11 CELULAS CITOTOXICAS Y MECANISMOS DE CITOTOXICIDAD Julio César Bueno, Angela P. Cadavid Universidad de Antioquia Abreviaturas usadas en este capitulo ADCC: Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos APAF: Factor 1 activador de proteasas apoptéticas CAD: —_Deoxirribonucleasa activada por caspasas CMH: Complejo mayor de histocompati- bilidad Citomegalovirus Dominios de unién a carbohidratos dependientes de calcio. CSF: Factor estimulador de colonias CTL: _Linfocitos T citot6xicos FADD: Dominio proteico de muerte asocia- doaFAs GM-CSF:Factor estimulador de colonias de granulocitos y monocitos ICAM: Molécula de adhesin intercelular IFN: Interferon IL: Interleuquina 219 ITIM: kD: KIR: LAK: LFA: LIF: LRC: NFKB: NK: Motivo de inhibicién del inmunorre- ceptor via tirosina Kilo dalton Receptores de oélulas NK similares ainmunoglobulina Células asesinas activadas por Jinfoquinas Antigeno asociado a la funcién leucocitaria Factor inhibidor de leucemias Conjunto de receptores de leucocitos Factor nuclear de kappa B Asesinas naturales Pre-CTL: Linfocito T precitolitico TAP: ‘GE: TNF: TNER: SHP: Proteina trasportadora de péptidos Factor transformante del crecimiento Factor de necrosis tumoral Receptor del factor de necrosis tumoral Fosfatasa de dominios SHINTRODUCCION Las infecciones pro- ducidas por virus lo mismo que las de- sencadenadas por bacterias y pardsitos intracelulares no pueden ser controla- das adecuadamente por las moléculas efectoras de la inmu- nidad humoral ya que éstas no tienen acceso al interior de las células; ademés, estos patdgenos pue- den evadir diferentes aspectos de la res- puesta inmune y proliferar en el inte- rior de las células fa- ‘gociticas. Por lo tan- to, se requieren me- canismos efectores adicionales que per- mitan la eliminacion de las células infec- tadas y es aqui don- de entra a participar la citotoxicidad depen- diente del contacto entre células. De igual for- ma, durante la respuesta inmune contra célu- las tumorales y durante el rechazo de injertos alogénicos participa este mecanismo de cito- toxicidad. Célula Blanco En este capitulo se presentarén los aspectos més importantes acerca de la estructura y fun- cién de las células citot6xicas, los mecanismos que utilizan para eliminar a las células blanco y se haré mencién acerca de algunos modelos en los que estas células tienen una participa- én importante. Célula NK Célula NK 220 Célula Blanco: Célula Blanco Figura 1. Reconocimiento del antigeno por las células citotéxicas e interacci6n con la célula blanco. 4) Los CTL, a través del complejo TCR-CD3, reconocen el péptido especifico unido a la molécula del CMH-I en la célula blanco; esta unién es estabilizada por el CD8 y otras moléculas coestimuladoras como el CD2 y el LFA-1 que se unen a sus ligandos LFA-3 ¢ ICAM-I en la célula blanco. b) Las células NK, por medio de receptores todavia no muy bien caracterizados, reconocen moléculas en células blanco que no expresan el CMH-l, iniciando su actividad citotdxica. ©) Cuando las células blanco expresan el CMH-l, éste es reconocido por el receptor KIR y se inhibe la via de seftalizacién dependiente de tirosina-quinasas por la activacién de fosfatasas como la SHP-1. CELULAS CITOTOXICAS Las principales células citot6xicas del sistema inmune son los CTL y las células NK. La fun- cién de estas células es complementaria en la defensa contra las infecciones porque mien- tras los CTL lisan células que presentan el pép- tido especifico en el contexto del CMH clase I, las células NK reconocen células que no expre- san el CMH-I, de tal suerte que células tumora- les o aquellas que tienen alterado este comple- jo, como consecuencia de una infecci6n viral, pueden ser lisadas por las células NK. Esto implica que cuando las células NK reconocenel CMH-I especifico en las células blanco se bloquea su maquinaria citot6xica (Figura 1). Tanto los CTL como las células NK tienen me- canismos efectores comunes: exocitosis de los granulos y la via mediada por FAS que llevan finalmente a la apoptosis de la célula blanco. Otro mecanismo efector de estas células es la produccién de citoquinas como el TNF y el IFN- y que tienen acci6n citot6xica cuando son secretadas en la vecindad de las células blanco. Linfocitos T citotéxicos: linfocitos efectores de la inmunidad adaptativa Los CTL son células efectoras que juegan un papel preponderante en la respuesta contra células infectadas con virus u otros patogenos intracelulares, en la eliminacién de células tumorales y en el rechazo de injertos. La ma- yoria de los CTL expresan la molécula CD8 y especificamente reconocen péptidos derivados de antigenos degradados en el citoplasma y luego expresados en la superficie celular aso- ciados con moléculas del CMH-I propias. Sin embargo, un 10% de las células citot6xicas son CD4+ y reconocen péptidos asociados con molécuias del CMH clase-Il. Cuando se men- cione en este capitulo los CTL nos referiremos a los CTL-CD8+, a menos que se especifique que son CTL-CD4+. La respuesta citot6xica de las células T requie- re un primer paso de activaci6n y diferencia- cién de los pre-CTL en CTL funcionales, y un segundo paso que incluye el reconocimiento del antigeno en la célula blanco, la unin con éstay el inicio de una serie de eventos que lle- van a la destruccién de dicha célula. Los pre-CTL se encuentran en baja frecuencia en sangre periférica y tejidos linfoides perifé- ricos; cuando salen del timo no estan completa- mente diferenciados y aunque tienen especifi- 221 Inmunologia: Una ciencia activa cidad para un antigeno determinado son fun- cionalmente inmaduros. Para la generacién de CTL completamente funcionales se requieren al menos dos sefales: 1) el reconocimiento del antigeno especifico en la célula blanco unido al CMH-Iy 2) una segunda sefial, que depen- diendo de la naturaleza de la célula que esté expresando el antigeno, puede ser lainteraccién de las moléculas coestimuladoras CD28/B7 si es una célula presentadora de antigeno profe- sional o citoquinas provenientes de los linfoci- tos Tayudadores si es otra célula del organismo. Los CTL funcionales se unen a la célula blan- co por la interaccién del TCR con la molécula del CMH-I que contiene el péptido especifico, esta unin es estabilizada por el CD8y por otras, moléculas coestimuladoras como CD2 y LFA- ‘I que se unen a sus ligandos en la célula blan- co LFA-3 e ICAM-1, respectivamente. Después que se forma el complejo de la célula efectora con la célula blanco, se activan los mecanis- ‘mos Iiticos que se explicaran més adelante en este capitulo. Células Asesinas Naturales: linfocitos efectores de la inmunidad innata En la década de los afios 70 se describié una poblacién de linfocitos que, de manera similar a las células T citot6xicas, tenia la capacidad de lisar tumores pero, a diferencia de éstas, no requerfan de una sensibilizacién o una estimu- lacién previa, fenémeno que se denominé reac- tividad citotoxica natural. Su nombre actual, células NK, fue acufiado en 1977 y en su carac- terizaciOn se encontré que presentaban mar- cadores de la linea linfocitaria como el Thy-1; por esto, se consideré que tanto las células NK como los linfocitos T provenfan de un precur- sor comin. En las décadas de los 80 y los 90 se identificaron otras células blanco sensibles a la accién citotéxica de las células NK, como lascélulas alogénicas las células infectadas por pat6genos intracelulares, lo que llevé a postu- Jar su participacin en el contexto de la inmu- nidad innata durante los estadios iniciales de lasinfecciones por Leishmania, Trypanosoma cru- ziy alos virus de la familia herpesviridae en- tre otros. En los humanos, la tipificacién de las células NK se inicié en los afios 80’s con base en la capacidad citotéxica natural descrita para el modelo murino y en una morfologia particu lar de linfocitos granulares grandes. En esta morfologfa se describfan abundantes granulos azur6filos en el citoplasma, micleo en forma de rinén y un diémetro que oscilaba entre los 12y 15 wim, Estas células se caracterizan mor- fol6gicamente por la presencia de lisozimas, granzimas y perforinas en los grénulos azuré- filos intracitoplasméticos, los cuales son libera- das al entrar en contacto con la célula blanco. Si bien en su ontogenia provienen de un pre- cursor comin con las células By T (cuyo mar- cador es el CD45), se ha demostrado que tanto en los ratones atimicos como en los ratones que no expresan el gen rag-1 (los que a su vez son deficientes de linfocitos B y 7) la presencia de las células NK no se encuentra afectada. Células NK y linfocitos T citotéxicos: la delgada linea roja Ha sido dificil definir un marcador especifico de las células NK, pues muchas de las molécu- las expresadas en estas células también se en- cuentran en los linfocitos T; por eso, para su definicién se tiene en cuenta la ausencia del receptor dela célulaT, TCR, aunado a la carac- teristica que se describi6 inicialmente de reac- tividad citotéxica natural. Aunque en un prin- cipio se plante6 que las células NK no expresa- ban el complejo proteico del CD3 propio de los linfocitos T, mas adelante se encontré que 222 expresaban la cadena ¢ del CD3 en la mem- brana, haciendo aun més dificil la caracteriza- ci6n particular de los dos tipos de linfocitos. En el humano, entre 20 y 40% de las células NK provenientes de sangre periférica expre- san el marcador CD8 de los linfocitos T citot6- xicos. Este marcador esta constituido por las cadenas « y fen los linfocitos T mientras que las células NK s6lo expresan las cadenas «.. Por esto, la delimitacién de ambas poblaciones ha sido principalmente funcional, pues mientras los linfocitos T citot6xicos necesitan de la ex- presion de moléculas del CMH en las células blanco para que se hagan efectivos los meca- nismos citot6xicos, las células NK son depen- dientes del reconocimiento de las moléculas del CMH4I para regular negativamente su ac- tividad citotéxica. Ademés, para las células NK noes indispensable la diferenciacién timicaco- mo si sucede con los linfocitos T: en ratones atimicos por ejemplo, cuya citotoxicidad de- pendiente de linfocitos T es minima, los por- centajes de citotoxicidad endégena (o natural) son similares a los encontrados en los ratones inmunocompetentes. Estos antecedentes sus- tentan lanecesidad, atin vigente, de una carac- terizacion molecular més precisa de las células. NK, particularmente en funcién de su activi- dad citotéxica endégena y del reconocimiento de potenciales células blanco. Marcadores de las células NK Para la caracterizacién de las células NK hu- ‘manas se ha usado la coexpresién de los mar- cadores CD56 (molécula de adhesin celular neural 1) y el CD16 (FcyRII), ambos marcado- res distintivos de estas células con respecto a los demés linfocitos. De acuerdo a la intensi- dad de fluorescencia y a la expresi6n de estos marcadores se encuentran dos tipos de célu- las NK: CD56** (fluorescencia moderada) CD16+, correspondiente al 90% del total delas células NK existentes en sangre periférica y CD56" (fluorescencia intensa) CD16-, que constituyen el 10% restante. La expresién del CDi6en las células NK tiene importancia pues éste es un receptor para la IgG, por el cual las células NK pueden reconocer y lisar otras cé- lulas que tienen anticuerpos unidos a sus mem- branas. Localizacién de las células NK Las células NK son abundantes en ciertas mu- cosas y en el intersticio de los capilares pul- monajes, mientras que su ndimero es més re- ducido en los nédulos linféticos; también han sido identificadas en el tracto gastrointestinal, en el higado, en el bazo y en sangre periférica en donde corresponden a un 5-15% de los lin- focitos circulantes (frecuencia similar a la del azo). Existen precursores de las células NK en médula sea y en el timo pero estén précti- camente ausentes en los vasos linfaticos y en los ganglios. En el higado hay predominio par- ticular de una subpoblacién de linfocitos, las células NKT, la cual presenta una maquinaria itolitica comin a las células NK y a los linfo- citos T (como son los grénulos que contienen perforinaso granzimas), pero que ademés pue- den reconocer la molécula presentadora de antigenos no clésica CD1d. Se ha postulado (que las células NKT participan, al igual que las células NK, en el contexto de la inmunidad innata para el control de las infecciones virales, en la capacidad antitumoral y en la activacion de otros mecanismos efectores mediante la pro- ducci6n de citoquinas como el IFN-y. El sitio que caracteristicamente tiene una alta concen- tracién de células NK es la decidua materna; esta subpoblacién es mayoritaria respecto a otras células provenientes del sistema inmu- ne, posiblemente por la accién de factores qui- miotdcticos de origen placentario 0 endome- trial que inducen el reclutamiento de células NK hacia este tejido. 223 Inmunologia: Una ciencia activa Funciones citotéxicas de las células NK Las eélulas NK fueron reconocidas en un prin- cipio como leucocitos que hacian parte de la inmunidad innata, es decir, que tan sélo lisaban las células blanco sin ninguna especificidad. Se pensaba entonces que su capacidad citolitica era independiente del reconocimiento en el contexto del CMH y por lo tanto, su accin, estaba dirigida en contra de miltiples células blanco, entre éstas las de origen tumoral y aque- llas infectadas por virus. Se conocfa también que la citotoxidad de estas células era depen- diente de anticuerpos gracias a la expresién en su superficie de receptores para la fraccién Fe de la IgG, lo que permite a su vez el reconoci- miento de anticuerpos adheridos a las células blanco. Este tipo de citotoxicidad que se cono- ce como ADCC se ha observado sélo en las células NK, més no en los linfocitos T citot6xi- cos. En modelos de experimentacién in vitro se caracteriz6 otro mecanismo de citotoxicidad llamado lisis redirigida, mediante el cual se re- conocen células blanco tumorales de origen linfoide, que también expresan receptores para la fraccién Fe. Al unirse los anticuerpos a la célula blanco por el Fe, el Fab de los mismos reconoce un ligando aun no bien caracteriza- do que se expresa en las oélulas NK y activa los mecanismos de citotoxicidad (Figura 2). Como no todos los blancos posibles de las cé- lulas NK inducfan la activacin de la respues- ta citotéxica se comenz6 a reconsiderar el con- cepto de lisis inespecifica inherente a estos focitos. La actividad citot6xica y la interaccién con las diferentes células blanco son elemen- tos centrales de la hipotesis del reconocimien- to de ausencia de lo propio, «missing self», pro- puesta por Klass Karre en 1981. Karre sustent6 que la citotoxicidad de las células NK era regu- lada negativamente por la expresién de molé- culas propias en las células blanco sensibles, y més adelante, este evento se correlacioné conladisminuciénenlaex- A. presin de las molécu- Jas del CM-I en las I neas tumorales suscep- tibles a la lisis y la resis tencia hibrida en los modelos murinos de Célula Blanco tumoral 0 infectada con virus B. Célula Blanco tumoral asociada al sistema inmune transplantes de médula 6sea. Mailtiples experi- mentos demostraron que las moléculas del (CMH-I inhibjan la lisis de las células NK y c6- mo estas células reco nocian la ausencia de lo propio: cuando una clona de células NK es- timulada con IL-2 en- traba en contacto con células de la linea 721.221, las cuales no y Lisis I a) FL FeyRit Célula NK (+) ‘Activacion ‘Ag de superficie Fe FoyRIll isis Molécula de superficie Célula NK (+) ‘Activacion Figura 2. Otros Mecanismos citotdxicos de las células NK. ADCC: los antigenos de superficie presentes en las células blanco son reconocidos por anticuerpos del tipo IgG1. Mediante la unién del expresan moléculas del receptor FeyRll ala fraci6n crstalizable de la IgG se activan los CMHLL se observaba—imecanismos de citotoxidad de las células NK dependientes de sefiales un porcentaje mayor de intracelulares en las que participan proteinas tirosina quinasas. citotoxicidad endogena. 4) TL jsis redirigida: Si las células blanco provienen de tumores asociados Sinembargo, sise trans- 4g] sistema inmune, éstas pueden expresar receptores del tipo FcyRIII y unir ferian genes de molécu- nmunoglobulinas por la fraccién cristalizable. El Fab de estos anticuerpos las del CMH-I a estas es capaz de reconocer moléculas de la superficie de las células NK e iniciar células susceptibles la lisis se inhibja. De otro lado, si se bloquea la interacci6n de las células blanco con un anticuerpo monoclonal que re- conoce las moléculas del CME-I, la actividad litica de las células NK se recupera casi a los niveles normales (Figura 1) Para explicar la resistencia hibrida en los trans- plantes, Karre demostré que, al transplantar cé- lulas de linfoma o cétulas de medula dsea que expresaban la molécula del CMH-I H-2* de un raton donante a un ratén receptor que expresa- ba los alelos H-2**, se inducia finalmente un re- chazo ya que estos injertos no expresaban al menos uno de os alelos del receptor. De este Ia actividad citotéxica. modo, la hipétesis “missing self” postula que una expresin reducida de productos del CMH-I permitiria el rechazo a aloinjertos mediado por las células NK, y a la inversa, un aumento en la expresi6n de estas moléculas en la superficie de las células blanco (como lo inducen el IFN-y y factores estimulantes de colonias como la IL-3) bloquearian estos mecanismos de lisis. Mecanismos moleculares de regulacién citotéxica en las células NK En la Giltima década se han caracterizado dife- rentes receptores para las moléculas del CMH- 224L expresados por las oélulas NK, entre los que se encuentran: a) los receptores de la familia de las inmunoglobulinas, llamados receptores KIR, algunos de ellos con funcién de inhibi- ci6n y otros con funcién activadora y b) los receptores tipo lectina. La unién a los KIR inhibidores induce una serie de sefales nega- tivas que inhiben la actividad citotéxica de las células NK; se ha demostrado que muchas de las moléculas del CMH-I tienen afinidad por estos receptores. De otro lado, los receptores tipo lectina son dependientes de calcio y algu- nos como el NKRPI son capaces de iniciar cas- cadas de sefalizacién que inducen la actividad citotéxica. Debido a que estos receptores son codificados por genes que se expresan prima- riamente en las células NK, esta region genética ha sido denominada complejo NK, cuyos genes presentan un 70% de homologia entre siy se encuentra en el cromosoma 12 de los humanos y en el cromosoma 6 de los roedo- res. El complejo genético NK incluye los re- ceptores tipo lectina Ly-49 en roedores, el NKRPI1 en roedores y en humanos, el NKG2 en humanos y ratas y el CD94 en humanos. De los receptores tipo lectina, el NKRPI se ex- presa como un homodimero que une aziica- res, principalmente ricos en manosa. Se iden- tificaron inicialmente en las células NK de rata yluego en el rat6na partir de genes homélogos correspondientes al marcador NK1.1 (NKRP1C). Estos receptores se han descrito en las células NK y en una subpoblacién de linfo- citos T y su activaci6n inicia la cascada de se- Aalizacién del inositol trifosfato y la subsecuen- te movilizacién de iones de calcio. En el ratén, se han caracterizado dos funciones importan- tes para los receptores tipo lectina: la primera es que pueden inducir la mayoria de las sefia- les efectivas para la produccién del IFN-y en células NK activadas con IL-2, y la segunda es que al parecer estan involucrados en la regu- laci6n de la proliferacién de las células NK. 225 Inmunologia: Una ciencia activa La familia de receptores Ly-49 consiste por lo menos de 9 moléculas estructuralmente rela- cionadas en el ratén y 4 moléculas en la rata, de las cuales Ly-49A y Ly-49C se han caracteri- zado como receptores inhibitorios especificos en NK para moléculas del CMH-I, presentes solamente en los murinos. Los Ly-49 son pro- teinas transmembrana tipo Il que contienen dominios de uni6n a carbohidratos dependien- tes de calcio codificados por 3 exones y que comparten esta caracteristica con otros recep- tores de las células NK comoel CD94,el NKRP1 y el NKG2. Los andlisis cristalograficos del Ly- 49 muestran que estos receptores presentan dominios citoplasmicos, transmembrana, tallo (‘stalk’) y CRD y al parecer inhiben las fun- ciones efectoras de estos linfocitos mediante el reconocimiento de los carbohidratos presen- tes en las moléculas del CMH-I. La elimina- cin o el bloqueo de los carbohidratos de la célula blanco interrumpe la interaccién con las, moléculas del CMH-I, lo cual limita parcial- mente la inhibicién de la actividad citotéxica de las células NK. Las células NK humanas no expresan recep- tores Ly-49 pero funciones similares son me- diadas por receptores tipo KIR, los cuales no son codificados en el complejo genético NK del cromosoma 12p13 sino en el conjunto de LRC en el cromosoma 19. Ambos tipos de re- ceptores comparten la caracterfstica de pre- sentar motivos ITIM, a los cuales se asocia la tirosina fosfatasa citoplésmica SHP-1, lo cual se asocia con la inhibicién de las acciones efectoras de las células NK. Un anélisis del dominio intracitoplasmético muestra la se- cuencia de aminodcidos VxYxxV, un motivo ITIM putativo para la unién de SHP-1 y 2, las cuales pertenecen a la familia de las protei- nas tirosina fosfatasas citoplasméticas, las cua- les pueden desactivar muchas de las protei- nas fosforiladas que participan en las casca- das de sefializacién.De otro lado, un fenémeno importante para las células NK es el hecho que los receptores tipo lectina como el CD94 formen heterodime- ros con moléculas NKG2, pues en los huma- nos el receptor CD94 carece de residuos carga~ dos negativamente en su dominio transmem- branal y presenta una cola intracitoplasmética corta, sin dominios identificables. Al parecer es necesaria la formaci6n del complejo CD94/ NKG2en la membrana plasmatica. Los recep- tores humanos NKG2a y la variante generada por el procesamiento alternativo del RNAm, el NKG2B, presenta dominios tipo ITIM que indican su funcién inhibitoria, mientras que los NKG2C y E no presentan ITIM lo que per- mite pensar que participan en la activacién de las células NK. De esta manera, se ha eviden- ciado que las colas intracitoplasmaticas de los receptores NKG2A y B inhiben la funcién citot6xica de las células NK por medio del re- clutamiento de la fosfatasa SHP-1, mientras que el receptor NKG2C se asocia con la proteina adaptadora DAP-12 para inducir las cascadas de sefializacién intracelular dependientes de proteinas tirosina quinasas. El heterodimero CD94/NKG2 sélo reconoce una molécula del CMH-I no clésica llamada HLA-E, la cual es codificada por un alelo de polimorfismo limitado si se compara con otros alelos de las moléculas CMH-I clésicas tipo A, BoC. Los transcriptos del HLA-E se expresan enuna variedad de células humanas, pero para su expresi6n en la membrana plasmética re- quieren de la unién a un péptido, el cual se deriva de secuencias lider selectas provenien- tes de moléculas del CMH clasicas y no clési- cas. Como se vera mas adelante, la induccién de este tipo de regulacién de las células NK por parte de algunos virus se constituye en un mecanismo de evasion de la respuesta citot6- xica contra los pat6genos intracelulares y en otros contextos un elemento constitutivo de la tole- rancia inmunol6gica. Si bien los receptores NKG2 226 presentan patrones de reconocimiento similares enroedores y en humanos, los papeles fisiol6gi- cos de éstos en la biologia de las células NK son atin inciertos, por lo que se ha especulado que hacen parte de un sistema redundante de recep- tores para el reconocimiento de lo propio/no- propio fuera de los ya reconocidos Ly-49 en los murinos y los KIR en los humanos. Ellocus genético de las moléculas KIR presen- ta una gran diversidad, lo cual se debe a un polimorfismo tanto poligénico como multialé- lico. Se han identificado cerca de 14 genes KIR que se expresan en células inmunes, los cuales se clasifican de acuerdo al néimero de domi- nios extracelulares tipo inmunoglobulina (2D © 3D) y a las caracteristicas de la cola citoplas- mitica. También se conocen segan la nomen- clatura del sistema CD como CD158a, CD158b, CD158¢, etc. Independiente del ntimero de dominios de inmunoglobulina que posean, los KIR tienen dominios intracitoplasméticos lar- g0s 0 cortos. Los KIR con dominios citoplasmé- ticos largos tienen la actividad inhibitoria gra- cias a los dominios ITIM presentes en sus do- minios citoplasmaticos; por su parte, los KIR de cola citoplasmética corta pueden transmi- tir sefales de activacién a las células gracias a la interaccién con la molécula adaptadora co- nocida como proteina asociada a receptores activadores de células asesinas (KARAP), la cual contiene dominios ITAM. Los LILR tienen dos © cuatro dominios extracelulares tipo inmuno- globulina y una cola intracitoplasmatica corta © larga. Las colas citoplasméticas largas con- tienen hasta cuatro dominios ITIM y por lo tanto pueden inhibir la actividad celular Producci6n e interaccién con citoquinas por las células NK Enel contexto de la inmunidad innata frente a las infecciones, las células NK tienen la capaci-dad de secretar citoquinas que promueven la respuesta citotdxica, la activacién de macré- fagos, linfocitos By la hematopoyesis. Con un estimulo adecuado producen grandes concen- traciones de TNF-a, IL-1, IFN-y y de los fac- tores estimulantes de colonias hematopoyéticos como la IL- 3, el CSF-1 y el GM-CSE En este sentido, se ha propuesto que estas células pu- dieran presentar diferentes patrones de secre- cién de citoquinas, algo semejante a lo descri to para los linfocitos Ty de acuerdo a esto clasi ficarlas como NK1 0 NK2. Las evidencias en- contradas sefialan que las células NK huma- nas cultivadas en presencia de IL-12 secretan principalmente TNF-c, IL-0, GM-CSF e IFN-y (patron NK1), mientras que aquellas cultivadas en medio suplementado con IL-4 secretan can- tidades mucho mayores de IL-5 e IL-13, niveles menores de IFN-y y concentraciones similares de TNF-«, GM-CSF e IL-10 (patron NK2). La IL-2 por su parte puede inducir la diferen- ciaci6n de las células NK a células LAK, al pa- recer con una actividad citot6xica independien- te de la regulacién mediada por moléculas del CME-Ly con una proliferacién celular signifi- cativa. El fenotipo de las células LAK se carac- teriza por su adherencia al pléstico, una acti- vidad citot6xica mayor que la observada en las células NK, un aumento en el tamano (15 um) y més cantidad de granulos intracito- plasméticos que contienen granzimas y perfo- rinas comparado con el de la célula precurso- ra, Sin embargo, la capacidad citot6xica de las células LAK murinas disminuye luego de 3 dias de cultivo bajo el estimulo de la IL-2 y se ha- cen manifiestos cambios morfoldgicos como el aumento del volumen celular e inclusiones in- tracitoplasmaticas de gliedgeno y gotas lipidi- cas. También, se ha descrito una disminucion del porcentaje de células en fase $ y una dis- minuci6n en su interacci6n con las células blan- co. Estos hallazgos morfolégicos son similares a los encontrados en los diferentes estadios de 227 Inmunologia: Una ciencia activa diferenciacién de las células NK uterinas, las cuales se encuentran bajo el influjo de la IL~ 15, una citoquina funcionalmente similar a la IL-2. La subpoblacién de células NK uterinas disminuye su capacidad citotéxica a medida que transcurre la gestaci6n; sin embargo, no se conoce si este efecto es debido a la accién continua de la IL-15 secretada en el microam- biente uterino (de manera anéloga alo que ocu- rre con las células LAK luego de varios dias de cultivo con IL-2) o si otros factores tisulares u hormonales median en esta diferenciacién fun- ional. Ademés, la subpoblacién de células NK CD56*/CD16, las cuales son los linfocitos predominantes en el endometrio humano, es considerada una fuente primaria de citoquinas inmunoreguladoras que participan en el con- texto de la inmunidad innata. La produccién de citoquinas por parte de esta subpoblacién es mayor si se compara con las células NK CD56"*/ CD16; las cuales presentan caracte- risticamente una mayor actividad citot6xica que la subpoblacién CD56™**, Estas eviden- cias permiten sugerir una redefinicién del ca- racter de las células NK como simples efectoras citoliticas: la capacidad de producir citoquinas puede considerarse igual de importante en el medio ambiente tisular participando, posible- mente, en diversos eventos fisiol6gicos. Efectos de la IL-15 sobre las células NK La IL-15 es una citoquina con una estructura proteica de hélices a que participa en la dife- renciacién, proliferacion y activacién de las células NK. El papel relevante de esta citoquii en la ontogenia de las células NK se evidencid en ratones “knock-out” para la cadenia y co- min del receptor de la IL-2, la cual es también compartida por el receptor de la IL-15. Ade- més de la cadena y comGn, ambos receptores expresan la subunidad f mientras que la sub- unidad a. es especifica para cada una de las, citoquinas; de este modo, la subunidad «de laIL-15 sumada a la By la del receptor de la IL- 2conformaria un receptor dealta afinidad para la IL-15. Al bloquear la accién de la IL-15 con un anticuerpo especifico contra la cadena a. del receptor se observa que ésta es necesaria para el proceso de diferenciacién de las célu- las NK a partir de precursores provenientes de médula 6sea. La IL-15 promueve entonces la di- ferenciaci6n de las células NK murinas a partir de timocitos y de células progenitoras big les NK/I, siendo 4 veces més potente que la IL-2 para la produccién de células NK funcionales. Laactivacién de las células NK por la IL-15 po- tencia también la proliferacién celular, la ci- totoxicidad endégena, la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos e induce la secre- cin de IFN-y, GM-CSF y TNF-a en sinergismo con la IL-12. El rango de expresién de la IL-15 es a su vez mayor que el de la IL-2, pues es producida por monocitos y por cé- lulas epiteliales, AGSBGMSE Late Cocaine? mactOfagos decidualesy células del amniocorién en ambientes tisulares como el del endometrio y la decidua. A su vez, la cadena a. del receptor de la IL-15 presenta una amplia distribucién en di- ferentes tipos celulares y la afinidad de unién encontrada para este receptor es 1000 veces ma- yor que la afinidad del IL-2Ro: a la IL-2. En au- sencia de suero, la IL~15 puede mantener la sobrevida de las células NK, evento que ha sido asociado con la prevencién de la muerte celular programada. Ademés de las funciones ya des- Gritas, se ha reportado la TL-15 como un factor quimiotéctico de las células NK aumentando su adhesin a las células endoteliales mediante el, receptor LFA-1, por lo que se ha implicado en el reclutamiento de estas oétulas hacia los tejidos. MECANISMOS DE CITOTOXICIDAD CELULAR La funci6n efectora de las células citot6xicas concluye con la destruccién de la célula blan- 228 co ya sea por apoptosis 0 por necrosis, siendo la primera de estas formas de muerte celular Ja més frecuente. La citotoxicidad de contacto mediada por linfocitos ocurre por dos meca- nismos independientes: la via perforina/gran- zima 0 exocitosis de los granulos y la via no secretoria iniciada por los receptores FADD. La mayoria de los CTL-CD8+ utilizan prefe- rencialmente la via de perforina/granzima para la lisis de la célula blanco, mientras que los CTL-CD4+ utilizan la via asociada a FAS para su funcién efectora. Algunas células utilizan otro mecanismo de citotoxicidad que no re- quiere el contacto de la célula efectora con la célula blanco y es la apoptosis inducida por citoquinas mediante la utilizacién de otro re- ceptor de muerte, el TNF-R1. Dada la importancia de la apoptosis como me- canismo de eliminacién de las células blanco, procederemos a presentar una breve explica- Gién de este proceso para entender con mas claridad las vias de citotoxicidad. Apoptosis La apoptosis o muerte celular “programada’” se puede definir como el conjunto de reaccio- nes bioquimicas que se desencadenan en res- puesta a determinados estimulos que condu- cena lamuerte en forma ordenada y “silencio- sa” de la célula. La apoptosis constituye un me- canismo fundamental para el mantenimiento de la homeostasis del organismo y participa en situaciones biol6gicas tan cruciales como el desarrollo embrionario para la remodelacién de los tejidos, por ejemplo, la eliminacién de estructuras como las membranas interdigitales en el feto, en el control de la sobreproducci6n, de células y en el control de células defectuo- sas; ademés, la apoptosis es importante en los, procesos de seleccién celular en el sistema ner- vioso y el sistema inmune. En este dltimo esresponsable, de la seleccién negativa de los lin- focitos en el timo. En condiciones de agresién como el céncer y las infecciones por gérmenes intracelulares, la apoptosis es un mecanismo porel cual se pueden eliminar las células tumo- rales o puede ser un mecanismo de defensa que limita la propagaci6n del virus. De otro lado, el exceso de apoptosis podria ser respon- sable de las manifestaciones asociadas a infec- ciones virales pues este es un mecanismo de patogénesis 0 de los defectos de algunas enfer- medades neurodegenerativas y enfermedades de la vejez, entre otras. Sin embargo, una dis- minuci6n de la respuesta apoptética también conduce a condiciones anormales como las enfermedades autoinmunes, pues la falta de apoptosis de linfocitos permite la generaci6n de clonas autorreactivas. Los eventos apoptéticos incluyen: alteraciones de la membrana plasmatica apareciendo el ca- racteristico “blebbing” (evaginaciones esféricas surgidas a partir dela membrana que le confie- rena la célula un aspecto “hirviente” al inicio del proceso y en forma de “palomitas de maiz” en los uiltimos estadios), pérdida de la asime- tria de los fosfolfpidos de membrana con expo- sicién de la fosfatidilserina, alteracin del cito- esqueleto con encogimiento celular, desensam- ble de las células en vesfculas rodeadas de mem- brana (cuerpos apoptéticos), condensacién de la cromatina y fragmentacién del DNA en sub- unidades regulares que resultan del corte al azar de los nucleosomas. In vivo, los cuerpos apoptoticos son encerrados por las células ve- ‘cinas 0 fagocitados por los macr6fagos para evi- tar la liberaci6n del contenido intracelular y la consecuente respuesta inflamatoria, hecho que sf ocurre en la muerte por necrosis. Lamitocondria es una de las organelas que mas est implicada en la apoptosis. En ella, se pro- ducen una serie de cambios funcionales que no se relacionan con cambios morfolégicos ya 229 Inmunologia: Una ciencia activa que su estructura se mantiene intacta en casi todo el proceso. Entre las alteraciones que se producen en la mitocondria se pueden men- cionar: desacople en la cadena de electrones y detenci6n del metabolismo energético, produc- cién de especies reactivas de oxigeno, libera- ci6n de citocromo ¢, falla en el mantenimiento del potencial transmembrana y finalmente, for- maci6n de porosen la membrana mitocondrial. Vias apoptéticas Existen dos vias diferentes que son responsables de iniciar la muerte por apoptosis, una intrinse- ca alla célula y otra por sefiales extrinsecas. a) Via intrinseca: es iniciada por sefiales que provienen del interior de la célula y respon- dena situaciones que comprometen el buen funcionamiento de la célula en su entorno ‘como la pérdida de contacto con células ve- cinas, el estrés celular, el dafio del DNA y la falta de estimulos tréficos. En estos casos, la célula es potencialmente peligrosa para el or- ganismo y por lo tanto debe ser eliminada. El proceso de apoptosis inducido por esta via se inicia por la liberaci6n del citocromo ¢ de la mitocondria, el cual en conjunto con el Apaf, el trifosfato de deoxiadenosina y la procaspasa 9 conforman el apoptosoma que activa la caspasa 9, la cual a su vez activa ala caspasa 3. Otros factores apoptéticos que se liberan de la mitocondria son: el smac/dia- lo que bloquea la accién de las protefnas inactivadoras de la apoptosis y, el factor in- ductor de la apoptosis que, independiente de las caspasas, estimula directamente la apoptosis en el nticleo. b)Via extrinseca o apoptosis instructiva: esta via es iniciada por la unién de ligandos de muerte especificos a sus receptores de muerte situados en la membrana celular; seuna serie de interac- ciones proteina-pro- teina que terminan en laactivaci6n de la cas- cada de las caspasas. Procaspasa Las caspasas Son una familia de pro- teasas que son respon- sables del programa apoptético. Son cistefna proteasas con una espe- Gificidad muy estricta y cortan siempre en el aminoécido posterior al Acido aspartico, pero requieren el reconoci- miento de un tetrapép- tido con aminodcidos amino terminales en el sitio de corte, el cual es diferente para cada una de las caspasas, lo que explica su diversidad biol6gica; ademés, laes- tructura terciaria del sustrato influye en su reconocimiento. La estricta especificidad de las caspasas es determinante para que en la apoptosis no ocurra una digestin indiscri- minada de proteinas sino que un grupo se- lecto de ellas son cortadas en forma coordi- nada llevando a la pérdida o alteracién de la funci6n. En los mamiferos se han descrito 14 caspasas agrupadas en una familia, que tienen en comdn una estructura compuesta por un dominio N-terminal 0 prodominio y una regi6n catalitica constituida por un do- minio grande de 20 kDa y otro pequefio de 10 kDa que después de la activacién por pro- teolisis y la eliminacin del prodominio, for- marén el heterodimero que conforma la en- zima (Figura 3). 230 Kem Caspasa Activa Figura 3. Activacién de las caspasas. La procaspasa inactiva esté compuesta por un dominio N-terminal mv prodominio, una subunidad ca 10 kDa. Después de la activacién por proteolisis en dos sitios, se separan las tres subunidades y se forma un heterodimero por unién de la subunidad ‘grande y la pequeria por sus sitios activos. litica grande de 20kDa y una pequeria de Las caspasas que intervienen en la apoptosis se dividen en dos subgrupos, de acuerdo a la longitud de su prodominio, con funciones bien definidas: + Caspasas iniciadoras 0 con prodominio lar- go. Pertenecen a este grupo las procaspasas 8 10 que tienen en sus prodominios unas se- ‘cuencias repetitivas de interaccién proteina- proteina llamadas dominios efectores de muerte y las procaspasas 1, 2, 4, 5 y 9 que con- tienen dominios de reclutamiento de cas- pasas. Estos dominios permiten su recluta- miento hacia los receptores de muerte situa- dos en la membrana celular como el FAS y el TNER.+ Caspasas efectoras 0 con prodominio corto. Son activadas por alguna de las caspasas ini- Giadoras; al parecer, son las que acttian al fi- nal de la cascada haciendo protedlisis de las estructuras celulares. Pertenecen a este gru- po las caspasas 3, 6 y 7. Las principales acciones de las caspasas inclu- yen: a)Inactivacién proteolitica de proteinas que protegen las células de la apoptosis. Una de estas es la ICAD, una proteina que mantiene inhibida a CAD, nucleasa responsable de la degradacién del DNA en el proceso de apoptosis. Otras moléculas que protegen la célula de la apoptosis son algunos miembros anti-apoptéticos de la familia Bcl-2. Cuando las moléculas Bcl-2 son cortadas liberan frag- mentos que promueven la apoptosis, reali- zando as{ una retroalimentaci6n positiva de la acci6n de las caspasas. b)Desensamble de la estructura celular por de- gradacién de moléculas involucradas en la regulaci6n del citoesqueleto como son la gel- solina, la quinasa de adhesi6n focal y la qui- nasa 2 activada por p21. Ademés, las caspasas cortan las proteinas filamentosas que cons- tituyen la ldmina nuclear, ésta es una estruc- tura rigida que tapiza internamente la mem- brana nuclear; por lo tanto, el corte de estas proteinas produce colapso de la lamina y con- tribuye a la condensaci6n de la cromatina. )Degradacién de algunas proteinas relaciona- das con los procesos de replicacién, trans- cripcion y reparacién del DNA (como la DNA-PKC) y con el procesamiento del RNAm (como la U1-70K). Receptores de muerte Son receptores situados en la membrana de la célula que al unirse a ligandos de muerte acti- 231 Inmunologia: Una ciencia activa van las caspasas y con ello la cascada de apop- tosis. Estos receptores pertenecen a la superfa- milia del receptor del factor de necrosis tumo- ral que tienen en comin un dominio extracelu- lar rico en cisteina y una secuencia en el domi- nio intracitoplasmatico que le sirve para aco- plar este receptor con el resto de la maquina- tia apoptética. Entre los miiltiples receptores de muerte que se han caracterizado, se podrian mencionar como los més importantes: + FAS (CD95/Apol): Proteina presente en la superficie de algunas células como linfocitos B y linfocitos T activados, Iineas tumorales de origen linfoide y en hepatocitos. Su ligan- do fisioldgico es el FAS-L que se expresa pre- ferencialmente en células T y células NK ac- tivadas, y en los tejidos “inmunologicamente privilegiados” como el ojo y los testiculos, donde las células del sistema inmune activa- das son eliminadas por apoptosis con el fin de evitar una respuesta inflamatoria deletérea. TNERI: Este receptor se expresa en la ma- yoria de las células del organismo, su ligan- does el TNF y la interaccién de éstos enviaa la célula dos tipos de seftales diferentes. De un lado, se activan factores de transcripcién como NFKB que dan lugar a la inducci6n de genes de cardcter proinflamatorioe inmuno- modulador; de otro lado, induce una sefial de apoptosis la cual es restringida sélo a al- gunos tipos celulares. Vias de citotoxicidad de las células citotéxicas Via perforinalgranzima Esta via es importante en diferentes situacio- nes de relevancia biol6gica como el rechazo alo-génico, la muerte de células tumorales, la eli- minacién de algunos virus y en la homeostasis de los linfocitos. Tanto en los CTL-CD8+ acti- vados como en las células NK ocurre la exoci- tosis de los grénulos para inducir la muerte de las células blanco. En las células NK, los grénu- los son preformados pero su actividad se pue- de incrementar con estimulos como la IL-2 y el IFN-y; su respuesta es rapida después de la estimulaci6n de receptores de activacién, sin embargo ellas no proliferan significativamente con este estimulo. Por su parte, los pre-CTL re- quieren un proceso de activacién previa que puede durar de 1-3 dias; la activacién y prolife- raci6n de estas células requiere la inducci6n, es- timulada por el TCR de receptores de citoquinas como la IL-2y la IL-6, ya que estos factores indu- cen la expresi6n de los componentes de los gré- nulos. Los CTL pueden eliminar miiltiples célu- las blanco gracias a la reorientaci6n de sus gré- nulos a otra regi6n de contacto; por su parte, las células NK requieren organizar de nuevo su ma- quinaria litica en respuesta al estimulo con IL-2 antes de ser efectivas contra otros blancos. Cuando los CTL reciben sefiales especificas del TCR para su activacin y proliferacién, se dis- paran mecanismos transcripcionales que llevan a la sintesis de los grénulos y de las proteinas que los constituyen. En el transcurso de 1a 2 dias, los genes para perforina, granzima A, gran- zima B y otras granzimas tienen una alta activi- dad transcripcional y estas proteinas sintetiza- das de novo son luego transportadas y ensambla- das en los grénulos funcionales. Tanto las granzi- mas como las perforinas sufren modificaciones postranscripcionales para asumir una conforma- cién activa. Adicionalmente, las granzimas son también glicosiladas y seleccionadas por el re- ceptor de manose-6-fosfato en el aparato de Golgi en su camino hacia los grénulos especializados. Otros componentes de los granulos, ademas de las perforinas y las granzimas son: a) granu- 232 lisina, que ademas de su capacidad para indu- cir apoptosis y dao directo de la membrana, tiene una amplia actividad antimicrobiana con- tra bacterias intra y extracelulares; b) comple- jos de glicosaminoglicanos, particularmente el proteoglicano serglicina que puede servir como chaperona para la granzima B; c) calcireticulina, la cual inhibe el dafo de la cé- lula blanco mediado por perforina y pudiera actuar como una molécula reguladora. Después de la interaccién del linfocito efector con la célula blanco, los granulos que perma- necian en el citoplasma son répidamente orien- tados hacia el sitio de contacto, se fusionan con la membrana plasmética de la célula y secretan su contenido en la unién estrecha entre las dos células. La perforina, en presencia de calcio, se polimeriza y forma una estructura en for- ma de anillo que se inserta en la membrana de la célula blanco. Se ha propuesto también la existencia de receptores especificos de perforina en la célula blanco, pero este meca- nismo no se ha caracterizado (Figura 4). Durante mucho tiempo se acepté que la perforina formaba poros o canales en la célula blanco similares a los del complejo de ataque de membrana del complemento, los cuales lle- vaban por un lado, a la muerte dela célula blan- co por dafio en la membrana y alteracién ‘osmética y por otro actuaban como puerta de entrada para otras proteinas citotéxicas como la granzima B que inducia la muerte apoptética, Esta explicacién ha sido reconsiderada en los dltimos aftos porque se ha demostrado que el tamaiio de los canales creados por la perforina es pequefio, alrede- dor de 16 nm, lo cual no permite el ingreso de proteinas como las granzimas que tienen un peso molecular que oscila entre 30 y 65 kDa. La endocitosis reparativa, es un mecanismo alternativo que se ha planteado para explicar la entrada de las granzimas a la célula blanco:a rrmunotogia: Una ciencia activa la ubicacién de la perforina en lamem- brana de la célula blanco genera una sefial para reparar el dato, lo que permi- telaendocitosis dela perforina que esta in- crustada en la mem- brana plasmatica que la rodea; las granzi- mas que estén en la vecindad son tam- bién endocitadas y a partir de allf libera- das al citoplasma y transportadas al ni- cleo de 1a célula blanco donde indu- Célula Blanco cen apoptosis (Figu- ra4). Las granzimas pue- den ser internaliza- das también por en- docitosis mediada por receptor; se ha demostrado que el receptor de manosa- 6-fosfato une e inter- naliza granzima B, la Figura 4. Vias de entrada de perforinas y granzimas a la célula blanco. ‘) La perforina se polimeriza en presencia de calcio y se inserta en la ‘membrana de la célula blanco formando unos poros a través de los cuales podrian entrar las granzimas, (ésta es una versién inicial que ha sido revaluada); b) el dato que provoca la perforina en la membrana induce una respuesta de endocitosis reparativa a través de la cual entran las perforinas que estin incrustadas en la membrana y las granzimas que estan en la ‘vecindad; c) la granzima B, particularmente, puede entrar a la célula blanco a través de la unién al receptor de manosa-6-fosfato; después de ser internalizada se libera del endosoma por accién de diferentes agentes como perforinas, adenovirus o toxinas bacterianas, La granzima B induce la apoptosis por accién sobre diferentes sustratos en el citoplasma y el niicleo. cual es retenida en endosomas. Para su liberacién en el citoplas- ma, se requiere de un segundo agente como perforina, adenovirus o toxinas bacterianas (Figura 4). La granzima B libre tiene diferentes rutas de activaci6n de la apoptosis: a) activa directamente la caspasa 3 por corte de la procaspasa 3; b) inactiva ICAD para liberar la nucleasa CAD con la consecuente fragmenta- cin del DNA; c) estimula el BID (un miembro proapoptético de la familia Bcl-2) y la traslocacién de BID y BAX a la mitocondria induce la liberacién del citocromo c (Figura 5). 233 Via dependiente de receptores de muerte ligados a FAS Esta via se encuentra activa en todas las Iineas de células asesinas pero es més importante en las células CD4+ especialmente del fenotipo ThI. La activacién de esta via es mas lenta que la de exocitosis de los granulos, porque ain en células activadas existe muy poco FAS-L alma- cenado y se requiere su sintesis, lo cual puede tardar de 1-2 horas después de la estimulacién del TCR. Sin embargo, su eliminacién de la su-perficie también tarda de2a3horas lo que per- mite que estas células tengan actividad citot6- xica mas promiscua y puedan lisar otras célu- las vecinas que aunque no expresen el antigeno reconocido por el TCR (‘destruccién de células espectadoras”) si estén expresando el receptor FAS. La estimulaci6n del re- ceptor FAS en la célula blanco por el FAS-L en la célula efectora, lleva al reclutamiento de la procaspasa 8 por inter- accién con los dominios de muerte. La caspasa 8 tiene dos vias diferentes de iniciaci6n de la apop- tosis: a) activa directa- mente otras caspasas efectoras como la caspa- sa 3; b) activa a BID el cual, cuando esta inser- tado en la membrana mitocondrial con BAX, permite la liberaci6n de citocromo c. Este alti- ‘mo, activa la caspasa 9 por interaccién con el factor activador de la proteasa apoptotica, APAF- la caspasa 9 a su vez activa la caspasa 3. MODELOS DE RESPUESTA INMUNE MEDIADOS POR CELULAS NK Acontinuacién se presentan algunos ejemplos de la participacion de las células NK en la res- inmune contra infecciones intracelula- res en la fisiologia de la gestaci6n. Granzima B procaspasa 3 dando origen a la caspasa 3 acti nucleasa CAD responsable de la fragmentacién del DNA; activa a BID (factor proapoptotico de la familia BCL-2) y su traslocacién a la ‘mitocondria en conjunto con el factor BAX para formar un canal que permite la liberacién de citocromo c y la formacién del apoptosoma para aactivar la caspasa 9 y continuar el proceso con la activacion de la caspasa 3; la granzima B puede actuar directamente sobre la mitocondria induciendo despolarizacién de la membrana sin liberacién de citocromo c. 234 Figura 5. Mecanismos de acci6n de la granzima B. Después de que la granzima B es liberada en la célula blanco ejerce induce proteoisis de la inactiva el inhibidor de la Infeccién por Leishmania major: La infeccién cuténea con L. major en ratones, es un modelo experimental bien establecido de enfermedad cronica causada por un pat6geno intracelular. Eneste modelo de infeccién, la mayoria de las cepas de ratones desarrollan un patron polari- zado de repuesta inmune hacia el tipo Thl respuesta inmune celular, mientras que las ce- pas susceptibles a la infeccién, como los Balb/ ¢, activan una respuesta humoral o tipo Th2. ‘También se ha observado que los ratones sus- ceptibles presentan una diseminacién més répi- da de los pardsitos, mientras que en los resisten-tes éstos son retenidos en los nédulos linfétticos. Esta retenci6n, al parecer, est4 relacionada con la acci6n de las células NK como lo hacen evi- dente ratones susceptibles que al ser inyecta- dos con Poly(I-C), IFN-y 0 IL-12, inductores de la respuesta citotéxica, registran un aumen- to de los pardsitos en los nédulos linféticos y una disminuci6n en la diseminacién sistémica. De otro lado, laactividad citot6xica de las célu- las NK es mayor en los ratones resistentes cuando se exponen a los promastigotes de L. ‘major si se compara con los susceptibles; el re- clutamiento de estas células a los nédulos lin- faticos es mediado por quimoquinas como la proteina inducible por el IFN-y, IP-10. La prin- cipal fuente de IFN-y, en este modelo experi- mental, son las células NK, inducida princi- palmente por la accién directa e indirecta de la IL-12, producida por los macrofagos, e inhi- bida por citoquinas presentes en los ratones susceptibles como el TGE-B y la IL-10, lo que permite pensar que la resistencia a la infec- cin se deba a una activaci6n temprana de las células NK. Infeccién por Tripanosoma cruzi, Toxoplasma gondii o Plasmodium yoelii: El agente etiol6- gico de la enfermedad de Chagas, el Tripano- soma cruzi, induce la secrecion de IFN-y en cultivos de esplenocitos murinos luego de in- cubarlos con tripomastigotes vivos; esta pro- duccién disminuye significativamente si se utilizan anticuerpos anti NK1.1 para eliminar las células NK de estos cultivos. También se hha demostrado que ratones deficientes de cé- lulas NK 0 aquellos tratados con un anticuer- po monoclonal anti-IFN-y presentan un au- mento en la parasitemia y una disminuci6n de la tasa de sobrevida. En este modelo expe- rimental, es necesaria la infeccién con tripo- mastigotes vivos que estimulen significativa- mente la secreci6n de IFN-y pues los sonica- dos del pardsito no son capaces de mimetizar este efecto. 235 Inmunologia: Una ciencia activa En el modelo de infecci6n intracelular con To- xoplasma gondii, los estudios de neutralizacién del IFN-y in vivo sustentan que esta citoquina es esencial para la respuesta inmune contra el pardsito. Se ha visto en este modelo como la f integrina CD11b/CD18 o CR3, expresada en la membrana de las células NK y de otros linfocitos, es importante para la extravasacion de estas células a los sitios de la inflamacién por medio de su interaccién con moléculas de adhesién celular de la familia ICAM y su union a células blanco cubiertas con la protefna del complemento C3bi. Los ratones infectados con Toxoplasma gondii y tratados con un anticuer- po monoclonal anti-CR3 presentan un 25% menos de actividad inducida por las células NKy una reducci6n en la secreci6n de IFN-y a concentraciones casi indetectables. Por otra parte, en el modelo de infeccién de Plasmodium yoelii se ha visto que las células T CD8+ juegan un papel importante en Ja inmu- nidad adaptativa la cual es dependiente de la produccién de IFN-y y de la activacién de las células NK. Esto tiltimo, se evidencia luego de una inmunizaci6n con esporozoitos irradiados © vacunas de ADN especificas para el parési- to, en la cual la respuesta inmune inducida es dependiente de la IL-12 y del IFN-y, que a su vez requiere de células NK esindependiente de la accién de los linfocitos T CD4+. En estos tres modelos, se ha visto como la res- puesta inmune mediada por citoquinas es la base para el control de la infecci6n, siendo pri- mordial la activacién temprana de las células NK y su produccién de IFN-y. Infecci6n por citomegalovirus. El CMV es un. virus herpes del género B que infecta a la ma- yoria de las poblaciones humanas y cuya infec- Gién es persistente a lo largo del tiempo. Este virus presenta mecanismos diferentes para eva- dir el sistema inmune del hospedero. En pri-mer lugar, reduce la expresién del CMH-1 en la célula del hospedero ya que bloquea el péptido transportador asociado con el proce- samiento del antigeno (TAP-1), lo cual retiene elCMH-len el reticulo endoplasmico. Con ello el CMV es capaz de evadir la respuesta inmu- ne dependiente de linfocitos CD8+ pero, de acuerdo a lo anteriormente descrito, las célu- las infectadas pueden llegar a ser mas sensi- bles a la actividad citot6xica de las células NK. Se ha descrito, sin embargo, un nuevo meca- nismo de evasién del CMV que le confiere re- sistencia natural a la accién mediada por célu- las NK. El CMV humano expresa en la infec- cin tempranala glicoproteina gpULA0, la cual media la expresiGn de la molécula de CMH no clasica HLA-E. Esta molécula, como se anot6 anteriormente, es reconocida por el heterodi- mero compuesto por el receptor CD94 y el NKG2, el cual induce sefales inhibitorias so- bre la capacidad citot6xica de las células NK mediadas por fosfatasas intracelulares. Adicio- nalmente, la expresion de moléculas homélo- gasa las moléculas del CMH-I por el CMV mu- rino, asi como la expresin de productos del locus de susceptibilidad genética a la infeccién por el CMV murino (el cual ha sido localizado en el complejo genético NK que codifica para lamayorfa de los receptores de las células NK), son mecanismos esenciales en la evasin de muchos virus al ataque de las células NK y son cruciales en la sobrevida por largos periodos en el hospedero. Del estudio de estos meca- nismos de evasi6n, podran desprenderse nue- vas alternativas terapéuticas cuya efectividad dependera de una adecuada estimulacién de la respuesta inmune y particularmente de las, células NK, consideradas bajo esta perspecti- va como las células efectoras intermediarias en- tre la respuesta inmune innata y la respuesta inmune especifica. Células NK en la gestaci6n. Los cambios en el numero de células NK residentes en el endo- 236 metrio observadosa lo largo de los ciclos mens- trual y estral (en los murinos), han permitido postular posiblesacciones desta subpoblacién celular en el tracto reproductivo. Se conoce que en el ciclo menstrual, el incremento de las cé- lulas NK comienza en el dia 3 de la fase liitea y en la fase secretoria tardia llega a ser de un 30 a 40% del compartimiento estromal. Si ocurre la decidualizaci6n (transformaci6n inflamato- ria del endometrio dependiente de la proges- terona) este incremento llega a ser hasta de un 70% aproximadamente. De igual manera, en la fase ltitea del ciclo estral aumenta el ntime- ro de células NK y durante la decidualizacién se constituyen en la poblaci6n leucocitaria ma- yoritaria hasta la mitad de la gestacién. Este aumento se evidencia también desde el naci- miento hasta la pubertad, ya que la subpobla- in de células uterinas que expresan el marca- dor LGL-1 es encontrado a partir de la segun- da semana de vida en los ratones. Los interro- gantes acerca de una posible funcién de las cé- lulas NK en el fenémeno reproductivo, espe- cialmente el que tiene que ver con la implan- tacién y el desarrollo embrionario temprano, ‘cuyos eventos median el ulterior desarrollo del trofoblasto (componente fetal de la placenta humana), han justificado una reciente linea de investigacién en este tema. Si bien el papel que puedan ejercer las células NK en la gestacin temprana no es claro, se han esgrimido algunas hipétesis sobre su po- sible funcién, las cuales destacamos a conti- nuacién: * Las oélulas NK son iniciadoras de la falla del embarazo en los humanos y en el modelo murino de aborto. Inicialmente se explicaba el rechazo fetal mediante la acci6n citotéxica de las células NK presentes en la interfase materno fetal; sin embargo, diferentes evi- dencias sostienen que la subpoblacién de cé- lulas NK deciduales no son las directamente$+ nino togia: Una ciencia activa implicadas en la falla de los embarazos. Por ejemplo, en el caso de las células NK CD56"*"* endometriales y deciduales, su porcentaje disminuye proporcionalmente en comparacién con la subpoblacién CD56*"* en as mujeres abortadoras habituales, la cual proviene de sangre periférica. Esto refuerza el concepto que existen dos poblaciones di- ferentes desde el punto de vista funcional y que las células NK periféricas, CD56 “"* en particular, presentan mayor capacidad cito- t6xica comparada con la poblacién decidual. Porlo tanto, el rechazo alogénico del feto pue- de ser Ilevado a cabo por linfocitos infiltran- tes del tipo de las células NK més no por cé- lulas deciduales residentes 0 con el fenotipo CD56 “***, Sin embargo, en un modelo mu- tino de aborto (CBAxDBA/2), se ha recono- cido que la subpoblacién infiltrante de célu- Jas en el rechazo alogénico no corresponde con las células NK sino con linfocitos T atipi- ‘cos, que expresan el marcador asialo GM-1 (que también es expresado por las células NK) concomitantemente con el receptor de células T / y que producen principalmen- te TNF-a, una citoquina implicada en las reabsorciones embrionarias. Las células NK que llegan al endometrio li- mitan la invasi6n trofoblastica por medio de mecanismos citot6xicos. La limitacién en la invasi6n trofobléstica debida a la citotoxici- dad de las células NK, es una hipétesis que tiene poca evidencia experimental, tenien- do en cuenta que existen mecanismos no co- nocidos del trofoblasto que inhiben la lisis por parte de las células NK, diferentes aaque- los conocidos de la expresién de moléculas clase I no clasicas (Ib) como el HLA-E y el HLA-G, Por el contrario, se ha establecido que la subpoblacién de células NK deciduales produce componentes de la matriz extrace- 237 lular como la mucina 1, la cual se acumula progresivamente en sus grénulos intracito- plasmaticos y al ser secretada hace las veces de “autopista” para el trofoblasto invasor en direcci6n a las arterias espirales uterinas. Lo anterior favorece la invasi6n trofoblastica de alguna manera en vez de limitarla, al tiempo que permite el mantenimiento del embrién y el soporte nutricional a partir de la circu- lacién materna. Los productos solubles de las células NK de- ciduales son promotores del crecimiento y la invasi6n trofobléstica. La correlacién exis- tente entre la actividad litica disminuida por parte de las células NK, desde los estadios tempranos hasta la mitad de la gestacién y Ia reduccién de las funciones endosomales ylisosomales en este mismo perfodo de tiem- Po, parecen mostrar que el medio ambiente uterino es capaz de inducir un bloqueo de la cascada de sefiales, particularmente de aque- llas responsables de los mecanismos citot6xi- cos. De otro lado, la subpoblacién de células NK humanas CD56*h* CD16-, se ha consi- derado como la fuente primaria de citoquinas inmunoreguladoras que participan de la in- munidad innata. Es posible entonces un redi- reccionamiento de la sefializacién intracelu- lar hacia la produccién de citoquinas, even- to que se ha venido estudiando en la tiltima década. En este sentido, se ha demostrado que las citoquinas que favorecen el desarro- lo embrionario y placentario son produci- das ademés por las células NK deciduales desde sus estadfos tempranos de diferencia- cién, a la vez que se ha intentado determi- nar el papel de estas células en la implanta- cién, el desarrollo y la diferenciacién embrio- naria. Entre las citoquinas producidas por las células NK deciduales estan: el LIF el GM-CSE_ el CSF-1, el TNF-a, el IFN-, la IL-8 y el TGF-B.LECTURAS RECOMENDADAS Fr Bamford RN, Grant AJ, Burton JD, Peters C, Kurys G,Goldman CK, Brennan J, Roessler E, Waldmann ‘TA. The interleukin (IL) 2 receptor beta chain is shared by IL-2 and a cytokine, provisionally designated IL-[ that stimulates T-cell proliferation and the induction of lymphokine-activated killer cells, Proc Natl Acad Sci 1994;91:4940-4944, Barry M, Bleackley C. Cytotoxic T lymphocytes: All roads lead to death. Nat Rev Immunol 2002;2:401-408. ‘Cooper MA, Fehniger TA, Turner SC, Chen KS, Ghaheri BA, Ghayur T, Carson WE, Caligiuri MA. Human natural killer cells: a unique innate immunoregulatory role for the CD56(bright) subset. Blood 200197:31463151. Dyugovskaya L, Berkutski T, Ginsburg H. Characterisation of the morphogenetic course and secretion of two different types of mucoid mate- rial by granulated metrial gland/lymphokine- activated killer cells.J Anat 1995;187:693-708. Ginsburg H, Coleman R, Davidson S, Khoury C, Mor R. Lymphokine-activated killer cells are identical to the uterine granulated metrial gland (GMG) cells. Transplant Proc 1989;21:186-189. Kagi D, Lederman B, Burki K, Zinkernagel RM, Hengartner H. Molecular mechanisms of lymphocyte-mediated cytotoxicity and their role 238 inimmunological protection and pathogenesis in vivo, Ann Rev Immunol 1996;14:207-232. Mrozek E, Anderson P, Caligiuri MA, Role of interleukin-15 in the development of human (CD56+ natural killer ces from CD34+ hematopo- ietic progenitor cells. Blood 1996;87:2632-2640. Henkart PA. Cytotoxic lymphocytes. En: Paul WE (ed) Fundamental Immunology, Fourth Edition. Lippincott Raven Publishers, 1999. Pp: 1021-1049. Russell JH, Ley TJ. Lymphocyte-mediated cytotoxicity. Annu Rev Immunol 2002;20:323-370. 10. Seaman WE. Natural Killer cells and Natural Killer Teells. Arthritis Rheum 2000;43(6):1204-1217. 11. Ye W, Zheng LM, Young JD, Liu CC. Theinvolve- mentofinterleukin (IL)-15in regulating the diffe- rentiation of granulated metrial gland cells in mou- se pregnantuterus.J Exp Med 1996;184:2405-2410. 12 Ye W, Young JD, Liu CC. Interleukin-15 induces the expression of mRNAs of cytolytic mediators and augments cytotoxicactivities in primary mu- rine lymphocytes. Cell Immunol 1996;174:54-62. 13 Introduccién general a la apoptosis. http:// apored.rediris.es/divulgacion04.htm. 44. Caspasas: los enemigos internos. http:// _www:microscopios freeservers.com/caspasas.htm.