UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA AMAZONÍA

PERUANA

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

PROYECTO DE TESIS PARA OBTENER EL TÍTULO DE

QUÍMICO FARMACÉUTICO

“ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA in vitro DEL EXTRACTO ACUOSO

LIOFILIZADO DE HOJAS DE LA ESPECIE Persea americana (PALTO)
SOBRE MICROORGANISMOS PATÓGENOS, IMET- EsSALUD 2013”.

AUTOR : BACH. FERREYRA SHUPINGAHUA, STEPHANI.

ASESORES : Q.F. HENRY VLADIMIR DELGADO WONG.

ING JORGE YSAAC VILLACRÉS VALLEJO MGR.

IQUITOS - PERÚ

1
 “ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA IN VITRO DEL EXTRACTO ACUOSO
LIOFILIZADO DE HOJAS DE LA ESPECIE Persea americana (PALTO)
SOBRE MICROORGANISMOS PATÓGENOS, IMET- EsSALUD 2013”.
Bach. Stephani Ferreyra Shupingahua

RESUMEN

El hombre desde la antiguedad ha buscado en las plantas la curación para sus diversas
enfermedades. Por eso la presente investigación tiene como objetivo determinar la
actividad antibacteriana in vitro del extracto acuoso liofilizado de hojas de la especie
Persea americana (palto) sobre Enterococcus faecalis, Escherichia coli y
Staphylococcus aureus. Las hojas fueron recolectadas del Jardín Botánico del Instituto
de Medicina Tradicional (IMET) de EsSALUD, del cual se obtuvo el extracto acuoso
liofilizado, preparándose concentraciones de 200mg/ml, 300mg/ml y 400mg/ml.
Obtenidos los extractos se determinó la actividad antimicrobiana utilizando la técnica de
disco difusión en agar, prueba que permite medir la susceptibilidad in vitro de los
microorganismos patógenos, utilizando como control positivo la gentamicina 10µg y
agua estéril como control negativo. La Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) se
determino por macrodilución, que es la concentración más baja de la sustancia que
puede inhibir el crecimiento visible de un microorganismo después de incubar por 24
horas. Al analizar los resultados de los ensayos se observó que el extracto acuoso de las
hojas de Persea americana (palto) a concentraciones de 200mg/ml, 300mg/ml y
400mg/ml, tuvo 59.61%, 61.51% y 65.37% respectivamente de actividad frente a
Enterococcus faecalis; frente a Escherichia coli a 200 y 300 mg/ml tuvo 56.35%, y a
400 mg/ml tuvo 63.61% de actividad; y en cuanto a Staphylococcus aureus se obtuvo
un 49.18% a 200 y 300 mg/ml y 52.43% de actividad a una concentración de 400
mg/ml. En la determinación de la CMI, el extracto tuvo 64mg/ml frente a Enterococcus
faecalis, 32mg/ml frente a Escherichia coli y 64mg/ml frente a Staphylococcus aureus.

Palabras claves: Actividad antibacteriana, extracto, liofilizado.

2
 “IN VITRO ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF LYOPHILIZED AQUEOUS
EXTRACT OF LEAVES OF THE SPECIES Persea americana (AVOCADO) ON
PATHOGENIC MICROORGANISMS, IMET- EsSALUD 2013”

Bach. Stephani Ferreyra Shupingahua

SUMMARY

The man from antiquity has searched in the plants, the healding for their various
illnesses. Therefore, the objective of this research is to determine the in vitro
antibacterial activity of lyophilized aqueous extract of leaves of the species Persea
americana (avocado) on Enterococcus faecalis, Escherichia coli and Staphylococcus
aureus. The leaves were collected from Botanical Garden of the Institute of Traditional
Medicine (ITME) of EsSALUD, of which was obtained the lyophilized aqueous extract,
preparing concentrations of 200 mg/ml, 300 mg/ml and 400 mg /ml, obtained the
extracts was determined the antibacterial activity using the technique of disk agar
diffusion , test that let to measure the IN VITRO susceptibility of pathogenic
microorganisms, using the same way as a positive control gentamicin 10µg, and steril
water as a negative control. The Minimum Inhibitory Concentration (MIC) was
determined by macrodilution, which is the lowest concentration of the substance that
can inhibit the visible growth of a microorganism after incubation for 18 hours. At the
end the results of the tests , it was observed that the aqueous extract from the leaves of
Persea Americana (avocado) at concentrations of 200 mg/ml, 300 mg/ml and 400 mg
/ml had 59.61 %, 61.51% and 65.37% respectively against to Enterococcus faecalis,
against Escherichia coli 200 mg/ml and 300mg/ml had 56.35% and 400 mg/ml had
63.61% of activity , was obtained a Staphylococcus aureus 49.18% to 200 mg/ml and
300 mg/ml and 52.43% of activity at a concentration of 400 mg/ml. In the determination
of the CMI, the extract had 64mg/ml against Enterococcus faecalis, 32 mg/ml against
Escherichia coli and 64 mg/ml against Staphylococcus aureus.

Key words: Antibacterial activity, extract, lyophilized

3
 DEDICATORIA

A MIS PADRES: Dioclicio Ferreyra

Lavy y Marcia Shupingahua Tangoa
por brindarme su amor, apoyo
incondicional y la oportunidad de
formarme como profesional y ser
ejemplo; los amo mucho.

A MIS HERMANOS: Alain y Andrés

por sus apoyo y cariño, los quiero
mucho.

A MIS ABUELITOS: Julia, Tomasa,

Alonso y en especial a mi abuelito
Nemesio que está en el cielo e influyo
mucho en mi formación personal.

A MI TIAS Y TIOS: Silvia, Carmen,

Zoila, Evita, Tania, Made, Juan, José,
Amarildo, Manuel, Javier, Oscar.

A MIS AMIGOS: Tito, Franck, Robín,

Claudio, Junior, Raúl, Jim Parra,
Glendy, Mónica, Cecilia, Nelly, Cristian,
Alex, Norma, Luis por su amistad y
compañerismo; y en especial a Eveling
Vanessa por su gran apoyo
incondicional.
4
 AGRADECIMIENTO

A DIOS por permitirme cumplir una de mis metas y darme fortaleza para seguir
adelante. Gracias Padre por estar siempre conmigo, ser mí ayuda y por todas las
bendiciones que me has dado a lo largo de mí camino.

Al Instituto de Medicina Tradicional por facilitarnos con los materiales y equipos para
el desarrollo de este trabajo de investigación.

Al Ing. Jorge Ysaac Villacrés Vallejo y QF Henry Delgado Wong por su participación
y asesoramiento en la revisión de la tesis y en la evaluación durante las diferentes
etapas del trabajo.

A mis asesores QF Daniel Torres Tejada, QF Brenda Urday Ruiz y QF Luis Vílchez
Alcalá por sus apoyo, paciencia en la revisión de este proyecto.

A mis compañeros del área de Microbiología Neiser Ríos Gómez y Norita Danae
Gaviria Tananta, por su colaboración, paciencia y dedicación durante el desarrollo de
este trabajo

Y a todas las personas que no mencioné y que apoyaron en el desarrollo de este trabajo.

5
 ÍNDICE

RESUMEN 2

DEDICATORIA 4

AGRADECIMIENTO 5

LISTA DE CUADROS 9

LISTA DE TABLAS 10

LISTA DE GRÁFICOS 11

LISTA DE SIGLAS Y ABREVIATURAS 12

CAPÍTULO I
1.1. Introducción 14
1.2. Planteamiento del problema 16
1.3. Objetivo 18

CAPÍTULO II.
2.1. Marco teórico 20
2.1.1- Persea americana (Palto) 20
2.1.1.1. Antecedentes. 20
2.1.1.2. Clasificación Taxonómica 22
2.1.1.3. Sinonimias 22
2.1.1.4. Nombre Comunes. 22
2.1.1.5. Descripción Botánica 22
2.1. 1.6. Estudio Fitoquímico. 23
2.1.1.7. Habitad y Distribución. 24
2.1.1.8. Ubicación en el Perú. 25
2.1.1.9. Usos Tradicionales 25
2.1.1.10. Estudios Farmacológicos 26

2.1.2. Bacterias 27
2.1.2.1. Staphylococcus aureus 27
2.1.2.2. Enterococcus faecalis 29
2.1.2.3. Escherichia coli 31

2.1.3. Métodos para determinación de la Actividad

Antimicrobiana in vitro. 33
Método de difusión 33
Métodos de dilución 34

2.2. Definiciones operacionales. 38

2.2.1. Variables. 38

6
 2.2.1.1. Variable Independiente 38
2.2.1.2. Variable Dependiente 38
2.2.2. Indicadores 38
2.2.2.1. Indicadores de la variable independiente 38
2.2.2.2. Indicadores de la variable dependiente 38

2.3. Hipótesis 41

CAPÍTULO III

3.1.- Metodología y diseño de la investigación. 43

3.1.1.- Método de Investigación 43
3.1.2.- Diseño del Estudio 43
3.2.- Población y muestra 43
3.3.- Materiales e instrumentos 44
3.4- Procedimiento de recolección de datos
3.4.1-Procedimiento para preparación de los extractos vegetales. 48
3.4.1.1- Recolección de las muestras vegetales 48
3.4.1.2- Preparación del pulverizado vegetal 48
3.4.1.3- Preparación de extractos acuoso IMET (2007) 49
3.4.1.4- Protocolo para la liofilización 49
3.4.1.5- Preparación de las concentraciones 49
3.4.1.6- Preparación de los discos de sensibilidad 49

3.4.2- Prueba de Sensibilidad según protocolo del Instituto de

Medicina Tradicional (IMET) 50

3.4.3- Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria 52

3.5- Análisis de datos 53

CAPÍTULO IV
4.1. Resultados 55
4.2. Discusión 65
4.3. Conclusión 68
4.4. Recomendaciones 69
4.5. Bibliografía 70
4.6. Anexo 80

7
 LISTA DE CUADROS

CUADRO 01 : Fórmula para determinar el porcentaje de inhibición 48

CUADRO 02 : Clasificación de la actividad antimicrobiana según el

porcentaje de inhibición 48

CUADRO 03 : Actividad Antibacteriana de extractos acuosos liofilizados

de hojas de Persea americana a partir del porcentaje de
inhibición frente a los microorganismos en estudio 59

8
 LISTA DE TABLAS

TABLA 01: Promedios de los halos de inhibición (expresado en mm) de los

diversos extractos acuosos liofilizados de Persea americana frente a los
microorganismos en ensayo …………………………………………………………. 53

TABLA 02: Porcentajes de inhibición (%) de los extractos acuosos liofilizados de hojas
de Persea americana frente a los microorganismos en ensayo………….….………….58

TABLA 03 : Concentración Mínima Inhibitoria (expresados en mg/ml) del extracto

acuoso liofilizado de hojas de Persea americana frente a los microorganismos en
estudio………………………………………………………………………………….61

9
 LISTA DE GRÁFICOS

GRÁFICO 01A.- Promedios de los diámetros de los halos de inhibición (expresado en

mm) de los extractos acuosos liofilizados de Persea americana a 200, 300 y 400 mg/ml
frente a Enterococcus faecalis………………………………………………………….54

GRÁFICO 01 B.- Promedios de los diámetros de los halos de inhibición (expresado en

mm) de los extractos acuosos liofilizados de Persea americana a 200, 300 y 400mg/ml
frente a Escherichia coli………………………………………………………………………..54

GRÁFICO 01 C.- Promedios de los diámetros de los halos de inhibición (expresado en

mm) de los extractos acuosos liofilizados de Persea americana a 200, 300 y 400 mg/ml
frente a Staphylococcus aureus……………………………………………...…………55

GRÁFICO 01 D.- Promedios de los diámetros de los halos de inhibición (expresado en

mm) del extracto acuoso liofilizado de Persea americana a 200 mg/ml frente a
Enterococcus faecalis, Escherichia coli y Staphylococcus aureus……………………55

GRAFICO 01 E.- Promedios de los diámetros de los halos de inhibición (expresado en

mm) del extracto acuoso liofilizado de Persea americana a 300 mg/ml frente a
Enterococcus faecalis, Escherichia coli y Staphylococcus aureus……………………56

GRÁFICO 01 F.- Promedios de los diámetros de los halos de inhibición (expresado en

mm) del extracto acuoso liofilizado de Persea americana a 400 mg/ml frente a
Enterococcus faecalis, Escherichia coli y Staphylococcus aureus……………………56

GRÁFICO 02. Porcentajes de inhibición (expresado en porcentaje) de los extractos

acuosos liofilizados de hojas de Persea americana a 200, 300 y 400 mg/ml frente a
Enterococcus faecalis, Escherichia coli y Staphylococcus aureus……………………..59

GRÁFICO 03.- Concentración Mínima Inhibitoria (expresados en mg/ml) del extracto

acuoso liofilizado de hojas de Persea americana frente a los microorganismos en
estudio………………………………………………………………………………….61

10
 LISTA DE SIGLAS Y ABREVIATURAS

ºC - grados Celsius

cm - centímetro

mg - miligramo

ml - mililitros

mm - milímetro

µl – microlitro

ATCC -American Type Culture Collection

CMI - Concentración Mínima Inhibitoria

MHB - Muller Hinton Broth o Caldo Mueller-Hinton

NCCLS -National Committee for Clinical Laboratories Standars

OMS -Organización Mundial de la Salud

UFC – Unidad Formadora de Colonia

11
CAPÍTULO I

12
1.1.- INTRODUCCIÓN

Las plantas constituyen una fuente importante de diversidad natural por la multitud de
compuestos que ellas sintetizan.1 Éstas son un valioso recurso para tratar enfermedades,
por lo cual merecen un interés especial en la búsqueda de medicamentos, porque la
medicina tradicional recoge el conocimiento trasmitido a través del tiempo por
generaciones; además, existe una probabilidad mucho más alta de encontrar compuestos
activos contra determinadas enfermedades. Más del 25% de los medicamentos
modernos proceden de plantas y menos del 2% de todas las especies de plantas han sido
estudiadas con fines medicinales.2

Existen innumerables sustancias químicas de origen vegetal que pueden considerarse

fármacos y son empleados en uno o más países, de las cuales el 74% fue descubierto a
partir de su empleo en medicina tradicional. 3

Actualmente se encuentran serios problemas de resistencia a los medicamentos

antimicrobianos. Esto se presenta con diversos microorganismos dentro de los cuales
cabe destacar Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Pseudomona aeruginosa, en
especial en el ámbito hospitalario; las infecciones adquiridas en hospitales son, en su
gran mayoría, resistentes a estos antibióticos como en el caso del S. aureus que para el
2004, llegó al 60.7% de resistencia, requiriendo tratamientos alternativos más costosos
y, muchas veces, de mayor toxicidad.

Por ello en el Perú se han desarrollado investigaciones sobre la composición química de

diversas especies vegetales y algunos estudios de sensibilidad microbiana; pero existen
todavía muchas especies de las cuales no se conocen sus propiedades farmacológicas, lo
que permitiría el uso apropiado de estos productos4. La flora peruana ofrece grandes
posibilidades para el descubrimiento de nuevos compuestos con actividad
antibacteriana. Se calcula que el Perú posee unas 25 000 especies de plantas conocidas,
con 17 144 especies de plantas con flores (Angiospermas y Gimnospermas), de las
cuales 5 354 (31,3%) son especies nativas. 5

13
Los extractos vegetales tienen mucha importancia para el desarrollo de nuevas drogas a
partir de las estructuras químicas que se lleguen a elucidarse a partir de estos.

Por ello, la presente investigación, en aras de buscar alternativas de tratamientos contra

las diversas enfermedades, tiene como objetivo evaluar la actividad antibacteriana in
vitro del extracto acuoso liofilizado de hojas de la especie Persea americana (palto)
frente a los microorganismos patógenos Escherichia coli, Staphylococcus aureus y
Enterococcus faecalis, utilizando la técnica de susceptibilidad microbiana para
determinar cuál de las concentraciones del extracto presenta mayor actividad
antibacteriana frente a los microorganismos seleccionados.

14
1.2.-PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Las enfermedades infecciosas constituyen un importante problema para la salud y son la

principal causa de muerte en todo el mundo. La resistencia de los microbios a los
antibióticos y los efectos tóxicos derivados del uso continuado de compuestos
antimicrobianos ha impulsado la búsqueda de antimicrobianos seguros.6

En la actualidad las cepas de S. aureus tienen un amplio rango de resistencia a los

antibióticos y se pueden encontrar cepas resistentes y multirresistentes. Actualmente se
reporta una resistencia a la penicilina del 80% al 93% o más en cepas de S. aureus
aisladas de hospitales y de la comunidad.7,8

El Sistema Nacional de Vigilancia de Infecciones Nosocomiales (National Nosocomial

Infectious Surveillance System, NNIS) de Estados Unidos, determinó que en pacientes
hospitalizados la prevalencia de cepas Staphylococcus aureus meticilinico resistente se
incrementó del 4% en 1980 al 31.9% en 1996. En 2001 se tenía un 55% de prevalencia
y para el 2004, llegó al 60.7%.6 Debido a la resistencia del S. aureus a la meticilina, se
introdujo la vancomicina; sin embargo en el 2002 se detectaron las primeras cepas
resistentes a este antibiótico ("vancomycin resistant S. aureus", VRSA). 9,10

Las cepas de E. coli, como las otras bacterias Gram-negativas, son intrínsicamente
resistentes a los antimicrobianos hidrofóbicos, tales como macrólidos, novobiocina,
rifamicina, actinomicina D y ácido fusídico.11 Tradicionalmente, las estrategias
terapéuticas y preventivas dependen del uso de antimicrobianos con el objetivo de
inhibir el crecimiento bacteriano, pero urgen alternativas a estos compuestos debido al
drástico aumento de resistencia múltiple a los antimicrobiano.12 Además, recientemente
se ha demostrado que concentraciones sub-inhibitorias de antibióticos aminoglucósidos
inducen a la formación de biopelícula por Pseudomona aeruginosa y E. coli. 13

En el Perú, existen reportes locales sobre el avance de la resistencia a los

antibacterianos en varios hospitales y clínicas de Lima14, 15
y Arequipa16; además,
nuestro país ha participado en redes de vigilancia de la OPS junto a otros países de
17
Latinoamérica , pero no hay una adecuada difusión del problema al personal de los
establecimientos de salud y a la comunidad en general.

15
La utilización irracional de los antimicrobianos es la causa principal de la resistencia.
Paradójicamente, esa presión selectiva es resultado de una combinación del uso
excesivo que se hace en muchas partes del mundo, en particular para combatir
infecciones menores, con un uso inadecuado por falta de acceso a un tratamiento
apropiado y de una sub-utilización debida a la falta de recursos financieros para cumplir
los tratamientos.18
Ante esta resistencia se buscan nuevas alternativas como el uso de plantas medicinales
utilizadas tradicionalmente.19 La Organización Mundial de la Salud estima que en muchos
países desarrollados el 70 al 80% de la población ha usado de alguna forma la medicina
tradicional; además, en algunos países asiáticos y africanos, el 80% de la población depende
de la medicina tradicional para la atención primaria de su salud. 20

Un ejemplo de este conocimiento sobre el uso de plantas para la cura de alguna enfermedad,
es la variedad de palto (Persea americana Mill) que es utilizado para diversas afecciones
en la salud del ser humano. 21 Sus principales usos son para infecciones e inflamaciones de
la piel (hojas), contra la diarrea y la disentería (semilla y cáscara), cicatrizante (pulpa de la
22
fruta). La acción como antiséptico de extractos de hojas de esta planta, se basa en los
compuestos terpénicos como el β-pineno, el cariofileno y el estragol. 23 El cariofileno no
solo tiene propiedades antimicrobianas sino también antiinflamatorias; por ello su
efectividad para curar heridas en la piel. 24

Por ello, la presente investigación busca estudiar las propiedades antimicrobianas de la

especie vegetal Persea americana Mill., por lo cual se plantea la siguiente
interrogante:

¿Tendrá actividad antibacteriana in vitro del extracto acuoso liofilizado de hojas de la

especie Persea americana (palto) sobre microorganismos patógenos, IMET- EsSALUD
2013?

16
1.3. OBJETIVOS

General:

Determinar la actividad antibacteriana in vitro del extracto acuoso liofilizado de

hojas de la especie Persea americana (palto) sobre microorganismos patógenos,
IMET- EsSALUD 2013.

Específicos:

Determinar la sensibilidad de Enterococcus faecalis, Escherichia coli y

Staphylococcus aureus frente a los extractos acuosos liofilizados de la especie
Persea americana (palto)

Determinar la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) del extracto acuoso

liofilizado de las hojas de la especie Persea americana (palto).

17
CAPÍTULO II

18
2.1. MARCO TEÓRICO

2.1.1- Persea americana (Palto)

2.1.1.1. Antecedentes.

25
CHACÓN A. L. (1998), en el “Estudio in vivo del efecto de la infusión de semillas
de aguacate (Persea americana) sobre microorganismos cariogénicos en alumnos
mayores de 10 años de edad con dentición permanente, que asisten a la escuela nacional
urbana mixta Ricardo Castañeda Paganini”, realizaron un estudio clínico por 15 días
para determinar la influencia de un enjuague bucal, conteniendo una concentración al
2% de semilla de aguacate, comparado con una solución control (clorhexidina) y una
solución placebo, en la disminución de microorganismos cariogénicos. Inicialmente
recolectaron muestra de saliva y luego de los 15 días de uso de la solución tomaron
nuevamente la muestra realizando un diagnóstico microbiológico, encontrando que la
solución de infusión de semillas de aguacate reducía la cantidad de UFC de
Lactobacilos y Streptococcus mutans.

MERCADO S. J. et al (2001), 26 en el estudio “Determinación de la actividad biológica

de los flavonoides de la hoja de Persea americana e identificación por electroforesis
capilar”, concentraron hojas de Persea americana con acetona al 70% y las cepas de
trabajo fueron B. subtilis y S thypi. Al analizar los resultados obtenidos de la actividad
antibiótica del extracto cetónico de la hoja de aguacate encontraron actividad contra B.
subtilis; en cambio no presentó actividad contra S thypi.

27
ORTEGA, G.A. et al (2005), en el estudio sobre “Residuos de Aguacate (Persea
americana var. Hass) con Actividad Antimicrobiana”, analizaron la actividad de los
extractos de acetona y éter etílico de la semilla y cáscaras de Persea americana (palto).
El mayor efecto antimicrobiano ocurrió con el extracto de acetona de semilla y cáscara
frente a cepas de Staphylococcus aureus y Streptococcus sp. El extracto de éter etílico
presentó efecto inhibitorio sólo cuando se utilizó la semilla de aguacate, mientras que
con la cáscara no se observó ningún tipo de inhibición. Las pruebas de CMI se
realizaron con los extractos de acetona. Los extractos obtenidos de semilla y cáscara
lograron inhibir el crecimiento de Staphylococcus y Streptococcus sp después de 24
horas de incubación adicionando al medio 25% de extracto.

19
ENRÍQUEZ A.A. (2010), 28 en su “Estudio de la actividad antimicrobiana del aceite
esencial y extractos vegetales evaluados en quesillo”, evaluó la actividad antimicrobiana
de aceites esenciales y extractos etanólicos del laurel mexicano (Litsea glaucescens), del
aguacatillo (Persea americana), la hierba del monte (Walteria indica), tronadora
(Tecoma stans), anís (Pimpinela anisum), hierba del borracho (Clinopodium
laevigatum), enebro (Janiperus communis); sobre tres bacterias patógenas indicadoras
de calidad en alimentos, Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Salmonella typhi.
Los extractos que presentaron mayor actividad antimicrobiana fueron los aceites
esenciales de laurel (Litsea glaucescens) y aguacatillo (Persea americana), que
mostraron inhibición media en concentración de 0.03 g/ml y alta en 0.9 g/ml.

ESCOBAR H.M et al (2010), 29 en el estudio “Evaluación de la actividad antidiarreica

y antibacteriana de los extractos de la semilla de palto (Persea americana) y buganvilla
(Bougainvillea glabra)”, determinaron la actividad de estos extractos. Las cepas
utilizadas para la evaluación de la actividad antibacteriana in vitro fueron Escherichia
coli diarreogénica, Shigella dysenteriae y Salmonella typhimurium. Se realizó
siguiendo la técnica descrita por Kirby Bauer, técnica que permite ensayar diferentes
dosis de extractos sobre cepas bacterianas, en la que puede observarse la formación o no
de halos de inhibición Los resultados de la prueba cualitativa antibacteriana del extracto
etanólico de buganvilla mostraron actividad frente a Escherichia coli, mientras que el
extracto de semilla de palto presentó actividad antibacteriana frente a Escherichia coli,
Shigella dysenteriae, Salmonella typhimurium.

30
FULGENCIO N.R. (2011), en su estudio sobre “Determinación del contenido de
persina en diferentes accesiones de aguacate criollo mexicano y evaluación de la
actividad antimicrobiana”, estudió las propiedades antimicrobianas de extractos y partes
de la planta Persea americana, mediante bioensayos in vitro contra bacterias
(Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis y Salmonella typhimurium) y
hongos (Candida albicans). Los extractos fueron obtenidos mediante el método de
maceración cloroformo-metanol para cada parte de planta (hoja, tallo y fruto). En
general, los extractos del tallo fueron efectivos contra S. aureus; los de hoja fueron
efectivos contra S. typhimurium.

20
2.1.1.2 Clasificación taxonómica
La clasificación taxonómica de Persea americana (palto), es la siguiente:

Reino : Vegetal
División : Spermatophyta
Subdivisión : Angiosperma
Clase : Magnoliids [Dicotiledoneae]
Orden : Laurales [Ranales]
Familia : Lauraceae
Género : Persea
Especie : Persea americana Mill.

Bergh and Ellstrand, 1987; Ben-Ya’ acov, 1995.

2.1.1.3. Sinonimias.
Laurus persea L.; Persea gratissima Gaerta.; P. Persea Cockerell.31

2.1.1.4. Nombre comunes.

Palta, huirapalta, acapa, abogado, abacate (Brasil), avocado (ingles), aguacate (mexico),
aguacatillo (Guatemala), pero avvocato (Italia), avocatier (francés), paratais
(v.amahuaca, shipibo conibo), pahta v.amarakaeri), afkati (Surinam), parite (v.campa),
palta y (quechua), parta (v. amuesha). 32, 33.

2.1.1.5. Descripción botánica

Es una especie polimorfa de crecimiento determinado, que puede alcanzar de 10 a 20
metros de altura, a veces notoriamente erecta, de tronco muy ramificado de manera
monopodial .34

Sistema radicular: Las raíces son generalmente superficiales. La raíz principal es corta
y débil como la mayoría de las especies arbóreas originarias de ambientes ricos en agua
durante el periodo vegetativo. Alcanza profundidades de 1.0 – 1.5 metros pero en
terrenos más sueltos puede superar esta marca. El sistema radicular tiene un patrón de
crecimiento horizontal que se concentra en los primeros 50 centímetros de profundidad
del suelo. Como las raíces poseen 3 pocos pelos absorbentes, la absorción del agua y los
nutrientes la realiza a través de los tejidos primarios de las puntas de las raíces. Esta

21
característica del aguacate provoca susceptibilidad al encharcamiento porque la planta
se asfixia con facilidad y es vulnerable al ataque de hongos en el tejido
ejido radicular por
ello debe cultivarse en suelos profundos y sin problemas de drenaje interno o texturas
muy arcillosas.

Tallo: El aguacate tiene un tronco leñoso y recto que puede alcanzar hasta 12 metros
Aunque hay reportes de árboles de 20 metros y troncos con diámetros mayores de 1.5
metros. La corteza es suberosa, de lisa a agrietada con 30 milímetros
milímetro de espesor. El
tejido leñoso es de color crema claro con vasos anchos.
anchos Los árboles
rboles con alturas
menores a 5 metros facilitan las prácticas de control
control fitosanitario, cosecha, poda y
fertilización foliar. Las ramas son abundantes, delgadas, sensibles a las quemaduras de
sol y a las heladas, frágiles al viento o exceso de producción. Por esta razón se
recomienda cultivar variedades enanas, compactas y establecer el cultivo en lugares
protegidos del viento.

Hojas: Las hojas son simples, alternas, enteras, elípticas, alargadas y pedunculadas, con
nervaduras pinnadas con inserción peciolada. La epidermis es pubescente y al llegar a la
madurez se vuelve lisa
isa coriácea con color verde intenso en el haz. En algunas
variedades se da una defoliación de corto tiempo antes
antes de la floración que indica su
adaptación a lugares no apropiados para su cultivo.

22
Flores: La inflorescencia es una
panícula axilar o terminal. Las
flores son hermafroditas,
simétricas y se agrupan en
racimos verde amarillento. Las
flores presentan dicogamia, es
decir los órganos masculino y
femenino de una misma flor se
abre en dos momentos distintos y
separados, es decir, los órganos
femeninos
emeninos y masculinos son
funcionales en diferentes tiempos, lo que evita la autofecundación. Las variedades se
clasifican con base en el comportamiento de la inflorescencia en dos tipos. En ambos
tipos, las flores abren primero como femeninas, cierran por un periodo fijo y luego
abren como masculinas en su segunda apertura

Frutos: El fruto es una drupa carnosa de forma periforme, ovoide, globular o alargada
de superficie lisa o rugosa. El color varía de verde claro a verde oscuro y de violeta a
negro de acuerdo
uerdo a la variedad y la maduración del fruto no tiene lugar hasta que éste
se separa del árbol. El período entre la floración y la maduración fisiológica es
característico de cada cultivar.
culti . Estas características y otras como la estructura,
consistencia dee la cáscara y pulpa, están determinadas por la raza y variedad cultivada.
Los frutos con cáscara dura son resistentes al transporte y manipuleo.

23
Semilla: La semilla es ovalada, como la forma de un durazno. Las semillas del grupo
racial Antillano poseen una cubierta de mediana a gruesa y membranosa. En otros
grupos raciales es delgada. El endocarpio o semilla es importante en la relación
fruto/semilla, siendo ideal una mayor porción de pulpa y una semilla de tamaño
mediano a pequeña. 35

2.1. 1.6. Estudio fitoquímico.

La hoja contiene, entre otros componentes, aceite esencial: estragol (80%), canfeno,
36
eugenol, metiléter, limoneno, β-mirceno, β-cimeno, α y β-pineno, entre otros ;
flavonoides: afzelina, guaijaverina, hiperósido, juglanina, quercetina, quercitrina,
isoquercitrina37, apigenina, astragalina, derivados de procianidina; cumarinas:
escopoletina; alcanos. La pulpa del fruto contiene sesquiterpenos: ácido dihidro-faseico
y derivados; carbohidratos: glucosa, fructosa, perseitol y mannoheptulosa .La semilla
contiene aceite fijo cuyos principales compuestos son: vitamina A, D-3, α-tocoferol,
colesterol. 38

2.1.1.7. Hábitat y distribución.

Árbol nativo de América tropical posiblemente del sur de México y Centro América;
introducido y cultivado en climas cálidos y templados de varias partes del mundo. 39

2.1.1.8. Ubicación en el Perú.

En el Perú, vegeta todo el año en zonas húmedas en los departamentos de Loreto, Junín,
Ica, Moquegua, Piura, San Martín, Ucayali, Amazonas, Cajamarca, Lima,
especialmente en los valles de la costa norte. 40

2.1.1.9. Usos tradicionales

Propiedades medicinales:

Amenorrea (y/o como abortivo): hoja o fruto, decocción, vía oral. 41

Bronquitis: hoja, decocción, vía oral. 41

Flatulencias: hoja, decocción, vía oral.42

Infección urinaria: hoja, decocción, vía oral.43

24
Forma de uso:

Para asma, bronquitis, flatulencias, infección urinaria y tos: Preparar una decocción.
Para amenorrea, 20 gramos (3 cucharadas) de hoja picada en 1 litro (4 tazas) de agua,
hervir por un mínimo de 10 minutos en recipiente tapado. Filtrar, enfriar y beber ½ a 1
taza 3 a 4 veces al día.43

2.1.1.10. Estudios farmacológicos

Algunos extractos de semillas del palto poseen actividad antimicrobiana sobre E. coli,
Mycrococcus pyogenes y Staphylococcus aureus. Por otra parte los compuestos
alifáticos de cadena larga, aislados de la cáscara del fruto, como el 1, 2,4 trihidroxi-n-
hepadeca-16-eno, han demostrado actividad bactericida sobre microorganismos Gram-
positivos, como Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Salmonella typhi y Staphylococcus
aureus. 44

Trabajos realizados in vitro con el cocimiento de semillas de Persea americana diluido

al 10% en agua corriente, determinaron la acción bactericida sobre Shigella flexneri,
Aeromonas sp., Vibrium cholerae.45El aceite de P. americana ha demostrado
efectividad contra Pseudomona aeruginosa y Staphylococcus aureus. 46

25
2.1.2. Bacterias

2.1.2.1 Staphylococcus aureus

Taxonomía y características.

Dominio : Bacteria

Filo : Firmicutes

Clase : Cocci

Orden : Bacillales

Familia : Staphylococcaceae

Género : Staphylococcus Rosenbach 1884

Especie : Staphyloccocus aureus.

Los estafilococos son cocos Gram-positivos que miden cerca de 1 µm de diámetro, no

móviles, aerobios facultativos y fermentadores de glucosa. 47

Es un coco que crece agrupado en racimos, no presenta movilidad ni forma cápsula. Es

capaz de crecer hasta con un 10% de sal común. Por esto puede crecer en el agua del
mar. Produce la fermentación láctica. Es catalasa positivo y coagulasa positivo; es la
única especie estafilocócica humana que produce coagulasa, enzima también producida
por Staphylococcus hyicus y Staphylococcus intermedius, cepas de animales que no
están asociadas a infecciones humanas.

Más del 95% de los Staphylococcus aureus producen proteína A que puede estar
asociada a la célula o al medio extracelular, con una importante afinidad a la fracción Fc
de la Ig G. La presencia de la proteína A o coagulasa es de gran utilidad clínica para
diferenciar Staphylococcus aureus de otras especies de estafilococos.

El Staphylococcus aureus es una bacteria que puede causar infecciones en todas las
edades en forma tanto esporádica como epidémica y se ha identificado como una de las
principales causas de infecciones de heridas quirúrgicas. Su principal forma de
transmisión es por contacto directo. 48

26
El Staphylococcus aureus es un agente patogénico que actúa como un microorganismo
saprofito, se encuentra en la piel del individuo sano pero en ocasiones en que las
defensas de la piel decaen, pueden causar enfermedad.

Estas bacterias también viven sin causar daños en los pasajes nasales. Pueden causar
desde infecciones leves y graves e incluyen abscesos, impétigo, forúnculos e
infecciones sistémicas graves que pueden asociarse con exfoliación superficial de la
epidermis. Este tipo de infección se ha denominado “síndrome de la piel escaldada”
estafilocócica. Puede producir enfermedades que pueden poner en peligro la vida, como
neumonía, meningitis, endocarditis, síndrome de shock tóxico (SST) y sepsis 49

27
2.1.2.2. Enterococcus faecalis

Taxonomía y características.

Dominio : Bacteria

Filo : Firmicutes

Clase : Bacilli

Orden : Lactobacillales

Familia : Enterococcaceae

Género : Enterococcus
(Ex Thiercelin & Jouhaud 1903)
Schleifer & Kilpper-Bälz 1984

Especie : Enterococcus faecalis
(Orla-Jensen 1919)
Schleifer & Kilpper-Bälz 1984

E. faecalis es un coco Gram-positivo, anaerobio facultativo, inmóvil y no

esporulado. El tamaño de cada célula oscila entre 0,5 y 0,8 micrómetros y es
habitante normal del tracto gastrointestinal humano. 50

La temperatura óptima de crecimiento in vitro de este microorganismo es de

35ºC, no obstante, se ha observado crecimiento entre 10ºC y 45ºC. Todas las
cepas pueden crecer en medios que contengan esculina, la cual hidroliza en
presencia de sales biliares al 40% (medio agar bilis-esculina). Casi todas las
cepas son homofermentativas, siendo el ácido láctico el producto final principal
de la fermentación de la glucosa, no producen gas y no contienen enzimas
citocrómicas. E. faecalis posee una pared celular con antígenos del grupo D, el
cual es un ácido lipoteicoico que se encuentra asociado con la membrana
citoplasmática de la bacteria y que contiene residuos de glicerol. 51

Enterococcus faecalis es una bacteria comensal, que habita el tracto

gastrointestinal de humanos y otros mamíferos .Como otras spp. del genero
Enterococcus, Enterococcus faecalis puede causar infecciones comprometidas
en humanos, especialmente en ambiente de hospital, actúa como patógeno

28
oportunista en pacientes añosos con enfermedades subyacentes graves y en
aquellos inmunocomprometidos que han estado hospitalizados por periodos
prolongados, en los que se usaron dispositivos invasivos o que recibieron terapia
antimicrobiana de amplio espectro. A pesar de su baja virulencia pueden ser
causantes de infecciones del tracto urinario, sangre, abdomen y heridas. La
existencia de enterococos se potencia porque ha tenido la habilidad de adquirir
resistencia a virtualmente todos los antibióticos de uso. Estos microorganismos
se han convertido actualmente en notorios patógenos nosocomiales. 49

El Género Enterococcus engloba un conjunto de especies morfológicamente

semejantes a los estreptococos. Las más frecuentemente aisladas en clínica son
Enterococcus faecalis (80 a 90%) y Enterococcus faecium (5 a 10%). 52

Los enterococos presentan resistencia intrínseca a las cefalosporinas, la

clindamicina y el cotrimoxazol.50 La resistencia adquirida a los betalactámicos
está causada por la modificación de las proteínas fijadoras de penicilina
(especialmente la PBP-5) y por la producción de betalactamasas, siendo el
primer mecanismo excepcional en E. faecalis. La resistencia intrínseca a los
aminoglucósidos es de bajo grado, mientras que la adquirida se debe a la
53
producción de enzimas modificadoras de aminoglucósidos.

Actualmente, en EE.UU. el generó Enterococcus constituye la cuarta causa más

frecuente de infección nosocomiales y la tercera causa de bacteriemia, y suponen
un10,2% del total de las bacteriemias.50 Estas cifras son algo menores en
Europa, donde las bacteriemias por enterococos suponen un 7,2% del total, y en
España, donde representan aproximadamente del 6% al 15%. 54

29
2.1.2.3 Escherichia coli

Taxonomía y características.

Dominio : Bacteria

Filo : Proteobacterias

Clase : Gammaproteobacteria

Orden : Enterobacteriales

Familia : Enterobacteriaceae

Género : Escherichia

Especie : Escherichia coli (E. freundi)
Migula, 1895

Escherichia coli es un bacilo Gram-negativo anaerobio facultativo de la familia

enterobacteriaceae, tribu escherichia. 55

Mide de 1 a 3 µm, presentándose individualmente o en pares, en cadenas cortas o

formando grupos. En general se moviliza por flagelos peritricos aunque existen
variantes inmóviles no flagelados. No forma esporas y por lo general es no
capsulado. En cultivos jóvenes la forma cocobacilar es bastante frecuente; en los
viejos, se presentan en formas de dimensión mayor. 56

Esta bacteria coloniza el intestino del hombre a las pocas horas de su nacimiento y
se la considera un microorganismo de la flora normal; sin embargo, hay cepas que
pueden ser patógenas y pueden causar daño produciendo diferentes cuadros clínicos,
entre ello diarrea. 57

En base a su mecanismo de patogènicidad y cuadro clínico, las cepas de E. coli

causantes de diarrea, se clasifican en seis grupos:

E. coli enterotoxigénica (ETEC)

E. coli enteroinvasiva (EIEC)

30

E. coli enteropatogéna (EPEC)

E. coli enteroagregativa (EAEC)

E. coli de adherencia difusa (DAEC)
58

E. coli enterohemorràgica (EHEC)

La mayoría de las cepas intestinales de E. coli no son patógenas y coexisten en armonía

con el hospedador, algunas incluso lo benefician sintetizando cofactores y hasta lo
protegen de la invasión por microorganismos patógenos.59

No obstante, algunas cepas son patógenas y pueden producir infecciones entéricas

(diarrea, disentería, colitis hemorrágica, síndrome urémico hemolítico) o
extraintestinales (infecciones urinarias, bacteriemias o septicemias, meningitis,
peritonitis, abscesos, mastitis, infecciones pulmonares y de heridas). En los seres
humanos, E. coli provoca cerca de 630 millones de casos de diarrea en el mundo y
aproximadamente 775.000 muertes al año, afectando fundamentalmente a la población
infantil de países en desarrollo. Además, es el patógeno oportunista más frecuentemente
asociado con infecciones urinarias y septicemias en humanos.59

31
2.1.2.4. Problemática de la resistencia a los antimicrobianos.

Un antimicrobiano es una droga que actúa principalmente contra organismos

infecciosos. Originalmente, la definición de antibiótico se refería a una sustancia
química producida por diversas especies de microorganismos que, en pequeñas
concentraciones, era capaz de inhibir el desarrollo de otros microorganismos. No
obstante, el advenimiento de los métodos sintéticos ha introducido una modificación en
esta definición. Hoy, el antibiótico se define como una sustancia de origen natural o
sintética que es capaz de inhibir o matar a microorganismos.60

Al momento de su introducción en el mercado, los primeros antibióticos fueron

realmente “drogas maravillosas”. El optimismo inicial de que podían poner fin a las
infecciones bacterianas, llevaron a la aceptación general de que estos recursos podían
aplicarse ampliamente para el control de la enfermedad. Sin embargo, no pasó mucho
tiempo para que comenzaran a emerger cepas resistentes y muy pocas bacterias, tales
como Streptococcus pyogenes, han mantenido en el tiempo una predecible
susceptibilidad a la penicilina.60

La resistencia a los antimicrobianos es un fenómeno biológico natural que puede ser

acelerado por una variedad de factores, incluyendo las prácticas humanas. El uso de un
antimicrobiano para cualquier infección, real o temida, en cualquier dosis y durante
cualquier período de tiempo, fuerza a los microbios a adaptarse o morir en un
fenómeno conocido como "presión selectiva". Los microbios que se adaptan y
sobreviven son portadores de genes para la resistencia, que pueden ser transmitidos. 61

Existe evidencia que apoya la opinión de que el alto consumo de antibióticos es el

factor crítico en la selección de resistencia. Paradójicamente, la falta de uso por
problemas de acceso, la dosificación inadecuada, la falta de adherencia a los
antimicrobianos puede desempeñar un papel tan importante como el uso excesivo. Por
estas razones, la mejora en el uso de antimicrobianos es una prioridad y la aparición y
propagación de la resistencia deben controlarse de manera eficiente.

En septiembre de 2001, la OMS lanzó la primera estrategia mundial para la lucha contra
los graves problemas causados por la emergencia y propagación de la resistencia a los
antimicrobianos conocida como la Estrategia Mundial OMS de contención de la

32
resistencia a los antimicrobianos. Las malas prácticas de prescripción en cualquier país
ahora amenazan con minar la potencia de los antimicrobianos en todas partes. 61

Los mecanismos de la resistencia bacteriana son complejos, variados y no están

completamente estudiados, incluyen inactivación enzimática, alteración de receptores o
sitios diana, “by pass” de las vías metabólicas, alteración de la permeabilidad y
alteración del transporte de los antibióticos al interior de la bacteria. 62

Inmediatamente después de disponerse comercialmente de estos compuestos resultó

evidente, la necesidad de estudiar la susceptibilidad antimicrobiana. Es así que se
evalúan, mediante pruebas de susceptibilidad, las interacciones in vitro entre un germen
aislado y los agentes antimicrobianos que podrían ser apropiados para el tratamiento de
una infección.60

Las pruebas de susceptibilidad contribuyen, así, a orientar el tratamiento

quimioterápico de los procesos infecciosos, si la sensibilidad del microorganismo al
antimicrobiano, no puede ser predicha a partir del conocimiento de su identidad.
También se utilizan cuando, aún conociéndose la sensibilidad del germen a drogas
altamente efectivas, el paciente por otros problemas (por ejemplo, alergias) no puede
recibir dicha medicación. Además, pueden ser aplicadas con fines epidemiológicos y en
el estudio de nuevos antibióticos.62

Las dos pruebas de susceptibilidad de referencia son: la prueba por dilución, y la prueba
por difusión. La más frecuentemente utilizada para guiar la terapéutica es la prueba
por difusión con discos (Kirby-Bauer).60Las técnicas actualmente utilizadas son el
producto de importantes esfuerzos internacionales enfocados, desde hace más de dos
décadas, a normatizar el método.

El comité de expertos de la OMS y grupos colaborativos internacionales dirigidos por

Ericsson y Sherris sugirieron recomendaciones que fueron adoptadas por la mayor parte
de los países europeos.62 Sin embargo, la falta de acuerdo general sobre algunos
aspectos técnicos (puntos de corte) para la interpretación de estas pruebas continúa
siendo un tema de importantes esfuerzos internacionales. Europa está dividida en varias
regiones de influencia con diferentes sistemas para la determinación de la sensibilidad a
los antibióticos: Grupo Sueco de Referencia en Antimicrobianos, el Sistema DIN, el de
los países bajos, la Sociedad Británica de Antimicrobianos, la Sociedad Francesa de

33
Microbiología. También existe el Comité Americano de Estandarización de
Laboratorios Clínicos (NCCLS). En mayoría de los países latinoamericanos se siguen
las pautas del NCCLS, con algunas modificaciones.62

El principio del método referido habitualmente como “Método de la OMS”, que no

difiere sustancialmente del conocido “Kirby-Bauer”, involucra el uso de una cantidad
constante de antibióticos en un reservorio (discos de papel) aplicado sobre la superficie
del agar en el cual se ha cultivado el microorganismo en cuestión. Se forma así por
difusión, un gradiente de concentración de antibiótico y la sensibilidad de la bacteria
estará indicada por el tamaño de la zona de inhibición del crecimiento alrededor del
reservorio.

Para que los resultados sean confiables, los procedimientos deben ser controlados y
estandarizados cuidadosamente.

Categoría de interpretación de los resultados del método de difusión con discos:

Sensible: Esta categoría clínica implica que una infección dada por la cepa en estudio
puede ser tratada apropiadamente con la dosis de antibiótico recomendada para el tipo
de infección y la especie infectante, a menos que hubiera contraindicaciones.

Intermedio: Esta categoría incluye cepas que pueden ser inhibidas por concentraciones
de antibiótico más elevadas, siempre que las dosis usadas puedan ser aumentadas (por
ejemplo, beta lactámicos) o que sean concentradas fisiológicamente en el tejido
infectado (por ejemplo, beta lactámicos y quinolonas para infecciones del tracto
urinario)

Resistente: Las cepas resistentes no son inhibidas por las concentraciones séricas
normalmente alcanzadas a dosis habituales y/o caen en el rango donde son comunes
mecanismos específicos de resistencia microbiana y la eficacia clínica no ha sido
comprobada.60

34
2.1.3.- Métodos para determinación de la Actividad Antimicrobiana in vitro.

Método de difusión en agar

El método de difusión en agar está apoyado por datos clínicos y de laboratorio;
63
presenta la ventaja que sus resultados son altamente reproducibles. La técnica está
basada en el método originalmente descrito por Bauer et al., (método de Kirby-Bauer).
Este método de difusión, en disco o en pozo, fue estandarizado y es actualmente
recomendado por el Subcomité de Ensayos de Susceptibilidad de NCCLS, de Estados
Unidos.
Esta determinación se fundamenta en establecer, en forma cuantitativa, el efecto de un
conjunto de sustancias, ensayadas individualmente, sobre cepas bacterianas que se
64.
aíslan de procesos infecciosos. El método se basa en la relación entre la
concentración de la sustancia necesaria para inhibir una cepa bacteriana y el halo de
inhibición de crecimiento en la superficie de una placa de agar con un medio de cultivo
adecuado y sembrado homogéneamente con la bacteria a ensayar y sobre la cual se ha
depositado un disco de papel filtro de 6 mm de diámetro, o se ha sembrado en pozo
impregnado con una cantidad conocida de la sustancia. 65

La técnica con sensidiscos presenta varias desventajas; entre ellas está la composición
del papel filtro Whatman, compuesto de celulosa (uniones β-(1,4) de monómeros de
glucosa), los cuales tienen muchos grupos hidroxilos libres presentes en cada glucosa,
haciendo que la superficie del disco sea hidrofílica , 66 interviniendo directamente con
algunos compuestos catiónicos de los productos naturales absorbiéndolos en la
superficie del disco e impidiendo la difusión de éstos en el agar; los compuestos
apolares pueden no ser influenciados por dichos grupos hidroxilos y difundir fácilmente
en el agar. 67

En el caso de evaluar varias sustancias, los discos de papel filtro o los pozos deben
ponerse en forma equidistante. A continuación se procede a su incubación a la
temperatura adecuada por 24 horas 68, luego se mide el halo de inhibición y se comparan
los efectos de las distintas sustancias sobre el microorganismo en estudio, con el
antibiótico control. La lectura de los resultados representa la actividad in vitro de la
sustancia. Algunos autores refrigeran las cajas a 4°C para permitir la predifusión de los
extractos antes de la incubación. 69
35

Método de dilución

El método de dilución en agar o en caldo como test de susceptibilidad microbiana es

70
utilizado para determinar la concentración mínima bactericida (CMB) y la
71
concentración mínima inhibitoria (CMI) la cual es definida como la concentración
más baja de sustancia que puede inhibir el crecimiento visible de un microorganismo
después de incubar por 24 horas; la CMB, como la concentración más baja que puede
prevenir el crecimiento de un organismo después de subcultivar en un medio libre del
compuesto evaluado. Estas variables constituyen una herramienta para investigar
nuevos antimicrobianos. 72

En la técnica de dilución en caldo, son utilizados tubos o microplacas (microdilución)

que contienen concentraciones crecientes del extracto vegetal. El organismo en estudio
es inoculado en los diferentes tubos o pozos de las microplacas y la CMI es determinada
después de la incubación. 73 En el método de dilución en agar, las cajas se siembran por
profundidad con una determinada concentración de extracto vegetal, luego se inoculan
con el microorganismo en estudio y se incuban por 24 horas; luego se examina si el
microorganismo crece o no en cada una de las cajas. La principal desventaja de este
método es la cantidad necesaria de muestra a evaluar.

Los métodos de microdilución en caldo son una técnica útil para determinar CMI, en
un gran número de muestras. La ventaja sobre los métodos de difusión radica en un
aumento de la sensibilidad para cantidades pequeñas, lo cual es importante cuando se
trabaja con productos naturales; además permite diferenciar entre un efecto bactericida
y un bacteriostático. 74

36
2.2. DEFINICIONES OPERACIONALES.

2.2.1. Variables.

2.2.1.1. Variable Independiente:

Extracto acuoso liofilizado de hojas de Persea americana (palto).

2.2.1.2. Variable Dependiente:

Actividad antibacteriana de hojas de Persea americana (palto).

2.2.2. Indicadores.

2.2.2.1. Indicadores de la variable independiente:

Concentración del extracto acuoso liofilizado de hojas de Persea americana

(palto).

2.2.2.2. Indicadores de la variable dependiente:

Sensibilidad del Enterococcus faecalis, Escherichia coli y Staphylococcus

aureus.

Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) de Enterococcus faecalis,

Escherichia coli y Staphylococcus aureus.

37
 Definición
Variable Independiente Definición Conceptual Indicadores Índice Escala
operacional

Sensibilidad Intervalar
Extracción por
bacteriana:
cocción de las
200, 300 y 400 -Tipo:
hojas entre 70 a
Extracto acuoso mg/ml del Cuantitativo
80ªC durante 1
liofilizado: Producto de la extracto acuoso
Extracto acuoso liofilizado hora. Posterior al Concentración del
extracción de las hojas, extracto acuoso liofilizado
de hojas de Persea filtrado,
obtenidos por cocción con
americana (palto). concentrado y liofilizado de hojas
agua y conservado en
medido el pH, de la especie Persea
congelación para luego Concentración -Tipo:
congelar a -22°C americana (palto).
liofilizarlo. Mínima Cuantitativo
para luego
Inhibitoria:
liofilizarlo (-40°C
512, 256, 128,
con una presión
64, 32, 16, 8, 4, 2
de 1.33 x 10-3
y 1 mg/ml del
MBARR/72
horas) extracto acuoso
liofilizado.

38
 Variable Definición conceptual Definición operacional Indicadores Índices Escala y tipo de
dependiente variable

1. Grado de sensibilidad
Por Método de difusión en Determinación del tipo de Tamaño del
• Inactivo <40%
disco: Diámetro del medio de halo de inhibición, diámetro del halo
• Poco activo 40 a
cultivo alrededor del disco con mediante la observación de de inhibición en
50%
antimicrobianos, que presentan ausencia de crecimiento, los discos,
• Moderado activo 51
inhibición completa, inhibición crecimiento parcial o expresado en a 75%
parcial o sobrecrecimiento del sobrecrecimiento del porcentaje de • Buena actividad
microorganismo. microorganismo inhibición Tipo de variable
>76%
Actividad : cuantitativa
Antibacteriana Presencia y/o
Determinación de la ausencia de
Por Concentración Mínima
2. Mínima concentración
Concentración Mínima turbidez en los
Inhibitoria: del extracto que inhibe el
Inhibitoria mediante tubos con diferentes
Concentración más baja del crecimiento de las
observación visual de no concentraciones de
extracto de Persea americana bacterias.
formación de turbidez extractos de P.
(palto) capaz de inhibir el
americana.
crecimiento de microorganismos

39
2.3. HIPÓTESIS.

Existe actividad antibacteriana in vitro del extracto acuoso liofilizado de hojas

de la especie Persea americana (palto) sobre microorganismos patógenos,
IMET- EsSALUD 2013.

40
CAPÍTULO III

41
3.1.- METODOLOGÍA Y DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN.

3.1.1.- Método de Investigación:

Tipo de estudio:

Cuantitativo: Porque se realizo la recolección de los datos para probar la
hipótesis, con base en la medición numérica y el análisis estadístico, mediante el
cual se establecieron patrones de comportamiento y se probaron teorías

3.1.2.- Diseño del Estudio:

Experimental-Analítico: porque se realizaron comparaciones de la variable

dependiente entre los grupos experimentales y de control.

Prospectivo: porque en el registro de información se tomaron en cuenta los
hechos a partir de la fecha de estudio.

Longitudinal: porque se estudiaron las variables a lo largo del tiempo durante
el periodo de investigación

3.2.- POBLACIÓN Y MUESTRA:

Población vegetal:

Constituido por el conjunto de hojas de la especie Persea americana (palto) que

se encuentran en el Jardín Botánico perteneciente al Instituto de Medicina
Tradicional IMET-EsSALUD de la ciudad de Iquitos, Región Loreto, Perú.

Muestra vegetal:

Las hojas de Persea americana (palto) recolectadas del Jardín Botánico

perteneciente al Instituto de Medicina Tradicional IMET-ESSALUD de forma
aleatoria y que cumplan con los criterios de inclusión y de exclusión.

42
 Criterios de inclusión:

Hojas sanas, sin muestra de contaminación con microorganismos.

Hojas jóvenes

Criterios de exclusión:

Hojas secas o en mal estado de conservación.

Hojas con restos de excrementos de animales.

Hojas infectadas por microorganismos.

Población bacteriana:

Las cepas bacterianas de Staphylococcus aureus ATCC 25923., Escherichia coli ATCC
25922 y Enterococcus faecalis ATCC 29212, provenientes del Instituto Nacional de
Salud (INS), con sede en la ciudad de Lima.

Muestra bacteriana:

El número de colonias de Staphylococcus aureus ATCC 25923., Escherichia coli

ATCC 25922 y Enterococcus faecalis ATCC 29212, que se emplearon para la
preparación del inoculo bacteriano de tamaño similar.

Criterios de inclusión:

Cepas que reunieron las características microscópicas y bioquímicas de los

microorganismos en estudio.

Criterios de exclusión:

Cepas que presentaron contaminantes.

Cepas que no coincidieron con el fenotipo de los microorganismos en estudio.

43
3.3.- MATERIALES E INSTRUMENTOS

3.3.1.- Equipos:

Autoclave (Intermedical trade S.A./Model Mod. Vetical-V)

Balanza analítica (Mettler Toledo AG 204)

Cámara de reflujo laminar Magmehelic “forma cientific/Model: 13089-79)

Campana de Seguridad (Terra Universal)

Calentador eléctrico (PRACTICA/Modelo: cocineta eléctrica HP1)

Estufa de cultivo a 35°C (Merck/Model 1235-2)

Horno para esterilización (MEMMERT/Typ: UM 500)

Mechero de vidrio.

Refrigerador de 2 a 8°C (MABE Colombia/Modelo: RML10WHPN50)

3.3.2.- Materiales:

3.3.2.1- Medios de cultivo y reactivos:

 Agar Tripticasa de Soya:

Peptona de caseína 15.0 g

Peptona de carne 4.4 g

Peptona de soya 4.0 g

Cloruro de sodio 5.0g

Glucosa 2.0 g

Agar 14.3 g

Pesar 44.3 g de este medio deshidratado en 1 litro de agua destilada, agitando

frecuentemente hasta completa disolución y calentar unos minutos. Esterilizar
por 15 minutos a 121°C, dejar enfriar entre 45° a 50° y distribuir en placas Petri.

44
 Agar Mueller-Hinton:

Infusión de carne 300.0 g

Hidrolizado de carne 17.5 g

Almidón 1.5 g

Agar 17.0 g

Suspender 38 g en 1 litro de agua destilada y llevar a calentar por unos minutos

hasta disolución completa. Esterilizar en autoclave a 121°C por 15 minutos.

 Caldo Tripticasa de Soya:

Peptona de caseína 17.0 g
Peptona de harina de soya 3.0 g
D(+) -Glucosa 2.5 g
Cloruro de Sodio 5.0 g
Hidrógenofosfato di-potásico 2.5 g

Disolver 30 g en 1 litro de agua destilada llevar a calentar por unos minutos

hasta disolución completa. Esterilizar en autoclave a 121°C por 15 minutos.

 Caldo Mueller-Hinton.
Infusión de carne 2.0 g
Hidrolizado de caseína 17.5 g
Almidón 1.5 g
Disolver 30 g en 1 litro de agua destilada llevar a calentar por unos minutos
hasta disolución completa. Esterilizar en autoclave a 121°C por 15 minutos.

 Tubo de 0.5 de la Escala de McFarland

Cloruro de Bario 0.048M 0.5 ml
Ácido Sulfúrico 1% 99.5 ml

Agregar 0.5 ml de una solución de BaCl2 0.048M (BaCl2 2H2O al 1.157% P/V) a
99.5 ml de una solución de H2SO4 0,18M (1%V/V) en constante movimiento para
mantener la suspensión.

45
3.3.2.2- Materiales de vidrio:

Asa de inoculación

Disco de sensibilidad de Gentamicina

Discos estériles de 6 mm de diámetro.

Embudos de vidrio

Espátula mediana.

Guantes quirúrgicos Nº 7.½

Gradillas metálicas para tubos de ensayo.

Hisopos estériles.

Matraz Erlenmeyer de 250 y 500 cc

Marcador de vidrio

Mascarillas descartables.

Micropipetas automáticas de 250, 500 y 1000 uL.

Papel toalla

Papel filtro Whatman N° 3

Papel kraft.

Pipetas de 1 y 10 cc

Placas Petri de 10 cm.

Placas Petri de 4 cm.

Tips descartables.

Tijeras

Tubos de ensayo estériles con tapa-rosca.

Vernier o regla graduada en mm.

3.3.3- Muestra biológica:

Cepas de Enterococcus faecalis ATCC 29212

Cepas de Escherichia coli ATCC 25922

Cepas de Staphylococcus aureus ATCC 25923

46
3.4- PROCEDIMIENTO DE RECOLECCIÓN DE DATOS:

3.4.1- Procedimiento para preparación de los extractos vegetales.

2.1.4.1.Recolección de las muestras vegetales

Las hojas de la especie Persea americana (palto) fueron recolectadas en el

Jardín Botánico del Instituto de Medicina Tradicional IMET - EsSALUD,
ubicado en el pasaje San Lorenzo N° 205, con coordenadas (18 M 0691547 –
9583722) con una altura de 116 msnm, en la ciudad de Iquitos, capital de la
Región Loreto; a orillas del Río Amazonas en la Selva Baja, en el mes de
enero 2013. Es una zona considerada como bosque húmedo tropical, que
presenta una temperatura media anual de 26°C.

La identificación de las muestras vegetales se realizó en el Herbarium

Amazonense de la Universidad Nacional de la Amazonía Peruana.
Además, en la recolección de las muestras vegetales se tuvo en consideración
los siguientes factores:

Edad de la planta (hojas).

Estado vegetativo.

Estación de recolección.

2.1.4.2. Preparación del pulverizado vegetal

Se usaron las hojas jóvenes

Se cortaron en pequeños fragmentos.

Luego se secaron al medio ambiente x 5 días.

Se volvió a pesar y luego se procedió a pulverizar, haciendo uso de una
licuadora de cuchillas de acero inoxidable.

El pulverizado se guardó en frascos oscuros para su utilización posterior.

47
2.1.4.3.Preparación de extractos acuoso según IMET (2007):

Para la preparación de los extractos acuosos se procedió de acuerdo al siguiente

protocolo:
Se llevó a cabo mediante la cocción de las hojas frescas secas a una temperatura
entre 65 a 70°C, durante dos horas, empleando el agua como líquido extractivo;
luego se filtró con algodón y se dejó en refrigeración por tres días para que
sedimente; luego se eliminó el sedimento, se filtró y se concentró a una
temperatura determinada.

2.1.4.4.Protocolo para la liofilización:

Se colocó la muestra en un frasco especial que soportó grandes presiones.

Se congeló la muestra a una temperatura de –42ºC.

Luego se colocó en el equipo de liofilización por un tiempo de 72 horas.

Se retiró para su conservación a temperatura ambiental.

2.1.4.5.Preparación de las concentraciones:

Se procedió a hacer el cálculo de las concentraciones para cada extracto a

utilizar.

Se pesó 2.5 g de extracto liofilizado en 2.5 ml. de agua destilada estéril para
obtener la solución stock con una concentración de 1000 mg/ml.

A partir de esta solución stock se procedió a preparar las siguientes
concentraciones: 200 mg/ml, 300 mg/ml y 400 mg/ml.

2.1.4.6.Preparación de los discos de sensibilidad:

Los discos de sensibilidad se prepararon utilizando papel Wattman Nº 3 y se

usó un perforador convencional. Estos discos se esterilizaron en autoclave a
121C° en 15 libras de presión por 15 minutos.

Luego se procedió a agregar a cada uno de los discos 25 µl de las
concentraciones de los extractos vegetales de 200mg, 300mg y 400mg, las
que se dejaron secar por espacio de 24 horas.

48
3.4.2- Prueba de Sensibilidad según protocolo del Instituto de Medicina
Tradicional (IMET):

Se procedió a preparar el medio agar tripticasa de soya (TSA) en placas Petri para
los cultivos de Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis y Escherichia coli,
cepas puras obtenidas de Instituto Nacional de Salud (INS).

En una estufa se incubaron los microorganismos a 37ºC por 18 a 24 horas para
obtener cultivos jóvenes.

Obtenido las bacterias se cogieron de tres a cinco colonias aisladas y se
suspendieron en 5 ml de suero fisiológico.

Después de 15 minutos de haber preparado el inoculado bacteriano, y ajustada la
turbidez del mismo, sumergir un hisopo estéril en la suspensión, rotar el hisopo
varias veces presionando firmemente la pared interior del tubo por encima del
nivel del líquido para remover el exceso del inoculó.

Se inoculó la superficie seca de la placa Mueller-Hinton, estriando con el hisopo
en tres direcciones. Antes de colocar los discos se deja secar la placa a
temperatura ambiente durante 3 a 5 minutos para que se absorba el exceso de
humedad.

Se colocaron los discos de sensibilidad estándar con gentamicina 10µg como
control positivo y la sustancia a diferentes concentraciones, sobre la superficie del
agar en forma manual con la ayuda de una pinza estéril. Se presiono ligeramente
para asegurar el contacto uniforme, sin introducir el disco en el agar.

Los discos fueron colocados a una distancia de 2.5cm uno del otro y a 1.5cm del
borde de la placa. Si las placas a utilizar son de 150 mm, no deben ir más de 11
discos; si es una de 10 mm, colocar 5 discos.

Invertir las placas e incubar a 37°C durante 16 a 18 horas.

La prueba se realizó por triplicado.

Medir los diámetros de las zonas de inhibición completa (incluyendo el diámetro
completo), usando una regla o calibrador.

49
CUADRO 1: Fórmula para determinar el porcentaje de inhibición:

%INHIBICIÓN: Diámetro de la muestra X 100

Diámetro del control Positivo

Los ensayos fueron realizados por triplicado y se realizaron cultivos de control de todas
las cepas para comprobar su viabilidad. El criterio que se utilizó para la clasificación de
la actividad antimicrobiana de los extractos evaluados se detalla en el cuadro 2.

CUADRO 2: Clasificación de la actividad antimicrobiana según el porcentaje de

inhibición:

PORCENTAJE DE INHIBICIÓN ACTIVIDAD ACTIBACTERIANA

<40% Inactivo
40 a 50% Poco activo
51 a 75% Moderadamente activo
>76% Buena actividad
Fuente: Protocolo de estudio de la actividad antimicrobiana IMET – EsSALUD 2007.

50
3.4.3- Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria:

Se prepararon cultivos de 18 horas de las bacterias a estudiar, en agar tripticasa

de soya.

Se incubaron en una porción de una colonia aislada en 5 ml de Caldo de

Tripticasa de soya y se incubó a 37ºC hasta que la turbidez sea visible (entre 2 a
5 h.). Se Ajustó la turbidez con solución salina o caldo de cultivo estéril hasta
una turbidez equivalente al estándar 0.5 de la escala de McFarland
aproximadamente 106 UFC/ml.

Se realizó el ensayo en tubos y se llevó a cabo una dilución al 1/100 de este

inóculo de aproximadamente 106 UFC/ml.

Se preparó 15 tubos con 1 ml de Caldo Mueller-Hinton y uno con 1.8 ml., luego
se preparó una solución madre del extracto vegetal liofilizado a una
concentración de 5120 mg/ml.

Se añadió 0.2 ml de la solución madre del extracto vegetal al tubo que contenía
1.8 ml de caldo. A partir de este tubo se prepararon diluciones dobles seriadas
tomando 1 ml del 1er. tubo (512 mg/ml) transfiriéndolo al segundo. Después de
mezclar bien el contenido del segundo tubo se transfirió 1 ml al tercer tubo (128
mg/ml.), y así sucesivamente hasta el tubo 14, del cual se tomará 1 ml. y se
descartará.

Se añadió a cada tubo con el extracto vegetal 1 ml del inóculo que contenía
aproximadamente 106 UFC/ml.

Se Incubó los tubos a 37ºC durante 18 horas y luego se procedió a calcular la

C.M.I. agitando los tubos donde no hubo desarrollo bacteriano.

51
3.5- ANÁLISIS DE DATOS

Los resultados obtenidos en el ensayo, se expresaron en términos de valores

resultantes y se expresaron de la siguiente manera.

Se calculó la media y la desviación estándar de los diámetros de

inhibición, como medidas de tendencia central, obtenido de los extractos
acuosos liofilizados de las hojas de Persea americana (palto), que se
presentarán mediante tablas y gráficos. Los datos se procesaron
mediante un análisis de varianza de una vía (ANOVA) con un nivel de
significancia de p< 0.05; aplicando el programa SPSS versión 18.0 y las
diferencias entre medidas de grupos que fueron analizadas mediante el
test de comparación múltiples. El valor p < 0.05 fue considerado como
significante.

Se calculó el porcentaje de inhibición del extracto, obtenido del extracto

acuoso liofilizado de las hojas de Persea americana (palta), en la prueba
de actividad antimicrobiana por el método de disco difusión. Estos
valores son presentados en tablas, gráficos y clasificados de acuerdo a las
especificaciones del cuadro 2.

Las concentraciones mínimas inhibitorias, obtenidas de los extractos

acuosos liofilizados de las hojas de Persea americana (palto), son
presentadas en tablas y gráficos para facilitar la visualización. Se realizó
el análisis de varianza (ANOVA) utilizando el programa estadístico
SPSS v. 18.0 y las diferencias entre las medidas de grupos fueron
analizadas mediante el test de comparaciones múltiples. El valor p < 0.05
fue considerado como significante.

52
CAPÍTULO IV

53
4.1- RESULTADOS

4.1.1 ANÁLISIS DESCRIPTIVO DE LA ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA in

vitro DEL EXTRACTO ACUOSO LIOFILIZADO DE HOJAS DE LA
ESPECIE Persea americana (PALTO) SOBRE MICROORGANISMOS
PATÓGENOS A CONCENTRACIONES DE 200, 300 Y 400mg/ml POR EL
MÉTODO DE DISCO DIFUSIÓN:

a. Los diámetros promedios de los halos de inhibición del crecimiento

bacteriano in vitro del extracto acuoso liofilizado de hojas de la especie
Persea americana por el método de disco difusión se detallan en la Tabla
1 y en el Gráfico 1 (A,B, C, D,E y F), en los que se aprecia lo siguiente:

Los diámetros promedios de los halos de inhibición sobre

Enterococcus faecalis del extracto acuoso liofilizado de Persea
americana fue de 10.33 ± 0.57mm a 200 mg/ml, de 10.66 ± 0.57mm
a 300 mg/ml y de 11.33 ± 0.57mm a 400mg/ml. El agua destilada
como control negativo fue constante (6.00 ± 0.0), mientras que el
antibiótico Gentamicina como control positivo tuvo 17.33 ± 0.57mm.

Los diámetros de los halos de inhibición promedio sobre Escherichia

coli del extracto acuoso liofilizado de Persea americana a 200 y 300
mg/ml fueron constantes (10.33 ± 0.57 mm) y a 400mg/ml fue
11.66±0.57 mm; con el agua destilada el promedio fue 6.00 ± 0.0 mm.
Por su parte el control positivo Gentamicina el diámetro fue
18.33±0.57 mm

Los promedios de los diámetros de los halos de inhibición frente a

Staphylococcus aureus del extracto acuoso liofilizado de Persea
americana a 200 y 300 mg/ml también fue constante (10.00 ± 0.0
mm) y a 400 mg/ml fue 10.66± 0.57 mm. Con agua destilada como
control el promedio fue 6.00 ± 0.0 mm; mientras que la Gentamicina
tuvo un diámetro promedio 20.33± 0.57 mm.

54
TABLA 01.- Promedios de los halos de inhibición (expresado en mm) de los diversos extractos acuosos liofilizados de Persea americana
frente a los microorganismos en ensayo.

Enterococcus faecalis Escherichia coli Staphylococcus aureus

EXTRACTOS X ± SD X ± SD X ± SD

P. americana 200 mg/ml 10.33 ± 0.57 10.33± 0.57 10.00 ± 0.0

P. americana 300 mg/ml 10.66 ± 0.57 10.33 ±0.57 10.00 ± 0.0

P. americana 400 mg/ml 11.33 ± 0.57 11.66±0.57 10.66± 0.57

Control positivo: Gentamicina 10ug 17.33 ± 0.57 18.33±0.57 20.33± 0.57

Control negativo 6.00± 0.0 6.00± 0.0 6.00± 0.0

FUENTE: Elaborado por el autor.

55
GRÁFICO 01 A.- Promedio de los diámetros de los halos de inhibición (expresado en
mm) de los extractos acuosos
acuoso liofilizados de Persea americana a 200, 300 y 400 mg/ml
frente a Enterococcus faecalis.
faecalis

Actividad antibacteriana frente a E. faecalis

18 17,33
Diametro de inhibición (mm)

16
14
12 10,33 10,66 11,33 P. americana 200mg/ml
10
P. americana 300mg/ml
8
6 P. americana 400mg/ml
6
4 Gentamicina
2 Control
0

Enterococcus faecalis

Fuente: Elaborado por el autor

au

GRÁFICO 01B.- Promedios

Promedio de los diámetros de los halos de inhibición (expresado en
mm) de los extractos acuosos
acuoso liofilizados de Persea americana a 200, 300 y 400mg/ml
frente a Escherichia coli.

Actividad antibacteriana frenta a E. coli

Diametro de inhibición (mm)

20 18,33

15
11,66 P. americana 200mg/ml
10,33 10,33
10 P. americana 300mg/ml
P. americana 400mg/ml
6
5 Gentamicina
Control
0

Escherichia coli

Fuente: Elaborado por el autor

au
56
GRÁFICO 01 C.- Promedios
Promedio de los diámetros de los halos de inhibición (expresado en
mm) de los extractos acuosos
acuoso liofilizados de Persea americana a 200, 300 y 400 mg/ml
frente a Staphylococcus aureus.
aureus

Actividad antibacteriana frente a S. aureus.

25
Diametro de inhibición (mm)

20,33
20

15
P. americana 200mg/ml
10 10 10,66 P. americana 300mg/ml
10 P. americana 400mg/ml
6 Gentamicina
5
Control
0

Staphylococcus aureus

Fuente: Elaborado por el autor

au

GRAFICO 01 D.- Promedios

Promedio de los diámetros de los halos de inhibición (expresado en
mm) del extracto acuoso liofilizado de Persea americana a 200 mg/ml frente a
Enterococcus faecalis, Escherichia coli y Staphylococcus aureus.

10,4
10,33 10,33
10,3
Diametro de inhibición

10,2

10,1
10
10

9,9 Persea americana

200 mg/ml
9,8
E. faecalis E.coli S. aureus
Fuente: Elaborado por el autor
au
57
GRAFICO 01 E.- Promedio de los diámetros de los halos de inhibición (expresado en
mm) del extracto acuoso liofilizado de Persea americana a 300 mg/ml frente a
Enterococcus faecalis, Escherichia coli y Staphylococcus aureus.
aureus

10,8
10,66
10,6
Diametro de inhición

10,4 10,33

10,2

10
10

9,8
Persea americana
300 mg/ml
9,6
E. faecalis E. coli S. aureus

Fuente: Elaborado por el autor

au

GRÁFICO 01 F.- Promedio de los diámetros de los halos de inhibición (expresado en

mm) del extracto acuoso liofilizado de Persea americana a 400
00 mg/ml frente a
Enterococcus faecalis, Escherichia coli y Staphylococcus aureus.
aureus

11,8 11,66
11,6
Diametro de inhibición

11,4 11,33
11,2

11

10,8 10,66
10,6

10,4

10,2 Persea americana 400

mg/ml
10
E. faecalis E. coli S. aureus

Fuente: Elaborado por el autor

au

58
a. Los porcentajes de inhibición de los extractos acuosos liofilizados de las
hojas de la especie Persea americana son detallados en Tabla 02 y Gráfico
02, en los que se aprecia lo siguiente:

El mayor porcentaje de inhibición frente a Enterococcus faecalis fue

65.37% a una concentración de 400 mg/ml; en cambio a 200 y 300
mg/ml fue de 59.61 y 61.51% respectivamente.

El mayor porcentaje de inhibición frente a Escherichia coli fue 63.61% a

una concentración de 400 mg/ml; en cambio, a 200 y 300 mg/ml fueron
constantes (56.35%).

El mayor porcentaje de inhibición frente a Staphylococcus aureus fue

52.43% a una concentración de 400 mg/ml; en cambio, a 200 y 300
mg/ml se obtuvo un 49.18%.

59
TABLA 02.- Porcentajes de inhibición (%) de los extractos acuosos liofilizados de
hojas de Persea americana frente a los microorganismos en ensayo.

Bacterias Enterococcus Escherichia coli Staphylococcus

faecalis aureus
Extractos

P. americana 200mg 59.61 56.35 49.18

P. americana 300mg 61.51 56.35 49.18

P. americana 400mg 65.33 63.61 52.43

Gentamicina 10µg 100 100 100

FUENTE: Elaborado por el autor

CUADRO 03. Actividad Antibacteriana de extractos acuosos liofilizados de hojas de

Persea americana a partir del porcentaje de inhibición frente a los microorganismos en
estudio.

Bacteria Enterococcus Escherichia coli Staphylococcus

faecalis aureus
Extracto

P. americana 200 mg/ml Moderadamente Moderadamente Poca actividad

activo activo

P. americana 300 mg/ml Moderadamente Moderadamente Poca actividad

activo activo

P. americana 400 mg/ml Moderadamente Moderadamente Moderadamente

activo activo activo

60
GRÁFICO 02. Porcentajes de inhibición (%) de los extractos acuosos liofilizados de hojas de Persea americana a 200, 300 y 400 mg/ml frente
a Enterococcus faecalis, Escherichia coli y Staphylococcus aureus.

120
100% 100% 100%
Porcentaje de inhibición (%)

100

80 65.37%
59.61% 61.51% 56.35% 63.61% 52.43%
60 56.35% 49.18%
49.18%
40

20

0
Enterococcus faecalis Escherichia coli Staphylococcus aureus

P. americana 200 mg/ml P. americana 300 mg/ml P. americana 400 mg/ml Gentamicina

Fuente: Elaborado por el autor

61
4.1.2 ANÁLISIS DESCRIPTIVO DE LA CONCENTRACIÓN MÍNIMA
INHIBITORIA DEL EXTRACTO ACUOSO LIOFILIZADO DE HOJAS DE
LA ESPECIE Persea americana (palto) SOBRE MICROORGANISMOS
PATÓGENOS DE 1 A 512 mg/ml POR MÉTODO DE MACRODILUCIÓN
EN MEDIO LÍQUIDO.

La Concentración Mínima Inhibitoria del extracto acuoso liofilizado de hojas

de la especie Persea americana, se especifican en la Tabla 03 y Gráfico 03
donde se aprecia lo siguiente:

La Concentración Mínima Inhibitoria frente a Enterococcus faecalis fue de

64 mg/ml.

La Concentración Mínima Inhibitoria frente a Escherichia coli fue de 32

mg/ml.

La Concentración Mínima Inhibitoria frente a Staphylococcus aureus fue

de 64 mg/ml.

62
TABLA 03.- Concentración Mínima Inhibitoria (expresados en mg/ml) del extracto
acuoso liofilizado de hojas de Persea americana frente a los microorganismos en
estudio.

Bacterias
Enterococcus faecalis Escherichia Staphylococcus
coli aureus
Extracto

Persea americana 64 mg/ml 32 mg/ml 64 mg/ml

0
Control 0 0

FUENTE: Elaborado por el autor

GRÁFICO 03.- Concentración Mínima Inhibitoria (expresados en mg/ml) del extracto

acuoso liofilizado de hojas de Persea americana frente a los microorganismos en
estudio.
Concentracion Minima Inhibitoria (mg/ml)

70 64 64
60

50

40
32
30

20

10 Persea americana
0 0 0 control
0
Enterococcus Escherichia coli Staphylococcus
faecalis aureus

Fuente: Elaborado por el autor

au

63
4.2 DISCUSIÓN

La resistencia de los microorganismos patógenos a los antibióticos continúa siendo

de particular interés en todo el mundo, por lo que es indispensable contar con
nuevas alternativas terapéuticas. Si bien las plantas superiores no han aportado
antibióticos que tengan amplia comercialización, la industria farmacéutica y la
comunidad científica basados en gran parte en los exitosos resultados de su uso
tradicional en la atención primaria en salud, están estimulando esta búsqueda desde
dichas fuentes dado que la obtención de antibióticos a partir de hongos ha
disminuido sustancialmente, o desde las síntesis química que poco han aportado en
los últimos 20 años. Incluso en países muy desarrollados en la síntesis química,
diversos autores llaman la atención sobre la importancia de recurrir a fuentes
naturales, entre ellas las plantas, para explorar nuevas moléculas con actividad
antiinfecciosa. 75

Es común el empleo popular de partes vegetales con la finalidad de obtener

diversos efectos terapéuticos. Varios estudios han validado científicamente la
eficacia de numerosos usos de la medicina tradicional utilizada por la gente. Entre
las variadas aplicaciones terapéuticas de los vegetales, incluyen aquellas con
76
finalidad antimicrobiana. Varias de las especies de las familias Lauraceae a la
cual pertenece Persea americana se utilizaron a nivel tradicional para el
tratamiento de diversas infecciones, 77 lo cual ha generado un aumento en el interés
por determinar los metabolitos responsables de la actividad.

Con respecto a los resultados obtenidos del extracto acuoso liofilizado de hojas de
la especie Persea americana (palto), la actividad antibacteriana frente a
Enterococcus faecalis a una concentración de 200, 300 y 400mg/ml presentaron
59.61%, 61,51% y 65,37% de actividad, respectivamente; significando que tienen
una moderada actividad de acuerdo al cuadro N° 02 (Ver pág. 48). En relación con
la Concentración Mínima Inhibitoria, el extracto presentó 64 mg/ml.

Para Escherichia coli, la actividad del extracto de Persea americana fue de

56.35%, 56.35% y 63.61% a concentraciones de 200, 300 y 400 mg/ml,
respectivamente. También se encontraron rangos de una actividad moderada
(cuadro N° 02). El extracto de Persea americana presento una CMI de 32 mg/ml.

64
Para Staphylococcus aureus a una concentración de 400 mg/ml tuvo 52.43% de
actividad y de 200 y 300 mg/ml tuvo 49.18% en ambas concentraciones. En
relación con la Concentración Mínima Inhibitoria el extracto presento 64 mg/ml.

Los resultados mostraron actividad inhibitoria muy dependiente de su

concentración: a mayor concentración mayor su actividad sobre las bacterias
Enterococcus faecalis, Escherichia coli y Staphylococcus aureus. Pero ninguna
concentración del extracto pudo acercarse a la Gentamicina 10µg que fue el control
positivo; el control negativo (agua estéril) no presento ningún efecto.

78
Se ha reportado el efecto antibacteriano por GOMEZ-FLORES et al (2008) ,
donde obtuvieron resultados similares por los extractos etanólicos de hojas de
Persea americana Mill. La cual inhibió el crecimiento de Staphylococcus aureus y
Mycobacterium tuberculosis. FULGENCIO N.R. (2011) demostró que el extracto
de hojas maceradas de Persea americana en cloroformo/metanol tuvieron actividad
frente a Salmonella typhimurium y Staphylococcus epidermidis; por su parte el tallo
tuvo actividad contra Staphylococcus aureus.

Otros estudios realizados por ORTEGA G.A. et al (2005) en Persea americana

utilizando otros órganos de la planta, demostraron que el extracto de semilla tuvo
actividad frente a Escherichia coli; en un ensayo similar, NEEMAN et al (1970)
79
demostró su efecto de los extractos metanólicos derivados de frutos y semillas
teniendo efecto sobre Staphylococcus aureus, Pseudomona aeruginosa,
Escherichia coli, Shigella dysenteriae y Klebsiella pneumoniae. ENRÍQUEZ A.A.
28
(2010), en su estudio de la actividad antimicrobiana del aceite esencial y
extractos vegetales evaluados en quesillo del Persea americana, sobre tres bacterias
patógenas indicadoras de calidad en alimentos, Staphylococcus aureus, Escherichia
coli y Salmonella typhi. Persea americana tuvo efecto antimicrobiano a
concentraciones de 0.03 g/ml y 0.9 g/ml.

El palto contiene entre muchos otros compuestos químicos, alcaloides, saponinas,

flavonoides, esteroides, carbohidratos, ácidos grasos, aceites esenciales y flavonas.
Dentro de estos compuestos, el estigmasterol se reporta como uno de los
compuestos más abundantes e importantes en actividades relacionados con lesiones
dermatológicas80. La acción como antiséptico de extractos de hojas de aguacate, se
basa en los compuestos terpenicos como cariofileno y el estragol. 81

65
Sin embargo otros estudios realizados por MORAIS et al (2007), 82 señalan varias
clases de compuestos tales como los fitoesteroles, triterpenos, ácidos grasos, ácidos
furanoicos, flavonoides y proantocianidinas, como los responsables de su efecto
antimicrobiano. Según COWAN (2002), 83 los componentes reportados de Persea
americana como flavonoides, esteroides y terpenoides actúan como reactivos en la
pared celular de las bacterias (proteínas solubles), llevándoles a la muerte.

Como se mencionó anteriormente, muchas especies de la familia Lauraceae son

utilizadas tradicionalmente para diferentes infecciones, encontrándose en muchos
estudios resultados con actividad antibacteriana, como COY-CUCA
(2007)84quienes aislaron metabolitos de algunas especies de esta Familia,
obteniendo resultados positivos frente a Staphylococcus aureus. Esto concuerda con
nuestros resultados aunque con una mínima diferencia de inhibición, lo que
conllevaría a considerar que en el extracto de Persea americana existen
metabolitos útiles para optimizaciones estructurales de moléculas antibióticas con
mayor actividad.

66
4.3. CONCLUSIONES.

1. El extracto acuoso liofilizado de hojas de Persea americana tuvo una actividad de

59.61%, 61,51% y 65,37%, en las concentraciones de 200 mg/ml, 300 mg/ml y 400
mg/ml, respectivamente frente a Enterococcus faecalis; y una Concentración
Mínima Inhibitoria de 64 mg/ml frente a este microorganismo.

2. El extracto acuoso liofilizado de hojas de Persea americana frente a Escherichia

coli tuvo una actividad de 56.35% a concentraciones de 200 mg/ml, 300 mg/ml y
a 400 mg/ml tuvo una actividad de 63.61%; y una Concentración Mínima
Inhibitoria de 32 mg/ml.

2. Frente a Staphylococcus aureus, el extracto acuoso liofilizado de hojas de Persea

americana en las concentraciones de 200 mg/ml, 300 mg/ml, tuvieron la misma
actividad de 49.18%, y 52.43% a 400 mg/ml; y una Concentración Mínima
Inhibitoria de 64 mg/ml.

67
5.4. RECOMENDACIONES

• Realizar estudios fitoquímicos de Persea americana para obtener los

metabolitos con actividad antimicrobiana.

• Continuar con los estudios de muestras de Persea americana utilizando otros

métodos de extracción.

• Elaborar preparados galénicas de uso tópico con bajo costo para pacientes que
presenten infecciones dérmicas, considerando el uso tradicional que tienen la
especie estudiada en el presente trabajo.

• Determinar la actividad Tóxica del extracto de Persea americana In Vivo

• Realizar trabajos de investigación similares, principalmente en el campo

etnobotánico con otras plantas de nuestra región, en la búsqueda de nuevos
compuestos antimicrobianos en general.

68
4.5 BIBLIOGRAFÍA

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78
4.6. ANEXO

ANEXO 01.-Cepas
01 del Instituto Nacional de Salud

ANEXO 02. - Control Positivo

79
ANEXO 03.-Medios de Cultivo

80
ANEXO 04- Esquema para determinar la actividad antibacteriana por el método de
disco difusión.

Siembra e incubación de los Diluir el inoculo a 0.5 del

microorganismos estándar de McFarland.
McFarland

Sumergimos el hisopo en la Inoculamos en la placa de Mueller

suspensión Hintton.

Colocar los discos de los

extractos, antibiótico y control
negativo Colocar las placas en la incubadora.

Incubar a 37°C por 18 horas

Lectura e
interpretación

81
ANEXO 05.- Halos de inhibición por efecto del extracto acuoso liofilizado de Persea
americana a 200, 300 y 400mg/ml frente Enterococcus faecalis.

FUENTE: Obtenido por el autor

ANEXO 06.- Halos de inhibición por efecto del extracto acuoso liofilizado de Persea
americana a 200, 300 y 400mg/ml frente Escherichia coli.

FUENTA: Obtenido por el autor

82
ANEXO 07.- Halos de inhibición por efecto del extracto acuoso liofilizado de Persea
americana a 200, 300 y 400mg/ml frente Staphylococcus aureus.

FUENTE: Obtenido por el autor

ANEXO 08: Concentración Mínima Inhibitoria

I del extracto acuoso liofilizado de
Persea americana frente a Enterococcus faecalis.
faecalis

FUENTE: Obtenido por el autor

83
ANEXO 09:: Concentración Mínima Inhibitoria del extracto acuoso liofilizado de
Persea americana frente a Escherichia coli.
coli

FUENTE: Obtenido por el autor

ANEXO 10:: Concentración Mínima Inhibitoria del extracto acuoso liofilizado de

Persea americana frente a Staphylococcus aureus.
aureus

FUENTE: Obtenido por el autor

84
ANEXO 11: Evaluación de las actividades antimicrobiana de extractos vegetales en el
laboratorio de microbiología en el instituto de medicina tradicional IMET-EsSALUD

Extracto a Evaluar:

Género: Especie:

Nombre Común:

Fecha de Procesamiento:

1. ANTIBIOGRAMA

Antibiótico:

DZI (mm)
Microorganismos ATCC
Placa N°01 Placa N°02 Placa N°03 X DZI ATB

Enterococcus faecalis
ATCC 29212

Escherichia coli ATCC

25912

Staphylococcus aureus
ATCC 25923

DZI: Diámetro de la zona de inhibición.

ATB: Antibiótico
X DZI ATB: Porcentaje del diámetro de la zona de inhibición del antibiótico

2. CAPACIDAD ANTIMICROBIANA:

DZI (mm)
Microorganismos ATCC
Placa N°01 Placa N°02 Placa N°03

Enterococcus faecalis ATCC 29212

Escherichia coli ATCC 25912

Staphylococcus aureus ATCC 25923

DZI: Diámetro de la zona de inhibición.

85
Porcentaje de actividad antimicrobiano del extracto:

Microorganismos ATCC X DZI Extracto X DZI Control %AA

Enterococcus faecalis ATCC 29212

Escherichia coli ATCC 25912

Staphylococcus aureus ATCC 25923

X ZDI: Porcentaje del diámetro de la zona de inhibición.

%A/A: Porcentaje de actividad antimicrobiana.

Control: Antibiótico

3. CONCENTRACIÓN INHIBITORIA MÍNIMA (mg/ml)

Cc. E. faecalis E. coli ATCC S. aureus

ATCC 29212 25912 ATCC 25923
(mg/ml)

86