CÓMO SE ESTUDIAN LAS PROTEÍNAS
1. Introducción
• Necesidad
o Análisis estructurales y bioquímicos detallados
o Grandes cantidades de proteína pura
• Desafío
o Aislar un tipo de proteína específico entre miles presentes en una célula
2. Métodos tradicionales de extracción
• Fuentes
o Proteínas extraídas de tejidos donde son abundantes
• Desventajas
o Incomodidad y complicaciones
▪ Ejemplo: viajes al matadero temprano
o Complejidad de tejidos y órganos intactos
o Procedimientos prolongados
▪ Serie prolongada de pasos de cromatografía
▪ Semanas de trabajo
o Baja cantidad de proteína pura obtenida
▪ Solo unos milígramos
3. Métodos actuales de extracción
• Fuentes
o Células cultivadas en laboratorio
• Ventajas
o Células "engañadas" para sintetizar grandes cantidades de una proteína
▪ Uso de técnicas de ingeniería genética (capítulo 10)
o Obtención de grandes cantidades de proteína pura en pocos días
4. Proceso de extracción y purificación
• Fuentes iniciales
o Fragmento de hígado
o Cuba de bacterias
o Levadura o células animales genomanipuladas
• Primer paso
o Romper las células para liberar el contenido
o Resultado: homogenizado o extracto celular
• Fraccionamiento inicial
o Separar clases de moléculas de interés
o Ejemplo: proteínas solubles de la célula
5. Técnicas de purificación de proteínas
• Cromatografía
o Separación de componentes individuales de una mezcla compleja
o Basado en propiedades de la proteína (tamaño, forma, carga eléctrica)
o Pasos
▪ Separación en fracciones
▪ Examen de fracciones para identificar proteína de interés
▪ Combinación de fracciones y pasos adicionales de cromatografía
o Tipos
▪ Cromatografía de afinidad (lámina 4-4)
▪ Uso de anticuerpos ligados a matriz de columna
▪ Aislamiento de proteínas que interactúan físicamente
• Electroforesis
o Separación en gel de poliacrilamida bajo campo eléctrico
o Migración de polipéptidos según tamaño y carga neta
o Visualización mediante tinción de bandas o manchas
6. Análisis de proteínas purificadas
• Estudios biológicos
o Detalles de actividad de la proteína
• Determinación de secuencia de aminoácidos
o Métodos tradicionales
▪ Digestión con proteasa selectiva (ejemplo: tripsina)
▪ Secuenciación directa de fragmentos peptídicos
o Métodos modernos
▪ Espectrometría de masas
▪ Determinación de masa exacta de fragmentos peptídicos
▪ Identificación de proteína mediante base de datos
▪ Espectrometría de masas en tándem para mayor resolución
7. Determinación de estructura tridimensional
• Métodos experimentales
o Cristalografía de rayos X
o Espectroscopía de resonancia magnética (RM)
o Criomicroscopía electrónica (crio-ME)
8. Ingeniería genética y producción de proteínas
• Avances
o Producción masiva de proteínas deseadas
o Uso de bacterias, levaduras y células de mamífero cultivadas
• Aplicaciones
o Producción de proteínas terapéuticas (ejemplo: insulina)
o Producción de hormonas de crecimiento humana
o Fármacos de fertilidad
o Uso en procesos industriales
9. Relación entre secuencia, estructura y función
• Progresos
o En conocimiento de estructura y función de proteínas (últimos 150 años)
o Determinación rápida de secuencias de aminoácidos
o Bases de datos públicas con millones de secuencias proteicas
• Patrones de secuencia específicos
o Segmentos de aminoácidos que se pliegan en dominios estructurales
• Predicción de estructura y función
o Basada en secuencia de aminoácidos
o Desafíos y avances en predicción estructural
o Observación de secuencia y deducción de estructura y función
10. Desafíos futuros
• Objetivos
o Predecir estructura de proteínas basándose en secuencia
o Herramienta poderosa para la investigación bioquímica
o Conocimiento más profundo de la base fundamental de la vida
