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Biología molecular. Fundamentos y aplicaciones en las ciencias de la salud

Capítulo 13: Enzimas de restricción

Jaime González Cuevas; Miriam Ruth Bueno Topete

Introducción
El descubrimiento, la caracterización y el aislamiento de los diferentes tipos de enzimas ha facilitado en la investigación las tareas del estudio de los
genomas así como su expresión, su regulación y su posterior correlación con el desarrollo de diversas enfermedades. Hoy por hoy es común la
aplicación de técnicas de biología molecular en diversas áreas, y en particular en las ciencias de la salud, ya que han revolucionado los métodos
analíticos generando gran impacto en la investigación básica y la clínica, especialmente en el diagnóstico de enfermedades.

Las enzimas de restricción son una herramienta primordial para la ejecución de diversos ensayos útiles en investigación clínica, desde la
determinación de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (restriction fragment length polymorphism, RFLP), así como en la
construcción de vectores con ADN recombinante y clonación de secuencias de ADN provenientes de humano, virus, bacterias y demás
microorganismos de interés para la generación de conocimiento o para su aplicación en el área de la medicina. Entre las enzimas que modifican los
ácidos nucleicos se encuentran las nucleasas, es decir, aquellas capaces de cortar los enlaces fosfodiéster que unen los nucleótidos de una cadena de
ácidos nucleicos. Las nucleasas se denominan endonucleasas si son capaces de cortar el enlace fosfodiéster en nucleótidos localizados dentro de la
cadena del ácido nucleico, y reciben el nombre de exonucleasas si cortan los enlaces fosfodiéster de los nucleótidos en los extremos de las cadenas.
Así, existen 3’exonucleasas las que escinden enlaces en el extremo 3’ de la cadena, y 5’exonucleasas que rompen enlaces fosfodiéster en el extremo 5’
de la cadena.

Las enzimas de restricción presentan actividad endonucleasa, son de origen bacteriano y cortan los enlaces fosfodiéster del ADN en una secuencia
específica denominada secuencia diana. El uso de estas enzimas como herramienta biotecnológica surgió de la necesidad de cortar las largas cadenas
de ADN genómico para manipularse y analizarse en fragmentos más pequeños. El empleo de las enzimas de restricción y otras enzimas que modifican
ácidos nucleicos, como la ligasa, permitió desarrollar la metodología del ADN recombinante.

En 1960, Stewart Linny y Werner Arber aislaron, en E. coli, enzimas que metilaban moléculas de ADN y que ademas cortaban un enlace fosfodiéster del
ADN no metilado. Más tarde, en 1970, se caracterizó la primera nucleasa de restricción por Daniel Nathans Hamilton Smith, aislada de Haemophilus
influenzae, denominada Hind I. En la actualidad, se sabe que todas las especies de bacterias sintetizan uno o más tipos de endonucleasas capaces de
hacer cortes en secuencias específicas de nucleótidos de una doble cadena de ADN exógeno; generalmente, este ADN “extraño” es el proveniente de
los bacteriófagos, virus con capacidad de infectar a dichas bacterias.

Estas endonucleasas se denominan enzimas de restricción debido a que restringen la permanencia de un ADN exógeno en la célula bacteriana que
produce dicha enzima. Las enzimas de restricción empleadas con más frecuencia en la metodología del ADN recombinante suelen reconocer una
secuencia única de 4 a 8 nucleótidos, donde realizan el corte.

Origen de las enzimas de restricción

Las endonucleasas de restricción forman parte de la maquinaria con la que cuenta la bacteria para defenderse de infecciones virales. El ADN de la
bacteria que produce la enzima de restricción no se ve afectado por su propia enzima, ya que las bacterias metilan determinadas secuencias a su
propio ADN para diferenciarlo del ADN viral por medio de una enzima metiltransferasa en bases específicas, que generalmente son las reconocidas
por sus propias enzimas de restricción.

Nomenclatura
Por acuerdo internacional, la nomenclatura de las enzimas de restricción se asigna según su origen bacteriano y se define basándose en las siguientes
reglas:
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cursiva que corresponden
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influenzae (Hin), etc.). La primera letra, en mayúscula, corresponde al género; las otras dos, a la especie.
por sus propias enzimas de restricción.
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Nomenclatura
Por acuerdo internacional, la nomenclatura de las enzimas de restricción se asigna según su origen bacteriano y se define basándose en las siguientes
reglas:

1. Tres letras en cursiva que corresponden al nombre científico de la bacteria de donde fue atraída (p. ej., Escherichia coli (Eco); Haemophilus
influenzae (Hin), etc.). La primera letra, en mayúscula, corresponde al género; las otras dos, a la especie.

2. La cepa o estirpe, si la hubiese (p. ej., EcoR, aislada de la cepa “RY13” de E. coli).

3. En números romanos, un número para distinguir si hay más de una endonucleasa aislada de esa misma especie (p. ej., EcoRI, EcoRV).

4. Todas deberían indicar con una “R” por restricción o una “M” por metilasa, según la función de la enzima, pero generalmente se omite.

Por ejemplo:

Hind III:

H = genero Haemophilus.

in = especie influenzae.

d = cepa DSM 11121.

III = tercera endonucleasa aislada en este organismo.

Eco RI:

E = género Escherichia.

co = especie coli.

R = cepa RV 13.

I = primera endonucleasa aislada de esta cepa.

Clasificación de enzimas de restricción

De acuerdo a su función las enzimas de restricción se han clasificado en tipo I, II, III.

Tipo I

Las enzimas que pertenecen a este grupo reconocen una secuencia específica de nucleótidos y hacen un corte aleatorio en la doble cadena en
cualquier secuencia del ADN y a una distancia aproximada de 1000 pb del sitio de corte; además tienen la función de metilar su propio genoma. Estas
enzimas necesitan adenosín trifosfato (ATP) para moverse a lo largo de la molécula de ADN desde el lugar de reconocimiento hasta el sitio de corte.

Tipo II

Son enzimas que reconocen secuencias específicas y hacen el corte de la doble cadena de ADN en el mismo sitio de reconocimiento. Estas enzimas
sólo tienen actividad de restricción no de metilación y son las utilizadas en ingeniería genética, ya que cortan el ADN en secuencias específicas
reconocidas. Requieren Mg2+ como cofactor y no requieren de ADN. Las secuencias de reconocimiento de estas enzimas son palindrómicas, es decir,
son secuencias que se leen igual en las dos cadenas de ADN. Por ejemplo: Por ejemplo:

5′ GGATCC 3′GATCC 3′3′ CCTAGG 5′CCTAGG 5′

Tipo III

Estas enzimas reconocen una secuencia específica y cortan el ADN de doble cadena fuera de la secuencia diana (aproximadamente de 25 a 27 pares de
bases corriente abajo del sitio de reconocimiento). Tienen, al igual de las de tipo I, actividad de metilasa y requieren de ATP para desplazarse a lo largo
de la molécula2022­6­30
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los diferentes tipos de enzimas, de restriccioón se resumen en el cuadro 13­1.
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Cuadro
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Características de las enzimas de restricción tipo III.
 5′ GGATCC 3′GATCC 3′3′ CCTAGG 5′CCTAGG 5′ Access Provided by:

Tipo III

Estas enzimas reconocen una secuencia específica y cortan el ADN de doble cadena fuera de la secuencia diana (aproximadamente de 25 a 27 pares de
bases corriente abajo del sitio de reconocimiento). Tienen, al igual de las de tipo I, actividad de metilasa y requieren de ATP para desplazarse a lo largo
de la molécula de ADN. Las características de los diferentes tipos de enzimas, de restriccioón se resumen en el cuadro 13­1.

Cuadro 13­1.

Características de las enzimas de restricción tipo III.

Tipo de enzima Gasto energético Sitio de corte en el ADN Actividad de metilasa

I ATP Aleatorio, fuera de la secuencia diana. Sí

II Específico, en la secuencia diana. No

III ATP Aleatorio, 25 a 27 pares de bases corriente abajo de la secuencia diana. Sí

Aplicaciones de las enzimas de restricción

Las enzimas de restricción son una herramienta básica en clonación e ingeniería genética; se utilizan, entre otros fines, para hacer mapas de
restricción de plásmidos o genomas. Un mapa de restricción se define como la serie de fragmentos que se generan por el corte con determinada(s)
enzima(s), específicos en tamaño (y secuencia) y que permiten emplearlos para la caracterización de dicho ADN. Esta herramienta es sumamente
importante para la clonación con vectores. También, en estudios de determinación de polimorfismos, como la técnica de RFLP, según se presente o no
el sitio de corte de una enzima de restricción, se puede establecer la variante alélica, ya que el peso molecular del fragmento o fragmentos de ADN
generado(s) permitirá la caracterización de la secuencia. Asimismo, la construcción de moléculas de ADN recombinante implica el obvio empleo de las
enzimas de restricción para definir y delimitar las secuencias que se insertarán en el constructo recombinante. De la misma manera, el corte de ADN
genómico que suele ser, según el organismo, del orden de millones de pb, es más manipulable cuando es digerido por estas enzimas en fragmentos
más pequeños. Esto permite un manejo adecuados sin el riesgo de degradacióny manipulación lación para la construcción de bibliotecas genómicas,
que se discuten en el capítulo de vectores de clonación.

Tipos de cortes producidos por las enzimas de restricción

Los cortes que realizan las enzimas de restricción sobre la cadena de ADN pueden generar dos estructuras o formas: cohesivas o romas. Los cortes
cohesivos, también llamados pegajosos, se generan porque la enzima corta en cada cadena de ADN entre nucleótidos localizados en posiciones
diferentes respecto al eje de simetría de la secuencia de diana. Estos cortes generan extremos monocatenarios en un segmento de 3 a 5 bases de
longitud, por lo que en esta fracción la falta de cadena complementaria facilita su interacción con otro fragmento en monocadena con secuencia
complementaria, como se muestra en el cuadro 13­2. Los extremos así generados propician la unión específica entre segmentos diferentes de ADN,
pero cortados por la misma enzima, lo que origina condiciones idóneas de unión específica para la producción de ADN recombinante. Los extremos
romos se generan porque la enzima corta en ambas cadenas de ADN sobre un mismo eje, por lo que dichos extremos son de doble cadena, y la unión
entre fragmentos de ADN con extremos romos es más inespecífica, ya que no depende de la complementariedad de regiones monocadena. En la figura
13­1 se muestran las enzimas que generan extremos cohesivos o pegajosos (EcoRI, BamHI, HindIII), y en la figura 13­2 las enzimas que generan
extremos romos (SspI, SmaI).

Cuadro 13­2.

Cortes cohesivos.

Enzima Bacteria origen Secuencia de reconocimiento Productos del corte

EcoRI Escherichia coli 5’GAATTC 5’­­­G AATTC­­­3’

3’CTTAAG 3’­­­CTTAA G­­­5’

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BamHI Bacillus amyloliquefaciens 5’GGATCC 5’­­­G GATCC­­­3’
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3’CCTAGG
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HindIII Haemophilus influenzae 5’AAGCTT 5’­­­A AGCTT­­­3’

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Enzima Bacteria origen Secuencia de reconocimiento Productos del corte

EcoRI Escherichia coli 5’GAATTC 5’­­­G AATTC­­­3’

3’CTTAAG 3’­­­CTTAA G­­­5’

BamHI Bacillus amyloliquefaciens 5’GGATCC 5’­­­G GATCC­­­3’

3’CCTAGG 3’­­­CCTAG G­­­5’

HindIII Haemophilus influenzae 5’AAGCTT 5’­­­A AGCTT­­­3’

3’TTCGAA 3’­­­TTCGA A­­­5’

TaqI Thermus aquaticus 5’TCGA 5’­­­T CGA­­­3’

3’AGCT 3’­­­AGC T­­­5’

NotI Nocardia otitidis 5’GCGGCCGC 5’­­­GC GGCCGC­­­3’

3’CGCCGGCG 3’­­­CGCCGG CG­­­5’

HinfI Haemophilus influenzae 5’GANTC 5’­­­G ANTC­­­3’

3’CTNAG 3’­­­CTNA G­­­5’

Sau3A Staphylococcus aureus 5’GATC 5’­­­ GATC­­­3’

3’CTAG 3’­­­CTAG ­­­5’

PovII Proteus vulgaris 5’CAGCTG 5’­­­CAG CTG­­­3’

3’GTCGAC 3’­­­GTC GAC­­­5

SmaI Serratia marcescens 5’CCCGGG 5’­­­CCC GGG­­­3’

3’GGGCCC 3’­­­GGG CCC­­­5’

HaeIII Haemophilus egytius 5’GGCC 5’­­­GG CC­­­3’

3’CCGG 3’­­­CC GG­­­5’

AluI Arthrobacter luteus 5’AGCT 5’­­­AG CT­­­3’

3’TCGA 3’­­­TC GA­­­5’

EcoRV Escherichia coli 5’GATATC 5’­­­GAT ATC­­­3’

3’CTATAG 3’­­­CTA TAG­­­5’

KpnI Klebsiella pneumonia 5’GGTACC 5’­­­GGTAC C­­­3’

3’CCATGG 3’­­­C CATGG­­­5’

PstI Providencia stuartii 5’CTGCAG 5’­­­CTGCA G­­­3’

3’GACGTC 3’­­­G ACGTC­­­5

SacI Streptomyces achromogenes 5’GAGCTC 5’­­­GAGCT C­­­3’

3’CTCGAG 3’­­­C TCGAG­­­5’

SalI Streptomyces albue 5’GTCGAC 5’­­­G TCGAC­­­3’

3’CAGCTG 3’­­­CAGCT G­­­5’

SphI Streptomyces phaeochromogenes 5’GCATGC 5’­­­G CATGC­­­3’

3’CGTACG 3’­­­CGTAC G­­­5’

XbaI Xanthomonas badrii 5’TCTAGA 5’­­­T CTAGA­­­3’

3’AGATCT 3’­­­AGATC T­­­5’

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13­1.

Cortes cohesivos o pegajosos.

 SphI Streptomyces phaeochromogenes 5’GCATGC 5’­­­G CATGC­­­3’
3’CGTACG 3’­­­CGTAC G­­­5’ Access Provided by:

XbaI Xanthomonas badrii 5’TCTAGA 5’­­­T CTAGA­­­3’

3’AGATCT 3’­­­AGATC T­­­5’

Figura 13­1.

Cortes cohesivos o pegajosos.

Figura 13­2.

Cortes romos.

Isoesquizómeros

Se denomina isoesquizómeros a las enzimas de restricción obtenidas de diferente especie bacteriana pero que reconocen la misma secuencia diana
de ADN y cortan entre diferentes nucleótidos de dicha secuencia (por ejemplo, Asp718 y KpnI). Ambas reconocen la secuencia 5´GGTAC3´ pero
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ASp718 corta el enlace entre GG mientras KpnI corta entre los nucleótidos AC, como se describe en la figura 13­3.
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Figura 13­3.
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Isoesquizómeros

Se denomina isoesquizómeros a las enzimas de restricción obtenidas de diferente especie bacteriana pero que reconocen la misma secuencia diana
de ADN y cortan entre diferentes nucleótidos de dicha secuencia (por ejemplo, Asp718 y KpnI). Ambas reconocen la secuencia 5´GGTAC3´ pero
ASp718 corta el enlace entre GG mientras KpnI corta entre los nucleótidos AC, como se describe en la figura 13­3.

Figura 13­3.

Isoesquizomeros.

Familias de enzimas de restricción

Una familia de enzimas de restricción está formada por aquellas que no necesariamente reconocen la misma secuencia diana, pero producen
extremos cohesivos similares. Un ejemplo de familia es: BamHI y BclII, que reconocen las secuencias diana 5’GGATCC3’ y 5’AGATCT3’, respectivamente,
pero que generan extremos cohesivos idénticos: 5’GATC3’.

BamH I:5′ GGATCC3′ 3′CCTAGG5′Bgl II:5′AGATCT3′ 3′TCTAGC5′

Esta característica favorece que dos fragmentos cortados con estas enzimas puedan recombinarse de manera específica gracias a la
complementariedad de sus bases en los extremos cohesivos generados, como se muestra en la figura 13­4.

Figura 13­4.

Familias de enzimas.

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complementariedad de sus bases en los extremos cohesivos generados, como se muestra en la figura 13­4.
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Figura 13­4.

Familias de enzimas.

Factores que afectan la actividad de las enzimas de restricción

Entre los factores que más afectan la actividad de las enzimas de restricción se encuentran:

La pureza biológica del ADN. Contaminación de la muestra con otros ADN impide el buen funcionamiento de las enzimas.

Los contaminantes como detergentes y estabilizadores (docedil sulfato de sodio –SDS–, ácido etilendiaminotetraacético –EDTA–), ya que
concentraciones elevadas de sales y detergentes inhiben la actividad enzimática.

Modificaciones en el pH y temperatura de incubación. Variaciones leves en estos parámetros inhiben enormemente la actividad de las enzimas.

El grado de metilación del ADN, ya que algunas enzimas son inhibidas por metilación en ciertas secuencias.

Condiciones de almacenamiento y conservación de las enzimas de restricción

Las enzimas de restricción, al igual que muchas otras proteínas, pueden disminuir su vida media y en consecuencia su actividad, al ser conservadas y
manejadas de forma inadecuada fuera de su rango ideal de temperatura; deben conservarse a ­20ºC, así que para evitar su congelamiento y su
consecuente pérdida de actividad son diluidas en un volumen determinado de glicerol. Para usarlas se requiere un contenedor que asegure la menor
variación de temperatura posible.

Selección de la enzima de restricción adecuada

Todos los organismos cuentan con un mapa de restricción que indica la posición donde se encuentran los sitios de corte para muchas de las enzimas
conocidas. Cuando se pretende realizar el corte en un plásmido conocido o comercial, por ejemplo, se revisa el mapa de restricción, el cual ofrece un
listado en orden alfabético de las enzimas que son capaces de cortar dicho ADN, el sitio de corte, el tipo de corte, así como el número y tamaño de cada
fragmento generado. En el caso del ADN genómico es necesario conocer la secuencia completa con la que se va a trabajar para conocer los sitios de
corte y predecir el número y tamaño de los fragmentos. Se realiza ingresando dicha secuencia a una base de datos especializada para estudios de
restricción y, de esta manera, se obtiene un listado de las posibles enzimas que reconocen la secuencia diana. Se elige la enzima tomando en cuenta
las características experimentales ajustándose al objetivo perseguido.

Eficiencia en el uso de las enzimas de restricción

Las hojas de instrucciones o insertos que facilita el proveedor incluyen las características y descripción de las condiciones óptimas de actividad de las
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enzima por microlitro), tiempo de incubación, así como los posibles requerimientos de aditivos, como albúmina, ATP, etcétera.
restricción y, de esta manera, se obtiene un listado de las posibles enzimas que reconocen la secuencia diana. Se elige la enzima tomando en cuenta
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las características experimentales ajustándose al objetivo perseguido.

Eficiencia en el uso de las enzimas de restricción

Las hojas de instrucciones o insertos que facilita el proveedor incluyen las características y descripción de las condiciones óptimas de actividad de las
enzimas de restricción disponibles comercialmente. Dichas condiciones están ajustadas para el volumen de reacción requerido, de acuerdo a la
tecnología que se requiere aplicar. Se debe tener en cuenta la temperatura óptima de acción, presentación comercial de la enzima (unidades de
enzima por microlitro), tiempo de incubación, así como los posibles requerimientos de aditivos, como albúmina, ATP, etcétera.

Cantidad de enzima adecuada para un ensayo

La cantidad de enzima utilizada en una reacción dependerá de la concentración de ADN en la muestra a digerir. La concentración de la enzima está
descrita en la hoja de instrucciones del proveedor, como unidades por microlitro (u/μl). Una unidad de enzima se define como la cantidad de enzima
requerida para producir la digestión completa de un microgramo de ADN sustrato en 60 minutos a la temperatura óptima de acción de la enzima. El
tiempo de incubación de la reacción puede ser incrementado si la enzima utilizada está cerca de su fecha de caducidad y su actividad está mermando.
Sin embargo, el tiempo no debe incrementarse demasiado, pues aunque el ADN es una molécula resistente, se corre el riesgo de su degradación.

Preguntas de repaso

1. ¿Cuáles son las condiciones de almacén y conservación de las enzimas de restricción?

2. ¿Cómo se determina la enzima de restricción ideal para realizar un corte en una secuencia específica de ADN?

3. ¿Cómo se logra la mayor eficiencia en la actividad de las enzimas de restricción?

4. ¿Cómo se determina la cantidad de enzima de restricción para un ensayo?

5. ¿Aumenta la eficiencia de la actividad de restricción si se rebasa el tiempo recomendado de incubación?

Ejercicios de integración

Instrucciones: A continuación se presenta la secuencia de ADN de un plásmido que consta de 4650 pares de bases.

1. Identifique los sitios de restricción en la cadena en base a la secuencia de nucleótidos de las siguientes enzimas de restricción.

AatII: 5’ G A C G T­­C 3’

BspHI: 5’ T­­C A T G A 3’

1 CCTGCAGGCA GCTGCGCGCT CGCTCGCTCA CTGAGGCCGC CCGGGCAAAG

51 CCCGGGCGTC GGGCGACCTT TGGTCGCCCG GCCTCAGTGA GCGAGCGAGC

101 GCGCAGAGAG GGAGTGGCCA ACTCCATCAC TAGGGGTTCC TGCGGCCGCA

151 CGCGTGGAGC TAGTTATTAA TAGTAATCAA TTACGGGGTC ATTAGTTCAT

201 AGCCCATATA TGGAGTTCCG CGTTACATAA CTTACGGTAA ATGGCCCGCC

251 TGGCTGACCG CCCAACGACC CCCGCCCATT GACGTCAATA ATGACGTATG

301 TTCCCATAGT AACGTCAATA GGGACTTTCC ATTGACGTCA ATGGGTGGAG

351 TATTTACGGT AAACTGCCCA CTTGGCAGTA CATCAAGTGT ATCATATGCC

401 AAGTACGCCC CCTATTGACG TCAATGACGG TAAATGGCCC GCCTGGCATT

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451 ATGCCCAGTA restricción, TGGGACTTTC
CATGACCTTA Jaime González Cuevas; Miriam
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501 GTATTAGTCA TCGCTATTAC CATGGTGATG CGGTTTTGGC AGTACATCAA
 251 TGGCTGACCG CCCAACGACC CCCGCCCATT GACGTCAATA ATGACGTATG
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301 TTCCCATAGT AACGTCAATA GGGACTTTCC ATTGACGTCA ATGGGTGGAG

351 TATTTACGGT AAACTGCCCA CTTGGCAGTA CATCAAGTGT ATCATATGCC

401 AAGTACGCCC CCTATTGACG TCAATGACGG TAAATGGCCC GCCTGGCATT

451 ATGCCCAGTA CATGACCTTA TGGGACTTTC CTACTTGGCA GTACATCTAC

501 GTATTAGTCA TCGCTATTAC CATGGTGATG CGGTTTTGGC AGTACATCAA

551 TGGGCGTGGA TAGCGGTTTG ACTCACGGGG ATTTCCAAGT CTCCACCCCA

601 TTGACGTCAA TGGGAGTTTG TTTTGCACCA AAATCAACGG GACTTTCCAA

651 AATGTCGTAA CAACTCCGCC CCATTGACGC AAATGGGCGG TAGGCGTGTA

701 CGGTGGGAGG TCTATATAAG CAGAGCTCGT TTAGTGAACC GTCAGATCGC

751 CTGGAGACGC CATCCACGCT GTTTTGACCT CCATAGAAGA CACCGGGACC

801 GATCCAGCCT CCGCGGATTC GAATCCCGGC CGGGAACGGT GCATTGGAAC

851 GCGGATTCCC CGTGCCAAGA GTGACGTAAG TACCGCCTAT AGAGTCTATA

901 GGCCCACAAA AAATGCTTTC TTCTTTTAAT ATACTTTTTT GTTTATCTTA

951 TTTCTAATAC TTTCCCTAAT CTCTTTCTTT CAGGGCAATA ATGATACAAT

1001 GTATCATGCC TCTTTGCACC ATTCTAAAGA ATAACAGTGA TAATTTCTGG

1051 GTTAAGGCAA TAGCAATATT TCTGCATATA AATATTTCTG CATATAAATT

1101 GTAACTGATG TAAGAGGTTT CATATTGCTA ATAGCAGCTA CAATCCAGCT

1151 ACCATTCTGC TTTTATTTTA TGGTTGGGAT AAGGCTGGAT TATTCTGAGT

1201 CCAAGCTAGG CCCTTTTGCT AATCATGTTC ATACCTCTTA TCTTCCTCCC

1251 ACAGCTCCTG GGCAACGTGC TGGTCTGTGT GCTGGCCCAT CACTTTGGCA

1301 AAGAATTGGG ATTCGAACAT CGATTGAATT CCCCGGGGAT CCTCTAGAGT

1351 CGACCTGCAG AAGCTTGCCT CGAGCAGCGC TGCTCGAGAG ATCTACGGGT

1401 GGCATCCCTG TGACCCCTCC CCAGTGCCTC TCCTGGCCCT GGAAGTTGCC

1451 ACTCCAGTGC CCACCAGCCT TGTCCTAATA AAATTAAGTT GCATCATTTT

1501 GTCTGACTAG GTGTCCTTCT ATAATATTAT GGGGTGGAGG GGGGTGGTAT

1551 GGAGCAAGGG GCAAGTTGGG AAGACAACCT GTAGGGCCTG CGGGGTCTAT

1601 TGGGAACCAA GCTGGAGTGC AGTGGCACAA TCTTGGCTCA CTGCAATCTC

1651 CGCCTCCTGG GTTCAAGCGA TTCTCCTGCC TCAGCCTCCC GAGTTGTTGG

1701 GATTCCAGGC ATGCATGACC AGGCTCAGCT AATTTTTGTT TTTTTGGTAG

1751 AGACGGGGTT TCACCATATT GGCCAGGCTG GTCTCCAACT CCTAATCTCA

1801 GGTGATCTAC CCACCTTGGC CTCCCAAATT GCTGGGATTA CAGGCGTGAA

1851 CCACTGCTCC CTTCCCTGTC CTTCTGATTT TGTAGGTAAC CACGTGCGGA

Downloaded 2022­6­30 GCAGGAACCC

1901 CCGAGCGGCC 6:57 P Your IP is 45.228.172.145
CTAGTGATGG AGTTGGCCAC TCCCTCTCTG
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1951 CGCGCTCGCT CGCTCACTGA GGCCGGGCGA CCAAAGGTCG CCCGACGCCC

2001 GGGCTTTGCC CGGGCGGCCT CAGTGAGCGA GCGAGCGCGC AGCTGCCTGC

 1751 AGACGGGGTT TCACCATATT GGCCAGGCTG GTCTCCAACT CCTAATCTCA Access Provided by:

1801 GGTGATCTAC CCACCTTGGC CTCCCAAATT GCTGGGATTA CAGGCGTGAA

1851 CCACTGCTCC CTTCCCTGTC CTTCTGATTT TGTAGGTAAC CACGTGCGGA

1901 CCGAGCGGCC GCAGGAACCC CTAGTGATGG AGTTGGCCAC TCCCTCTCTG

1951 CGCGCTCGCT CGCTCACTGA GGCCGGGCGA CCAAAGGTCG CCCGACGCCC

2001 GGGCTTTGCC CGGGCGGCCT CAGTGAGCGA GCGAGCGCGC AGCTGCCTGC

2051 AGGGGCGCCT GATGCGGTAT TTTCTCCTTA CGCATCTGTG CGGTATTTCA

2101 CACCGCATAC GTCAAAGCAA CCATAGTACG CGCCCTGTAG CGGCGCATTA

2151 AGCGCGGCGG GTGTGGTGGT TACGCGCAGC GTGACCGCTA CACTTGCCAG

2201 CGCCCTAGCG CCCGCTCCTT TCGCTTTCTT CCCTTCCTTT CTCGCCACGT

2251 TCGCCGGCTT TCCCCGTCAA GCTCTAAATC GGGGGCTCCC TTTAGGGTTC

2301 CGATTTAGTG CTTTACGGCA CCTCGACCCC AAAAAACTTG ATTTGGGTGA

2351 TGGTTCACGT AGTGGGCCAT CGCCCTGATA GACGGTTTTT CGCCCTTTGA

2401 CGTTGGAGTC CACGTTCTTT AATAGTGGAC TCTTGTTCCA AACTGGAACA

2451 ACACTCAACC CTATCTCGGG CTATTCTTTT GATTTATAAG GGATTTTGCC

2501 GATTTCGGCC TATTGGTTAA AAAATGAGCT GATTTAACAA AAATTTAACG

2551 CGAATTTTAA CAAAATATTA ACGTTTACAA TTTTATGGTG CACTCTCAGT

2601 ACAATCTGCT CTGATGCCGC ATAGTTAAGC CAGCCCCGAC ACCCGCCAAC

2651 ACCCGCTGAC GCGCCCTGAC GGGCTTGTCT GCTCCCGGCA TCCGCTTACA

2701 GACAAGCTGT GACCGTCTCC GGGAGCTGCA TGTGTCAGAG GTTTTCACCG

2751 TCATCACCGA AACGCGCGAG ACGAAAGGGC CTCGTGATAC GCCTATTTTT

2801 ATAGGTTAAT GTCATGATAA TAATGGTTTC TTAGACGTCA GGTGGCACTT

2851 TTCGGGGAAA TGTGCGCGGA ACCCCTATTT GTTTATTTTT CTAAATACAT

2901 TCAAATATGT ATCCGCTCAT GAGACAATAA CCCTGATAAA TGCTTCAATA

2951 ATATTGAAAA AGGAAGAGTA TGAGTATTCA ACATTTCCGT GTCGCCCTTA

3001 TTCCCTTTTT TGCGGCATTT TGCCTTCCTG TTTTTGCTCA CCCAGAAACG

3051 CTGGTGAAAG TAAAAGATGC TGAAGATCAG TTGGGTGCAC GAGTGGGTTA

3101 CATCGAACTG GATCTCAACA GCGGTAAGAT CCTTGAGAGT TTTCGCCCCG

3151 AAGAACGTTT TCCAATGATG AGCACTTTTA AAGTTCTGCT ATGTGGCGCG

3201 GTATTATCCC GTATTGACGC CGGGCAAGAG CAACTCGGTC GCCGCATACA

3251 CTATTCTCAG AATGACTTGG TTGAGTACTC ACCAGTCACA GAAAAGCATC

3301 TTACGGATGG CATGACAGTA AGAGAATTAT GCAGTGCTGC CATAACCATG

3351 AGTGATAACA CTGCGGCCAA CTTACTTCTG ACAACGATCG GAGGACCGAA

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Capítulo
340113: Enzimas deGCTTTTTTGC
GGAGCTAACC restricción, Jaime GonzálezGGATCATGTA
ACAACATGGG Cuevas; Miriam Ruth Bueno Topete
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3451 ATCGTTGGGA ACCGGAGCTG AATGAAGCCA TACCAAACGA CGAGCGTGAC
 3201 GTATTATCCC GTATTGACGC CGGGCAAGAG CAACTCGGTC GCCGCATACA
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3251 CTATTCTCAG AATGACTTGG TTGAGTACTC ACCAGTCACA GAAAAGCATC

3301 TTACGGATGG CATGACAGTA AGAGAATTAT GCAGTGCTGC CATAACCATG

3351 AGTGATAACA CTGCGGCCAA CTTACTTCTG ACAACGATCG GAGGACCGAA

3401 GGAGCTAACC GCTTTTTTGC ACAACATGGG GGATCATGTA ACTCGCCTTG

3451 ATCGTTGGGA ACCGGAGCTG AATGAAGCCA TACCAAACGA CGAGCGTGAC

3501 ACCACGATGC CTGTAGCAAT GGCAACAACG TTGCGCAAAC TATTAACTGG

3551 CGAACTACTT ACTCTAGCTT CCCGGCAACA ATTAATAGAC TGGATGGAGG

3601 CGGATAAAGT TGCAGGACCA CTTCTGCGCT CGGCCCTTCC GGCTGGCTGG

3651 TTTATTGCTG ATAAATCTGG AGCCGGTGAG CGTGGGTCTC GCGGTATCAT

3701 TGCAGCACTG GGGCCAGATG GTAAGCCCTC CCGTATCGTA GTTATCTACA

3751 CGACGGGGAG TCAGGCAACT ATGGATGAAC GAAATAGACA GATCGCTGAG

3801 ATAGGTGCCT CACTGATTAA GCATTGGTAA CTGTCAGACC AAGTTTACTC

3851 ATATATACTT TAGATTGATT TAAAACTTCA TTTTTAATTT AAAAGGATCT

3901 AGGTGAAGAT CCTTTTTGAT AATCTCATGA CCAAAATCCC TTAACGTGAG

3951 TTTTCGTTCC ACTGAGCGTC AGACCCCGTA GAAAAGATCA AAGGATCTTC

4001 TTGAGATCCT TTTTTTCTGC GCGTAATCTG CTGCTTGCAA ACAAAAAAAC

4051 CACCGCTACC AGCGGTGGTT TGTTTGCCGG ATCAAGAGCT ACCAACTCTT

4101 TTTCCGAAGG TAACTGGCTT CAGCAGAGCG CAGATACCAA ATACTGTCCT

4151 TCTAGTGTAG CCGTAGTTAG GCCACCACTT CAAGAACTCT GTAGCACCGC

4201 CTACATACCT CGCTCTGCTA ATCCTGTTAC CAGTGGCTGC TGCCAGTGGC

4251 GATAAGTCGT GTCTTACCGG GTTGGACTCA AGACGATAGT TACCGGATAA

4301 GGCGCAGCGG TCGGGCTGAA CGGGGGGTTC GTGCACACAG CCCAGCTTGG

4351 AGCGAACGAC CTACACCGAA CTGAGATACC TACAGCGTGA GCTATGAGAA

4401 AGCGCCACGC TTCCCGAAGG GAGAAAGGCG GACAGGTATC CGGTAAGCGG

4451 CAGGGTCGGA ACAGGAGAGC GCACGAGGGA GCTTCCAGGG GGAAACGCCT

4501 GGTATCTTTA TAGTCCTGTC GGGTTTCGCC ACCTCTGACT TGAGCGTCGA

4551 TTTTTGTGAT GCTCGTCAGG GGGGCGGAGC CTATGGAAAA ACGCCAGCAA

4601 CGCGGCCTTT TTACGGTTCC TGGCCTTTTG CTGGCCTTTT GCTCACATGT

2. En el siguiente esquema, determine los pares de bases de los fragmentos resultantes después del corte y complete el mapa de restricción del
plásmido.

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 4601 CGCGGCCTTT TTACGGTTCC TGGCCTTTTG CTGGCCTTTT GCTCACATGT Access Provided by:

2. En el siguiente esquema, determine los pares de bases de los fragmentos resultantes después del corte y complete el mapa de restricción del
plásmido.

3. El corte con las siguientes enzimas de restricción genera fragmentos de ADN los cuales serán analizados mediante electroforesis en gel. Indique
de manera aproximada de acuerdo a su peso molecular las bandas que estos segmentos de ADN generarían.

Bibliografía

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Lewin B. Genes VIII, 8a ed. Upper Saddle River, Nueva Jersey: Pearson/Prentice­Hall, 2004.

Nelson D., Cox M. Lehninger Principles of Biochemistry , 4a ed. Nueva York: Freeman, 2005.

Smith C.A., Wood E.J. Biología molecular y biotecnología. México, DF: Addison Wesley Longman, 1998.

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