Facultad de Medicina

Escuela de Tecnología Médica

Sede Viña del Mar

Laboratorio
Clasificación Grupo ABO/RhD
 Clasificación ABO/RhD
Método en Tubo

Muestra.
Sangre total con o sin anticoagulante EDTA.

Material.
● Pipetas Pasteur.
● Tubos Khan (11x75).
● Gradillas para tubos Khan.
● Centrífuga para Inmunohematología.
● Lector de aglutinación.

Reactivos.
● Sueros anti-A, anti-B, anti-AB y anti-D, para la prueba directa o globular.
● Eritrocitos o glóbulos rojos testigos A1 y B comerciales 2-5% para la prueba
inversa o sérica.
● PBS o suero fisiológico tamponado.

Procedimiento.
1. Centrifugar el tubo de sangre total a 3.500 x 5 minutos
2. Numerar las muestras a clasificar y colocarlas ordenadamente en una
gradilla apropiada.
3. Solo utilizar el tubo PA (Prueba Autóloga), cuando la suspensión de eritrocitos
se ha realizado en el mismo plasma de la muestra, en caso contrario el control
se realiza en la misma suspensión del medio utilizado para dilución de
eritrocitos.
4. Colocar en la gradilla 7 tubos previamente marcados con las letras A, B, AB, D,
GRA, GRB y PA, junto a cada muestra a clasificar. Es recomendable utilizar dos
anti-D de distintos clones.
5. Colocar 2 gotas de suero anti-A en el tubo marcado A; 2 gotas de suero anti-B
en el tubo marcado B; 2 gotas de suero anti-AB en el tubo marcado AB; 2 gotas
de suero anti-D en el tubo marcado D;1 gota de GR testigos A1 en el tubo
marcado GRA; 1 gota de GR testigos B en el tubo marcado GRB.
6. Agregar a los tubos marcados GRA, GRB y PA, 2 gotas del suero o plasma de la
muestra.
7. Agregar a los tubos marcados A, B, AB, D y PA 1 gota de los eritrocitos de la
muestra al 4% (2-5%) diluidos en su propio suero o plasma o PBS.
8. Mezclar y centrifugar todos los tubos por el tiempo estandarizado para lectura
en su centrífuga (Se recomienda usar 1000 rpm x 1 minuto o 2400 rpm x 30
segundos).
9. Girar suavemente hacia adelante y atrás el tubo, y ayudándose con un lector
de aglutinación (caja de luz) o un fondo blanco. Registre los resultados en
intensidad de cruces.
NOTA:
● De no contar con células comerciales, utilizar glóbulos rojos lavados y
suspendidos al 4% (2-5%) en PBS (1 volumen de eritrocitos y 32 volúmenes de
diluyente). Ellos deben ser frescos e idealmente RhD negativos y la suspensión
debe prepararse diariamente.
● El punto 6 puede ser reemplazando la centrifugación por una incubación de 1
hora a temperatura ambiente (A partir de los 15 minutos es posible observar la
aglutinación).
● La clasificación ABO-D en neonatos y niños menores de 6 meses debe realizarse
sólo la prueba directa o globular. Si la sangre es obtenida del cordón umbilical,
ésta debe ser lavada con PBS al menos 4 veces para eliminar la interferencia de
la gelatina de wharton.

Lectura de resultados.
● Toda reacción de aglutinación o hemólisis se considera como positiva.
● La interpretación se realiza en cruces según el grado de aglutinación, cómo se
observa en las siguientes imágenes:

4+ Botón único. Fondo

claro. Sin células libres.

3+ Varios aglutinados de
gran tamaño. Fondo claro.
Sin células libres

2+ Muchos aglutinados
de mediano tamaño. Fondo
claro. Sin células libres.

1+ Numerosos
aglutinados pequeños.
Fondo turbio por GR libres.

Hemólisis Ausencia de
aglutinación. Fondo turbio
por lisis de GR.

0 Reacción negativa,
ausencia de aglutinación.
Para realizar una determinación ABO con esta técnica, debemos utilizar una tarjeta
que contenga columnas con Antisueros anti-A, anti-B, anti-AB, anti-D y 2 columnas
neutras para realizar la prueba inversa con suero o plasma del paciente y glóbulos
rojos testigos A1 y B.

Muestra
Sangre total con anticoagulante EDTA.

Materiales
● Pipeta automática o micropipeta.
● Puntas desechables para micropipeta.
● Tubos Khan.
● Gradilla para tubos Khan.
● Gradilla para tarjetas.
● Centrifuga para tarjetas.

Reactivos
● Tarjetas de gel para tipificación ABO.
● Solución salina, PBS o diluyente de muestras indicada por el fabricante.
● Eritrocitos testigos comerciales A1 y B (concentración indicada por el
fabricante).

Procedimiento (según proveedor A&B).

1. Centrifugar el tubo de sangre total a 3.500 RPM x 5 minutos.
2. Numerar las muestras a clasificar y colocarlas ordenadamente en una gradilla
apropiada.
3. Iniciar cargando la prueba Inversa:
Para la prueba inversa, añadir 50 uL de los GR testigos A1 al 1% a la columna
identificada como A1 y los GR testigos B al 1% a la columna identificada como B
(según proveedor).
4. Añadir 50 uL de suero o plasma de la muestra a las columnas marcadas como
A1 y B.
5. Incubar el tiempo indicado por el proveedor (10 minutos a temperatura
ambiente).
6. Para la prueba directa o globular, preparar en un tubo Khan una suspensión de
hematíes en medio Salino 0.8-1% (según instrucciones del fabricante).
7. Añadir 50 uL de la suspensión de glóbulos rojos a cada pocillo de cada columna
identificadas como A, B, AB, D y Ctl.
8. Centrifugar la tarjeta en la centrífuga para tarjetas, durante el tiempo
estandarizado en el equipo. En este caso no es necesario añadir antisueros ya
que la columna lo tiene incluido desde fábrica.
9. Leer la tarjeta, sobre fondo blanco o fuente de luz, en búsqueda de
aglutinación o hemólisis.

Lectura de resultados.
● Toda reacción de aglutinación o hemólisis se considera como positiva.
● La interpretación se realiza en cruces según el grado de aglutinación, cómo se
observa en la imagen siguiente:
 Técnica en
columna

4+ Banda homogénea de aglutinados en la parte superior de la columna.

3+ Banda superior de aglutinado y desplazamiento en la parte superior de la
columna.
2+ Aglutinados pequeños en la columna y a lo largo de la columna.
1+ Algunos aglutinados pequeños en la columna.
+/- Escasos aglutinados de pequeño tamaño en la columna.
0 Banda de GR al fondo de la columna, resto de la columna sin aglutinados.

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS (Tubo y columna).

La asignación del grupo sanguíneo debe realizarse de acuerdo con los resultados de la
siguiente tabla:

Reacción del
Reacción de células
suero con
con antisueros
células testigo. Interpretación
GRUPO
Anti- Anti- Anti - Anti- Células
Células B
A B AB D A1

0 0 0 + + + O Rh D POSITIVO

+ 0 + + 0 + A Rh D POSITIVO

0 + + 0 + 0 B Rh D NEGATIVO

+ + + + 0 0 AB Rh D POSITIVO
0 = No hay reacción de aglutinación
+ = Intensidad de aglutinación de cualquier tipo (4+, 3+, 2+, 1+)
Cuando los resultados entre ambas pruebas no concuerdan.
Si esto ocurre quiere decir que existe una discrepancia, que debe ser investigada antes
de informar el grupo ABO. Si la discrepancia se presenta en una unidad de sangre
donada, ésta debe mantenerse aparte y no transfundir hasta resolver el problema.
Cuando la discrepancia se presenta en un paciente que requiere una transfusión, éste
puede ser transfundido con eritrocitos concentrados del grupo O RhD compatible, para
solucionar la emergencia, teniendo la precaución de obtener previamente una
muestra suficiente como para resolver el caso.

Las discrepancias en una clasificación ABO pueden deberse a:

1- Errores técnicos.
● Material sucio.
● Contaminación bacteriana de las muestras.
● Contaminación de reactivos, sueros y células.
● Proporción incorrecta de la relación suero/células
● Exceso o falta de centrifugación
● Falta de adición de reactivos y muestra
● Temperatura de incubación incorrecta
● Pérdida de actividad de los reactivos
● Empleo inadecuado de reactivos y células testigos
● Presencia de hemólisis en la muestra
● Identificación incorrecta de la muestra, tubos.
● Registros mal llevados e incompletos.
● Etc.

2- Problemas inherentes a las células.

● Presencia de gelatina de Wharton en muestras de cordón.
● Pacientes recientemente transfundidos.
● Autosensibilización de los GR del paciente (autoanticuerpos) o EHRN.
● Poliaglutinación.
● Antígenos débiles de A y/o B.
● Pacientes que sufren de patologías infecciosas importantes (Ag. B adquirido) u
otras patologías malignas.
● Presencia de altas concentraciones de sustancias de grupo sanguíneo en el
plasma.
● Etc.

3- Problemas inherentes al suero.

● Presencia de anticuerpos irregulares fríos
● Patologías que se caracterizan por alto contenido de proteínas plasmáticas.
● Pacientes que están recibiendo expansores plasmáticos de alto peso molecular.
● Pacientes que carecen de anticuerpos, o los presentan en títulos muy bajos.
Grados de Aglutinación en Metodología Aglutinación en Columna (Gel)
 La Metodología de Aglutinación en Columna (Gel), permite estandarizar el uso de
reactivos, tiempos y lecturas disminuyendo sustancialmente la influencia del operador.

Control de Calidad en Aglutinación en Columna

Inspección Visual
 Observar un volumen uniforme en todos los pocillos, no se deben observar gotas de gel
en la cámara de reacción.
 Se debe observar claramente la diferencia entre el gel y el sobrenadante.
 No se debe observar ningún cambio de coloración al momento de recepcionar las tarjetas
o mientras se mantienen en almacenamiento para uso en el Laboratorio.
 El Gel debe tener una consistencia uniforme libre de burbujas y/o partículas
extrañas.

Recomendaciones
 Siempre revisar y leer el inserto de reactivos/insumos que se utilizan.
 Centrifugar todas las tarjetas en cuanto lleguen al Centro de Sangre, UMT o Banco de
Sangre.