para el crecimiento del cultivo. Consta de los siguientes dispositivos:
– Control de temperatura
– Recircularización del aire interior, para homogeneizar la temperatura.
– Control de CO2. El CO2, puro se suministra comprimido en botellas presurizadas y este
dispositivo lo mezcla con aire en la proporción adecuada (4-7%) y lo inyecta en el
interior del incubador.
– Control de humedad. En el interior del incubador se requiere una humedad ambiente
elevada para evitar la evaporación del medio de cultivo. Los incubadores más
sencillos lo consiguen, simplemente, colocando una bandeja con agua en el suelo del
incubador. Sin embargo, esta solución no es la ideal por la facilidad con la que se
contamina esa agua. Por ello, los incubadores actuales incorporan un dispositivo de
control de humedad que inyecta agua estéril.
 Incubador de
CO2

A) Se muestran dos incubadoras sobrepuestas (1 y 6) para aprovechar el

espacio. 2, indicador de las condiciones de la incubadora. 3, Regulador de
flujo de CO2. 4, Tanque de CO2. 5, Tubo de flujo de CO2 del tanque a las
incubadoras.

B) Incubadora en su interior. 1, puerta con capa aislante térmico. 2, manija de

puerta de vidrio que permite mirar al interior sin alterar demasiado las
condiciones de cultivo. 3, bandejas desmontables para poner las cajas de
cultivo. 4, bandeja con agua para mantener la atmósfera saturada de vapor
de agua.
 Equipamiento genérico
11. Microscopio invertido
El control del crecimiento de un cultivo se realiza por observación microscópica
directa. Ahora bien, el tamaño de los frascos de cultivo impide la utilización de un
microscopio óptico convencional y por ello se recurre a un microscopio invertido

El microscopio invertido se caracteriza por tener invertidas la posición de la fuente de

luz (por encima de la platina) y el revólver de objetivos (por debajo de la platina)
respecto de un microscopio convencional.
 Equipamiento genérico
12. Equipo de criogenia
• El equipo de criogenia permite conservar a largo plazo y en forma viable muestras de células
y Iíneas celulares.
• El equipo de criogenia mínimo está constituido por un tanque o depósito de nitrógeno
líquido.
• Es un equipamiento imprescindible en los Iaboratorios de cultivos celulares, optativo en los
de citogenética.
 La estructura del laboratorio
Como ya se ha comentado en la introducción de esta unidad, la estructura del laboratorio de biología
molecular está condicionada por la técnica principal que se realiza. La realización de una PCR implica:

• Preparación de reactivos.
• Extracción y purificación de ADN de una muestra biológica.
• Reacción de amplificación propiamente dicha.
• Análisis de los productos de la reacción mediante electroforesis y documentación del gel.

Cada una de estas actividades debe realizarse en un área de trabajo independiente, físicamente separadas en
salas distintas y, cada una, con su propio equipamiento y material de trabajo, de manera que estos no puedan
ser intercambiables entre ellas. En consecuencia, un laboratorio de biología molecular debe constar, como
mínimo, de cuatro salas independientes:

1. Sala de preparación de reactivos. Se considera que esta es el área «limpia» del laboratorio (sin ADN). En
ella se preparan todos los reactivos que se van a utilizar en el laboratorio, incluyendo la mezcla de
reacción de PCR.
Es fundamental que los reactivos no se contaminen con ADN, por ello esta sala debería tener una ligera
presión negativa, para evitar la entrada de cualquier fuente de contaminación y es imprescindible que
disponga de una cabina de bioseguridad

2. Sala de preparación de muestras y extracción de ADN. Esta es una sala «sucia» (con ADN), por lo que
seria conveniente que tuviese una ligera presión positiva para evitar que pueda escaparse material
contaminante. Debe contar con una cabina de bioseguridad y un espectrofotómetro.

3. Sala de PCR. Dispone de los termocicladores necesarios para llevar a cabo la PCR y un espacio de trabajo
para añadir las muestras de ADN a la mezcla de reacción.

4. Sala de post-PCR. Dispone de los equipos de electroforesis y de documentación de geles. Esta es también
una sala «sucia», fuente importante de contaminación por productos amplificados, por lo que también
debería tener una ligera presión positiva. En situaciones ideales la documentación de geles puede
situarse en una sala oscura junto con el microscopio de fluorescencia.
 El flujo de trabajo
La estructura parcelada del laboratorio de biología molecular en salas no es condición suficiente para
garantizar el objetivo de que los resultados de las PCR sean fiables. Es necesario que el personal técnico sea
consciente de la extremada facilidad con la que se puede producir la contaminación de las muestras problema
y por ello hay que tener muy presente el flujo de trabajo.

El flujo de trabajo marca el sentido único de los procesos en el circuito de trabajo

En el laboratorio de biología molecular, el flujo de trabajo y de las muestras debe ser siempre unidireccional,
desde las áreas limpias hacia las sucias, en el sentido único hacia delante:

pre-PCR PCR post-PCR.

Este flujo implica y pone de manifiesto la necesidad de que cada área de trabajo sea autónoma en el
sentido de que debe disponer de su propia infraestructura básica (cabinas, centrifugas, baños, neveras, etc.)
y del material de trabajo, pues no es posible el intercambio entre las distintas salas.

El material de trabajo son las micropipetas automáticas, los equipos de protección individual (guantes,
batas desechables, gafas de protección, etc.) o el material fungible (tubos, Eppendorf, gradillas, pipetas
desechables, puntas de pipeta, rotuladores, etc.) y, por supuesto, se debe evitar el retorno de cualquiera de
ellos de las áreas «sucias» a las áreas «limpias»
 La contaminación de las muestras
En este contexto el termino contaminación hay que entenderlo como la
introducción accidental en la muestra de material exógeno que altera su pureza

• Esta contaminación causa resultados erróneos o no interpretables. Los dos tipos

de contaminantes mas peligrosos son

1. Los ácidos nucleicos

2. Las enzimas no deseadas que degradan ácidos nucleicos

• Las fuentes de contaminación puedes muy variadas:

1. Contaminación cruzada
2. Contaminación por productos amplificados
3. Contaminación de los reactivos comerciales y del material fungible
 Fuentes de contaminación
• Contaminación cruzada: puede ser material no amplificado del medio ambiente o
microorganismos ambientales, contaminantes procedentes del propio personal
técnico del laboratorio como pueden ser células de descamación de la piel o
contaminantes que se acumulan en la superficie de trabajo

• Contaminación por productos amplificados: generados mediante PCR en el propio

laboratorio

• Contaminación de los reactivos comerciales y del material fungible: la mayoría de

los fabricantes garantizan la esterilidad de los productos fabricados, el termino
esterilidad significa la ausencia de microorganismos pero no garantizan la
eliminación de ADN ni la inactivación de las enzimas
 Técnica aséptica
La contaminación de reactivos y material fungible por nucleasas se puede evitar utilizando solo aquellos que estén certificados como
libres de nucleasas. La posible contaminación por ADN no se puede controlar, por lo que es importante llevar un control exhaustivo de
los reactivos (lotes, fechas de apertura, fechas de caducidad, alicuotación) y realizar controles negativos. en todas las técnicas.

En los laboratorios de biología molecular el concepto de técnica aséptica se entiende como el

conjunto de actividades encaminadas a prevenir la contaminación por microorganismos, ácidos
nucleicos y nucleasas.

• Lavado de manos. El lavado frecuente de manos es la norma de higiene básica cuando se manipulan muestras biológicas y
reactivos químicos, independientemente de que se usen guantes.

• Uso de equipos de protección individual (EPI). Los principales equipos de protección individual son guantes sin talco y batas.
El uso de guantes debe compaginarse con prácticas de trabajo que impidan su contaminación con las muestras manipuladas
Así, por ejemplo, los tubos Eppendorf con mues tras y reactivos deben centrifugarse brevemente antes de ser abiertos. En
caso contrario podemos estar expuestos a microgotas retenidas en la cara interna de la tapa, contaminando guantes y
superficies.

• Descontaminación de superficies. Es muy importante la limpieza y descontaminación de las superficies de trabajo de igual
forma que los instrumentos, se pueden realizar por métodos físicos, como puede ser la irradiación con luz UV o por
métodos químicos como el lavado con soluciones químicas. Entre las más importantes destaca el hipoclorito sódico al 10%
ya que es capaz de eliminar resto de ADN y enzimas

• Cabinas de bioseguridad: Son las denominadas campanas de flujo laminar que mediante una corriente de aire horizontal o
vertical y un filtro son capaces de evitar la contaminación de la muestra y de la persona que la manipula
 Técnica aséptica
• Puntas de micropipeta especiales. Evitan la contaminación de las pipetas automáticas por aerosoles
producidos al aspirar los fluidos. Estas puntas de pipeta pueden ser de dos tipos:

- De desplazamiento positivo: tienen en su interior un émbolo o pistón que las convierte en auténticas
microjeríngas. Las pipetas que las utilizan tienen un vástago que encaja en el émbolo, el cual sube y baja
en el interior de la punta succionando y expulsando el fluido, sin que este toque en ningún momento el
cuerpo de la pipeta ni se produzcan aerosoles

- Puntas con filtro: son las más utilizadas. Tienen un filtro en su interior que impide que los posibles
aerosoles alcancen el cuerpo de la pipeta.
 Técnica aséptica
El uso eficiente de los recursos deberla contemplar los siguientes puntos mínimos:

• Equipamiento e infraestructuras: Se debe contar con un plan de mantenimiento (diario, semanal,

mensual, etc.) y de revisiones técnicas periódicas. El mantenimiento debe incluir las calibraciones, si se
requieren y la limpieza de los equipos.

• Reactivos: Hay que asegurar la asepsia de los reactivos, desde su recepción hasta su consumo o
eliminación por caducidad. Esto implica registros de entrada, control de lotes y caducidades y
almacenamiento correcto.

• Recursos humanos: Todo el personal de nueva incorporación debe recibir el adiestramiento adecuado a
las funciones que vaya a desempeñar, tanto en materia de seguridad como gestión de residuos. Se debe
diseñar también un plan de formación continuada para adecuar los conocimientos del personal de
laboratorio a la rápida evolución que están experimentando las tecnologías y procedimientos utilizados en
biología molecular.

• Técnicas: Todos los procedimientos técnicos deben estandarizarse mediante procedimientos normalizados
de trabajo que incluyan todos los aspectos de la técnica, desde la recepción de la muestra hasta su
eliminación

• Gestión medioambiental: El laboratorio deberia contar con buenas prácticas para intentar reducir el
consumo de agua, electricidad y papel y garantizar el correcto reciclado de los residuos
 La seguridad en el laboratorio
La seguridad en los laboratorios de biología molecular, citogenética y cultivos celulares hace
referencia a la prevención de la exposición del personal a agentes nocivos y también a impedir la
liberación de estos al exterior.

En función de la naturaleza de estos agentes, la seguridad puede ser:

• Biológica o bioseguridad: Trata de la prevención ante agentes patógenos y toxinas.

• Química: Para la prevención en lo referente a la exposición a agentes químicos.

Bioseguridad

• La bioseguridad de un laboratorio engloba todas normas, técnicas, prácticas y hábitos de que

intentan evitar la exposición accidental (no intencionada) del personal a agentes biológicos
potencialmente peligrosos (patógenos y toxinas) o su liberación al medio ambiente.

• En el Real Decreto 178/2004, de 30 de enero, se aprueba el Reglamento General para

el diseño de los laboratorios según el riesgo para la salud humana y medioambiental:

• Tipo 1: Riesgo nulo o insignificante

• Tipo 2: Riesgo bajo.
• Tipo 3: Riesgo moderado
• Tipo 4: Riesgo alto
 La seguridad en el laboratorio
Seguridad Química
El RD 363/1995 de 10 de Marzo, aprueba el reglamente sobre la notificación de
sustancias nuevas y clasificación, envasado y etiquetado de sustancias peligrosas y
establece una escala de hasta 15 tipos de sustancias peligrosas según sus
características. Los más importantes son:

• Inflamables
• Tóxicos o muy tóxicos
• Carcinógenos
• Mutágenos
• teratógenos
 El manual de seguridad
El manual de seguridad es un documento de obligado
conocimiento de todo el personal del laboratorio

Debe contener la siguiente información:

• Evaluación de los riesgos inherentes a cada puesto

de trabajo en el laboratorio
• Descripción y normas de utilización del
equipamiento de seguridad del laboratorio
(cabinas
• de bioseguridad, cabinas de aspiración de gases,
EPI, etc.).
• Hábitos de trabajo apropiado para minimizar los
riesgos de exposición
• Normas de almacenamiento de productos
químicos.
• Normas para a eliminación de desechos y gestión
de residuos, incluyendo los derrames
• Normas de actuación en casos de emergencias,
accidentes biológicos y accidentes químicos