Componentes de medio de cultivo

Los requisitos ambientales básicos para que las células crezcan de manera óptima son:
temperatura controlada, un sustrato para la unión celular y un medio de crecimiento e incubadora
adecuados que mantengan el pH y la osmolalidad correctos. El paso más importante y crucial en el
cultivo celular es seleccionar el medio de crecimiento adecuado para el cultivo in vitro. Un medio
de crecimiento o medio de cultivo es un líquido o gel diseñado para apoyar el crecimiento de
microorganismos, células o plantas pequeñas. Los medios de cultivo celular generalmente
comprenden una fuente apropiada de energía y compuestos que regulan el ciclo celular. Un medio
de cultivo típico se compone de un complemento de aminoácidos, vitaminas, sales inorgánicas,
glucosa y suero como fuente de factores de crecimiento, hormonas y factores de unión. Además
de los nutrientes, el medio también ayuda a mantener el pH y la osmolaridad.

Medios naturales

Los medios naturales consisten únicamente en fluidos biológicos naturales. Los medios naturales
son muy útiles y convenientes para una amplia gama de cultivos de células animales. La principal
desventaja de los medios naturales es su pobre reproducibilidad debido a la falta de conocimiento
de la composición exacta de estos medios naturales.

Medios artificiales

Los medios artificiales o sintéticos se preparan añadiendo nutrientes (tanto orgánicos como
inorgánicos), vitaminas, sales, fases gaseosas de O2 y CO2, proteínas séricas, carbohidratos,
cofactores [1]. Se han ideado diferentes medios artificiales para cumplir uno o más de los
siguientes propósitos: 1) supervivencia inmediata (una solución salina equilibrada, con pH y
presión osmótica específicos); 2) supervivencia prolongada (una solución salina equilibrada
complementada con varias formulaciones de compuestos orgánicos y/o suero); 3) crecimiento
indefinido; 4) funciones especializadas.

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Media-376.html

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Componentes del medio de cultivo

El medio de cultivo es el componente más importante del ambiente de cultivo, ya que proporciona
los nutrientes, factores de crecimiento y hormonas necesarios para el crecimiento celular, además
de regular el pH y la presión osmótica del cultivo. Aunque los experimentos iniciales de cultivo
celular se realizaron utilizando medios naturales obtenidos a partir de extractos de tejidos y
fluidos corporales, la necesidad de estandarización, la calidad de los medios y el aumento de la
demanda llevaron al desarrollo de medios definidos. Las tres clases básicas de los medios son
medios basales, medios con suero reducido y medios sin suero, que difieren en su requerimiento
de suplementación con suero.
El suero es de vital importancia como fuente de factores de crecimiento y adhesión, hormonas,
lípidos y minerales para el cultivo de células en medios basales. Además, el suero también regula
la permeabilidad de la membrana celular y sirve como transportador de lípidos, enzimas,
micronutrientes y oligoelementos hacia el interior de la célula. Sin embargo, el uso de suero en
medios tiene una serie de desventajas que incluyen un alto costo, problemas con la
estandarización, especificidad, variabilidad y efectos no deseados como la estimulación o
inhibición del crecimiento y/o la función celular en ciertos cultivos celulares. Si el suero no se
obtiene de una fuente confiable, la contaminación también puede representar una seria amenaza
para el éxito de los experimentos de cultivo celular. Para hacer frente a esta amenaza, todos los
productos Invitrogen y GIBCO®, incluidos los sueros, se prueban para detectar contaminación y se
garantiza su calidad, seguridad, consistencia y cumplimiento normativo.

Medios basales

La mayoría de las líneas celulares crecen bien en medios basales, que contienen aminoácidos,
vitaminas, sales inorgánicas y una fuente de carbono como la glucosa, pero estas formulaciones de
medios basales deben complementarse con suero.

Medios de suero reducido

Otra estrategia para reducir los efectos no deseados del suero en los experimentos de cultivo
celular es utilizar medios reducidos en suero. Los medios de suero reducido son formulaciones de
medios basales enriquecidas con nutrientes y factores derivados de animales, que reducen la
cantidad de suero que sea necesario.

Medios sin suero

Los medios libres de suero (SFM) evitan los problemas del uso de sueros animales al reemplazar el
suero con formulaciones nutricionales y hormonales apropiadas. Existen formulaciones de medios
sin suero para muchos cultivos primarios y líneas celulares, incluidas las líneas productoras de
proteínas recombinantes de ovario de hámster chino (CHO), varias líneas celulares de hibridoma,

las líneas de insectos Sf9 y Sf21 (Spodoptera frugiperda), y para líneas celulares que actúan como
huéspedes para la producción viral (p. ej., 293, VERO, MDCK, MDBK), y otras. Una de las
principales ventajas de usar medios sin suero es la capacidad de hacer que el medio sea selectivo
para tipos de células específicos eligiendo la combinación adecuada de factores de crecimiento. La
siguiente tabla enumera las ventajas y desventajas de los medios sin suero.

Subcultivo

Después de crecer en cultivo durante unos días, las células pueden llenarse demasiado para su
contenedor y esto puede ser perjudicial para su crecimiento, lo que generalmente conduce a la
muerte celular si se dejan durante largos períodos de tiempo, ya que consumirán los nutrientes
con el tiempo (7). Una solución común a esto es subcultivar las células en otro recipiente. Lo que
esto implica es simplemente tomar una porción de las células de un contenedor y moverlas a un
nuevo contenedor con medios frescos, proporcionando así más espacio y nutrientes para que
crezcan ambas porciones de células (7).
Si las células son células en suspensión, simplemente pueden transferirse a un tubo cónico,
centrifugarse en una centrífuga y luego volver a suspenderse en medio fresco. Esta suspensión
puede dividirse en 2 o más porciones y agregarse a nuevos envases. Sin embargo, si las celdas son
celdas adherentes, primero se deben separar de su contenedor (7). La tripsina es una enzima
proteolítica común que descompone las proteínas que ayudan a las células a adherirse a los
recipientes de cultivo. Por lo tanto, la tripsinización, el proceso de disociación celular que usa
tripsina, se usa para pasar las células a un nuevo recipiente.

Células adherentes

1. Evaluar el grado de confluencia y validar la ausencia de contaminación bacteriana y fúngica

utilizando un microscopio invertido.

2. Retire los medios gastados y lave la monocapa de las líneas celulares con PBS libre de Ca2+ y
Mg2+. Si se sabe que las células se adhieren agresivamente, repita el paso de lavado.

3. Pipetee aproximadamente 1 ml de tripsina/EDTA por cada 25 cm2 de superficie sobre la

monocapa de células limpia. Para cubrir la monocapa con tripsina, gire el matraz. Regrese el
matraz a la incubadora durante 2 a 10 minutos después de vaciar el exceso de tripsina.

4. Usando un microscopio invertido, inspeccione las células para confirmar que están sueltas y
flotando. Para liberar las células adheridas restantes, golpee ligeramente los matraces en el
costado.

5. Para inactivar la tripsina, resuspender las células en un pequeño volumen de medio nuevo que
contenga suero. Retire 100-200 L y cuente las células. Utilice un inhibidor de tripsina, como el
inhibidor de tripsina de soja, para inactivar la tripsina en células cultivadas en medio sin suero.

6. Transfiera la cantidad requerida de células a un nuevo matraz etiquetado que contenga medios
precalentados e incube de acuerdo con las instrucciones de la línea celular.

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https://info.abmgood.com/cell-culture-introduction

https://noteshippo.com/subculture-protocol-subculture-of-adherent-and-suspension-cell-lines/

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PROTOCOLO DE SUBCULTIVO

Prepárese para subcultivar las células cuando el cultivo haya alcanzado alrededor del 80 % de
confluencia. El siguiente protocolo es para células adherentes; para celdas de suspensión,
comience en el paso 6.
Protocolo

1. Precaliente el medio de cultivo completo especificado en la hoja de datos de la línea celular en

un baño de agua a 37oC. Precaliente la tripsina-EDTA (TM050) a temperatura ambiente.

2. Aspire con cuidado los medios de cultivo del recipiente de cultivo sin perturbar la monocapa
celular.

3. Agregue tripsina-EDTA precalentada al recipiente de cultivo. Agite suavemente el recipiente de

cultivo para garantizar una cobertura completa de la tripsina-EDTA sobre las células. (La tabla 1
proporciona pautas para los volúmenes de tripsina-EDTA necesarios para una variedad de
recipientes de cultivo).

4. Observe las células bajo un microscopio para confirmar que se están disociando unas de otras y
se están redondeando. Golpee suavemente el recipiente de cultivo desde varios lados para
promover el desprendimiento de células. Las células que son difíciles de separar se pueden poner
a 37oC durante varios minutos para facilitar la dispersión.

5. Cuando la mayoría de las células se hayan desprendido, agregue un volumen igual del medio
completo en el recipiente de cultivo para neutralizar la tripsina-EDTA. Agite suavemente o pipetee
la suspensión de cultivo para asegurarse de que se complete la neutralización.

6. Transfiera la suspensión de cultivo a un tubo de centrífuga estéril.

7. Centrifugar la suspensión celular a 1500 rpm durante 3 minutos. La duración y la velocidad

reales de la centrífuga pueden variar según el tipo de celda.

8. Aspire el sobrenadante después de verificar que todas las células hayan bajado al sedimento.
Vuelva a suspender el sedimento celular en medio completo fresco precalentado (ajuste el
volumen según sea necesario de acuerdo con la Tabla 1).

9. Sembrar nuevos recipientes de cultivo a una densidad celular adecuada.

10. Coloque el recipiente de cultivo recién sembrado en una incubadora de CO2 al 5 % a 37 °C.
Incube durante al menos 24 a 48 horas antes de procesar las células para experimentos
posteriores.

11. Renovar los medios de cultivo cada 2-3 días si las células no han alcanzado el 80 % de
confluencia.

Existen dos tipos de cultivo celular primario:

• Cultivos en monocapa: las células crecen adheridas sobre un soporte sólido (plástico o vidrio). El
anclaje al sustrato es un prerrequisito para la proliferación celular. Es el método utilizado para la
mayoría de las células excepto para las hematopoyéticas.

• Cultivos en suspensión: las células se encuentran dispersas en el medio de cultivo. Su

crecimiento no depende del anclaje. Este tipo de cultivo se restringe a las células
hematopoyéticas, células madre, líneas celulares transformadas y células tumorales. Alcanzan la
confluencia cuando el número de células es grande y los nutrientes son insuficientes.
Subcultivos y líneas celulares

Las células del cultivo primario en monocapa se dispersan por métodos enzimáticos y se pasan a
un nuevo frasco de cultivo. En el caso de células en suspensión, sencillamente se diluyen en medio
fresco. Los sucesivos cultivos así formados se denominan una línea celular.

La formación de una línea celular a partir de un cultivo primario implica que:

• aumenta el número de células obtenidas

• acaban predominando uno o dos tipos celulares: los que tienen mayor tasa de crecimiento

• la población celular se hace uniforme y homogénea

• sus características se conservan durante las sucesivas generaciones y, si se conservan en

nitrógeno líquido, de forma indefinida

Normalmente, las líneas celulares tienen una vida finita que, según el tipo de célula, se puede
prolongar entre 20 y 100 generaciones. Superado ese límite, las células entran en una etapa que
se denomina senescencia en la que pierden su capacidad de proliferar (supuestamente por el
acortamiento de los telómeros) y mueren. Sin embargo, algunas células (como las de roedores y
las tumorales) evitan la senescencia y dan lugar a líneas celulares continuas, que crecen
indefinidamente. Estas células pueden surgir de forma espontánea (exposición a radiaciones
ionizantes o a carcinógenos químicos) o inducida (infección vírica o transfección de ADN) y son el
resultado de un cambio genotípico denominado transformación.

Tripsinización

Proceso utilizado en cultivos celulares para separar las células adherentes del sustrato de cultivo
usando tripsina, una enzima proteolítica que degrada las proteínas de adhesión.

La tripsina es una enzima que rompe los enlaces de las proteínas mediante hidrólisis. Es producida
en el páncreas y activada en el duodeno. En cultivos celulares de células adherentes se usa para
despegar las células de la superficie de crecimiento (placas de cultivo) y poder tenerlas en
suspensión. Si tenemos las células mucho tiempo en tripsina, esta daña las células, para ello
debemos inhibirla usando medio de cultivo, porque este contiene suero (FBS) que inhibe la acción
de la tripsina.

PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS

 pH

La mayoría de las líneas celulares crecen bien a pH 7,4. Aunque el pH óptimo para el crecimiento
celular varía relativamente poco entre las diferentes cepas celulares, algunas líneas de fibroblastos
normales funcionan mejor con un pH de 7,4 a 7,7, y las células transformadas pueden funcionar
mejor con un pH de 7,0 a 7,4.

 CO2 y Bicarbonato

El dióxido de carbono en la fase gaseosa se disuelve en el medio, establece el equilibrio con los
iones HCO3− y reduce el pH. Debido a que el CO2 disuelto, el HCO3− y el pH están todos
interrelacionados, es difícil determinar el principal efecto directo del CO2. La tensión atmosférica
de CO2 regulará directamente la concentración de CO2 disuelto, en función de la temperatura.

El medio de crecimiento controla el pH del cultivo y amortigua las células en cultivo frente a
cambios en el pH. Por lo general, esta amortiguación se logra mediante la inclusión de un tampón
orgánico (p. ej., HEPES) o basado en bicarbonato de CO2. Debido a que el pH del medio depende
del delicado equilibrio de dióxido de carbono disuelto (CO2) y bicarbonato (HCO3-), los cambios en
el CO2 atmosférico pueden alterar el pH del medio. Por lo tanto, es necesario utilizar CO2 exógeno
cuando se utilizan medios tamponados con un tampón a base de bicarbonato de CO2,
especialmente si las células se cultivan en placas abiertas o si las líneas celulares transformadas se
cultivan a altas concentraciones. Mientras que la mayoría de los investigadores suelen utilizar 5-7
% de CO2 en el aire, 4-10 % de CO2 es común para la mayoría de los experimentos de cultivo
celular. Sin embargo, cada medio tiene un recomendado. Tensión de CO2 y concentración de
bicarbonato para lograr el pH y la osmolalidad correctos; consulte las instrucciones del fabricante
del medio para obtener más información.

Oxígeno

El otro componente importante de la fase gaseosa es el oxígeno. Mientras que la mayoría de las
células requieren oxígeno para la respiración in vivo, las células cultivadas a menudo dependen
principalmente de la glucólisis, una alta proporción de la cual, como en las células transformadas,
puede ser anaeróbica. Aunque se han hecho intentos para incorporar transportadores de O2, por
analogía con la hemoglobina en la sangre, esta práctica aún no es de uso general y las células
dependen principalmente del O2 disuelto, que puede ser tóxico debido a la elevación en el nivel
de radicales libres. Proporcionar la tensión de O2 correcta es, por lo tanto, siempre un
compromiso entre cumplir con el requerimiento respiratorio y evitar la toxicidad.

Temperatura

La temperatura óptima para el cultivo celular depende de (1) la temperatura corporal del animal
del que se obtuvieron las células, (2) cualquier variación anatómica de temperatura (p. ej., la
temperatura de la piel y los testículos puede ser inferior a la del animal resto del cuerpo), y (3) la
incorporación de un factor de seguridad para permitir errores menores en la regulación de la
incubadora.

Por lo tanto, la temperatura recomendada para la mayoría de las líneas celulares humanas y
animales de sangre caliente es de 37 °C, cerca de calor corporal, pero ajústelo un poco más bajo
por seguridad, ya que el sobrecalentamiento es un problema más serio que el bajo calentamiento.
Debido a la temperatura corporal más alta en las aves, las células aviares deben mantenerse a 38,5
°C para un crecimiento máximo, pero crecerán bastante satisfactoriamente, aunque más
lentamente, a 37 °C.

Los poiquilotermos (animales de sangre fría que no regulan el calor de su sangre dentro de límites
estrechos) toleran un amplio rango de temperatura, entre 15 ◦C y 26 ◦C. La simulación de
condiciones in vivo (p. ej., para peces de agua fría) puede requerir una incubadora con
refrigeración y calefacción para mantener la temperatura de la incubadora por debajo de la
temperatura ambiente. Si es necesario, las células animales poiquilotérmicas pueden mantenerse
a temperatura ambiente, pero la variabilidad de la temperatura ambiente en los laboratorios hace
que esto no sea deseable y es preferible una incubadora refrigerada.

NOTA: Tenga en cuenta que las condiciones de cultivo celular varían para cada tipo de célula. Las
consecuencias de desviarse de las condiciones de cultivo requeridas para un tipo de célula en
particular pueden variar desde la expresión de fenotipos aberrantes hasta una falla total del
cultivo celular. Nosotros por lo tanto le recomendamos que se familiarice con la línea celular de su
interés y siga de cerca las instrucciones proporcionadas con cada producto que esté utilizando en
sus experimentos.

Subcultivo

El subcultivo, también conocido como pase, es la eliminación del medio y la transferencia de

células de un cultivo anterior a un medio de crecimiento nuevo, un procedimiento que permite la
propagación adicional de la línea celular o cepa celular. El crecimiento de las células en cultivo
procede desde la fase de retraso que sigue a la siembra hasta la fase logarítmica, en la que las
células proliferan exponencialmente. Cuando las células en cultivos adherentes ocupan todo el
sustrato disponible y no les queda espacio para la expansión, o cuando las células en cultivos en
suspensión superan la capacidad del medio para soportar un mayor crecimiento, la proliferación
celular se reduce considerablemente o cesa por completo. Para mantenerlos en una densidad
óptima para un crecimiento continuo y para estimular una mayor proliferación, el cultivo debe
dividirse y suministrarse un medio nuevo.

Cultivos neuronales y ganglio de raíz dorsal – investigar

1: ratón

2: rata

Dos líneas celulares – neuroblastoma

Parte farmacológica del proyecto – 4 ultimas clases