3 BIOTECNOLOGÍA

Prof. José Castro

Se puede definir Biotecnología como el empleo de organismos, o parte de ellos,

con el fin de obtener un beneficio para las personas, mediante el uso de técnicas,
conocimientos y procesos que permiten diseñar y construir nuevos productos.
La biotecnología es una práctica milenaria, aunque el término fue acuñado recién
en 1919 por el ingeniero agrónomo húngaro Karl Ereky. Se la divide en biotecnología
tradicional y moderna. La biotecnología tradicional abarca técnicas empíricas sin
fundamentos científicos, como la confección de arpones de hueso, el uso de pieles, la
selección artificial de ganado y vegetales o la elaboración de pan, queso, yogur, cerveza y
vino. La biotecnología moderna surge en el siglo XX gracias a los conocimientos de biología molecular, como el descubrimiento de la
función del ADN y su estructura. El más importante fue el descubrimiento de la universalidad del código genético. Como la información
genética de un organismo puede ser interpretada y expresada por las células de cualquier otro, los biólogos se dieron cuenta de que era
posible tomar un gen de un organismo e introducirlo en otro para que este expresara la información de dicho gen. De esta manera, se
dio inicio a la biotecnología moderna, a partir de la ingeniería genética.

ADN recombinante, aplicaciones y cuestionamientos

Los científicos observaron que los seres vivos tienen mecanismos para defenderse de genomas foráneos que son insertados
por virus y/o bacterias. Los investigadores descubrieron que las bacterias se protegen de la infección por virus debido a la presencia de
ciertas enzimas que restringen o interfieren la invasión viral. Ellas provocan cortes del ADN viral en sitios específicos. Una vez cortado
el ADN, los virus no puede realizar la síntesis de sus proteínas propias. Los científicos llamaron a estas proteínas enzimas de restricción
y desde 1970 las han usado
y les ha permitido obtener
secuencias de nucleótidos
determinadas produciendo
fragmentos de ADN
reproducibles que pueden
generar clones (DNA
cloning).
La ingeniería
genética es la disciplina que
modifica el material
genético de las células
empleando diferentes
herramientas moleculares,
entre ellas las enzimas de
restricción, para fabricar
moléculas de ADN
recombinantes, es decir,
moléculas sintetizadas
artificialmente mediante la
unión de ADN de especies
diferentes. Cuando un
organismo sintetiza
proteínas de otro, cambia su fenotipo, y se denomina organismo transgénico (OT) u organismo genéticamente modificado (OGM).
La ingeniería genética se ha desarrollado en diferentes áreas y sus aplicaciones son múltiples. Sin embargo, ha sido
cuestionada desde el punto de vista ético y científico respecto de su inocuidad y sus beneficios reales.

Técnicas usadas en Biotecnología

1. Manipulación de ADN in vitro

La técnica de reacción en cadena de polimerasa o
PCR (Polymerase Chain Reaction), revolucionó la biología
molecular. Kary Mullis fue el desarrollador de la técnica de PCR
en 1983 y fue galardonado en 1993 con el Premio Nobel de
Química por su descubrimiento. La idea de la reacción en
cadena de la polimerasa es simple, se utilizan dos cebadores o
primers que son complementarios a las cadenas opuestas de
una secuencia de ADN, lo que permite que la enzima ADN
polimerasa actúe sobre ellos para replicar el ADN. Al realizar
este procedimiento cíclicamente, el resultado es una gran
cantidad de una secuencia de ADN de interés.

Técnica de reacción en cadena de polimerasa o PCR: Etapas.

A) Desnaturalización: El ADN que se quiere amplificar se

desnaturaliza a través de la separación de ambas hebras. Este
ADN no necesita estar purificado ni clonado, y puede provenir de
distintas fuentes, incluyendo ADN genómico, muestras forenses
como sangre seca o semen, muestras almacenadas en registros médicos, pelos, restos momificados y fósiles. El ADN es
desnaturalizado por calor a unos 95ºC hasta que se disocia en cadenas simples, normalmente en unos 5 minutos.

B) Hibridación: Luego de la separación, se baja la temperatura a 55 ºC para que los cebadores o primers se unan de manera
complementaria a cada hebra del ADN. Los primers hibridan el ADN de cadena simple. Los cebadores son oligonucleótidos sintéticos
que hibridan con las secuencias complementarias del segmento a amplificar. Generalmente se utilizan dos cebadores diferentes, cada
uno de ellos tiene una secuencia complementaria a una de las dos cadenas del ADN. Los cebadores se alinean con sus extremos 3`
enfrentados ya que hibridan a cadenas opuestas. Al necesitar cebadores sintéticos se requiere alguna información de la secuencia del
ADN a amplificar.

C) Elongación: Finalmente a la mezcla de reacción se le sube la

temperatura hasta 72ºC para que la enzima Taq ADN
polimerasa resistente al calor agregue nucleótidos libres a cada
hebra de ADN para generar las hebras complementarias. La
enzima extiende los cebadores en dirección 5´--3` utilizando
como molde al ADN de cadena simple unido al cebador. Luego,
este proceso se repite varias veces y se obtiene gran cantidad
de moléculas de ADN de interés. El producto es una molécula
de ADN de doble cadena con los cebadores incorporados en el
producto final.

2. Enzimas de restricción
Una herramienta muy útil en biotecnología y necesaria
para las tecnologías del ADN recombinante son las
endonucleasas de restricción o simplemente llamadas enzimas
de restricción. Estas enzimas, aisladas en bacterias, reciben su
nombre debido a que limitan o previenen las infecciones víricas
degradando el ácido nucleico invasor. Las enzimas de restricción reconocen una secuencia específica de nucleótidos, denominados
sitios de restricción, de una molécula de ADN de doble cadena
y cortan en esa secuencia. El premio Nobel de 1978 se otorgó a
Werner Arber, Hamilton Smith y Daniel Nathans por su
investigación sobre enzimas de restricción. Hasta la fecha se
han aislado y caracterizado casi 200 tipos de enzimas de
restricción diferentes. La capacidad para cortar el ADN en
lugares específicos es importante por dos razones:
En primer lugar, permite generar mapas físicos en el
ADN que se construyen a partir de la localización de sitios de
corte para enzimas de restricción. Estos mapas de restricción
proporcionan datos cruciales para identificar y trabajar con
moléculas de ADN.
En segundo lugar, la escisión o corte por
endonucleasa de restricción permite la creación de moléculas
recombinantes. La capacidad de construir moléculas
recombinantes es importante para la investigación, porque
muchos pasos en el proceso de clonación y manipulación de
ADN requieren la capacidad de combinar moléculas de ADN de
diferentes orígenes.
Si se quieren unir dos fragmentos de ADN
provenientes de distintos orígenes (ADN recombinante), se
pueden utilizar enzimas de restricción que reconozcan
secuencias de ADN presentes en ambos fragmentos y luego
los corten, generando fragmentos complementarios que
hibridarán y serán unidos gracias a la ayuda de la enzima ADN
ligasa.

3. Electroforesis en gel
Muchos procedimientos que evalúan las moléculas
de ADN
utilizan
electroforesis
en gel. Esta
técnica usa
un gel como
tamiz
molecular para separar los ácidos nucleicos o las proteínas en función de su tamaño,
su carga eléctrica y otras propiedades físicas. Como las moléculas de ácidos nucleicos
poseen cargas negativas en sus grupos fosfato, en un campo eléctrico viajan hacia el
polo positivo. A medida que se mueven, la mayor parte de las fibras poliméricas
obstruyen el paso de las moléculas más largas en mayor medida que el de las
moléculas más cortas, de esta manera las separa de acuerdo con su longitud. Por
tanto, la electroforesis en el gel separa una mezcla de moléculas de ADN lineal en bandas, cada una formada por moléculas de ADN de
la misma longitud.
En el análisis de fragmentos de restricción, los fragmentos de DNA obtenidos después de la digestión de una molécula de DNA con
enzimas de restricción, se separan mediante electroforesis en gel. Cuando la mezcla de fragmentos de restricción que proviene de una
molécula de DNA específica se somete a electroforesis, se obtiene un patrón de bandas característico de la molécula original y de la
enzima de restricción utilizada.
Como el ADN se puede extraer del gel en forma íntegra, el procedimiento también proporciona una forma de preparar
muestras puras de fragmentos individuales. El análisis de fragmentos de restricción también es útil para comparar dos moléculas de
ADN diferentes; por ejemplo, dos alelos de un gen. Una enzima de restricción reconoce una secuencia específica de nucleótidos y un
cambio en un solo par de bases impide que se corte en un sitio específico. Por tanto, si se presentan diferencias en los nucleótidos
entre los alelos dentro de una secuencia de reconocimiento de una enzima de restricción, la digestión con esa enzima permite obtener
una mezcla de fragmentos de cada alelo. De esta manera, cada mezcla proporciona su propio patrón de bandas en la electroforesis en
gel.

4. Clonación molecular
El plásmido bacteriano
se denomina vector de clonación,
que se define como una molécula
de ADN que puede transportar
ADN extraño a una célula y
replicarse dentro de ella. Los
plásmidos bacterianos se
emplean de forma universal
como vectores de clonación
debido a que pueden aislarse
con facilidad de las bacterias y
manipularse para formar
plásmidos recombinantes
mediante la inserción de ADN
extraño in vitro, y luego volver a
introducirse en las células
bacterianas. Además, las células
bacterianas se reproducen con
rapidez y en el proceso
multiplican todo el ADN extraño
que alberguen.

Clonación del gen para Insulina

humana
1. Se aisla el ADN plasmidial
de la bacteria E. coli y el
ADN humano portador del
gen de interés a clonar. El plásmido se intervino con ingeniería genética para insertarle dos genes de utilidad: Ampr (gen para
resistencia a ampicilina) y lacZ (gen que
codifica para la enzima beta-galactosidasa,
que hidroliza lactosa y una molécula sintética
llamada X-gal. Dentro del gen lacZ hay una
sola copia del sitio de restricción reconocido
por la enzima de restricción).

2. Una misma enzima de restricción digiere el

plásmido y el ADN humano y produce
extremos cohesivos o adherentes que son
complementarios. La enzima corta el ADN del
plásmido en un único sitio de restricción
dentro del gen lacZ, lo que inutiliza dicho gen
y la bacteria no podrá sintetizar la enzima
beta-galactosida. También corta el ADN
humano en múltiples sitios, generando varios
miles de fragmentos, uno de los cuales
transporta el gen de interés.

3. Luego se mezclan los fragmentos de ADN

humano con los plásmidos cortados para
permitir la formación de pares de bases entre los extremos adhesivos complementarios. A continuación se agrega una ADN ligasa
que une los pares de bases de los plásmidos y los fragmentos de ADN humanos. Algunos de los plásmidos recombinantes
resultantes contienen fragmentos de ADN humano, así como también se producen otros con una combinación de dos plásmidos o
una versión no recombinante del plásmido original que se volvió a unir.

4. El ADN preparado en el paso 3 se mezcla con bacterias portadoras de una mutación de su propio gen lacZ, que las imposibilita
para metabolizar lactosa. Bajo condiciones experimentales adecuadas, las células adquieren ADN extraño por transformación.
 Algunas células obtienen un plásmido recombinante portador del gen en cuestión. Sin embargo muchas otras células incorporan
un plásmido recombinante portador de un gen distinto, un plásmido no recombinante o un fragmento de ADN humano.
Luego, las bacterias se siembran en un medio sólido de nutrientes (agar) que contiene ampicilina y X-gal, una molécula
similar a la lactosa. El uso de este medio permite identificar los clones de células transformadas con un plásmido recombinante.

¿Cómo se reconocen los clones de células portadoras de plásmidos recombinantes?

 En primer lugar, solo las células con plásmidos se reproducen porque solo estas células tienen el gen ampr, que les confiere
resistencia contra la ampicilina
del medio. Cada bacteria que
se reproduce genera muchos
clones después de varias
divisiones celulares, lo que
produce un gran grupo de
células que descienden de la
célula original. Una vez que el
clon alcanza unas 105 células
se forma una masa o colonia
de células visibles en la placa
de agar. A medida que las
células se reproducen también
se copian, o clonan, todos los
genes extraños transportados
por los plásmidos
recombinantes.
En segundo lugar, el
color de las colonias permite
distinguir las colonias bacterianas con plásmidos recombinantes de las que tienen plásmidos no recombinantes. Las colonias con
plásmidos no recombinantes y el gen lacZ intacto, son de
color azul porque producen beta-galactosidasa funcional,
que hidroliza el X-gal en el medio y forma un producto de
color azul. En cambio, en colonias con plásmidos
recombinantes que tienen ADN extraño (gen de insulina,
por ejemplo) insertado en el gen lacZ no se produce beta-
galactosidasa funcional; por tanto, estas colonias son de
color blanco. Hasta este momento, el procedimiento
permite clonar muchos fragmentos diferentes de ADN
humano, no solo el que interesa en el experimento. La
parte final más difícil de la clonación de un gen específico
es identificar la colonia que contiene el gen entre varios
miles de colonias portadoras de otros fragmentos de ADN
humano.

Aplicaciones de ADN recombinante e Ingeniería genética

• Aplicaciones farmacológicas: se transfieren
genes humanos a bacterias, para conseguir que estos
organismos produzcan proteínas en grandes cantidades,
que son necesarias para el tratamiento de ciertas
enfermedades. Por ejemplo, se crearon bacterias
transgénicas que producen la hormona insulina, requerida
para el tratamiento de la diabetes. Otros microorganismos
transgénicos producen anticuerpos, factores de
coagulación, para el tratamiento de personas que padecen
hemofilia y, con otros, se producen vacunas contra ciertos
microorganismos.

• Aplicaciones médicas: se han desarrollado técnicas de diagnóstico y de tratamiento de enfermedades.

Por ejemplo, el ensayo FISH (hibridación in situ con fluorescencia), permite el diagnóstico de enfermedades cromosómicas; la
terapia génica permite el tratamiento de enfermedades producidas por una alteración genética, como la diabetes o el Parkinson. Esta
terapia consiste en sustituir el gen defectuoso por un gen sano para producir con normalidad la proteína responsable de la enfermedad,
actuando sobre el origen de la enfermedad y no sobre las consecuencias de la afección. De esta manera, la corrige definitivamente.

• Aplicaciones en la industria: se han creado

plantas transgénicas resistentes a herbicidas e insectos, y
otras a las que se les ha incrementado su valor nutricional.
También se han creado animales más grandes y resistentes
a condiciones ambientales adversas y otros que suministran
sustancias útiles, como vacas cuya leche contiene la
hormona del crecimiento.
 Riesgos de los organismos transgénicos (OT)
Se ha comprobado que el consumo de alimentos producidos con ciertos OT provoca reacciones alérgicas en algunas
personas. Así mismo, que aquellos alimentos elaborados con OT que contienen un tipo de lecitina alteran la mucosa gástrica e intestinal
y los que poseen cierta proteína de soya transgénica causan cambios bioquímicos en los hepatocitos. La alta concentración del
herbicida glifosato encontrada en algunos cultivos de soya transgénicos es un riesgo para la población, pues es un agente cancerígeno.
Por otra parte, existe el riesgo del traspaso de genes de resistencia a antibióticos a patógenos que afectan al ser humano. Por último, la
producción de OT implica riesgos para la biodiversidad y para el desarrollo económico.

a. Riesgos para la biodiversidad

 Desaparición de variedades vegetales más antiguas porque ya no se cultivan, por el uso de insecticidas o por el
desplazamiento de especies transgénicas.
 Alteración de especies silvestres por transferencia de genes.
 Cambios en los equilibrios ecológicos.

b. Riesgos económicos
 Pérdida de mercados que son reticentes al consumo de OT o sus derivados.
 Menor precio de los productos transgénicos.
 Pago de patentes y derechos.
 Dependencia permanente de los agricultores del fabricante de los OT y de las semillas vendidas.
 La pérdida de la biodiversidad podría impedir el desarrollo de nuevos productos alimenticios, químicos y fármacos.
 Incompatibilidad con el desarrollo de una agricultura limpia u orgánica.
 Además, impide la preservación y desarrollo de la cultura de los pueblos originarios.
(Fuente: Tchernitchin, A. Organismos
transgénicos: ventajas y riesgos.)

5. Clonación
Además de las técnicas de ADN
recombinante, la ingeniería genética ha
desarrollado la técnica de la clonación.
Clonar un organismo, una célula o una
molécula significa hacer una o varias
copias genéticamente idénticas al original.
Se distinguen dos tipos de clonación,
reproductiva (dibujo del costado) y
terapéutica (dibujo de abajo). La primera
busca obtener individuos genéticamente
idénticos entre sí, mientras que la segunda
busca producir tejidos u órganos para
trasplantes. En 1997 se anunció el
nacimiento de Dolly, el primer mamífero
clonado mediante la técnica de
transferencia nuclear. La técnica consiste en usar núcleos de células embrionarias en estado de desarrollo temprano o de células

diferenciadas. El procedimiento, gracias al que nació Dolly, puede resumirse en los siguientes pasos:
 De una oveja blanca se extrajeron células de glándulas mamarias.
 Se tomaron ovocitos de una oveja cabeza negra y se les extrajo el núcleo.
 A cada ovocito anucleado se le insertó un núcleo de una célula de glándula mamaria y se formaron cigotos.
 Los cigotos fueron trasplantados al oviducto de otra oveja que actuó como madre sustituta.
Tras el nacimiento de Dolly, se han clonado otras especies de mamíferos. En cada procedimiento, solo un pequeño porcentaje
de los embriones clonados es capaz de desarrollarse con normalidad y la mayoría de los individuos adultos suele morir prematuramente
debido a enfermedades degenerativas.

6. Terapia Génica
 La terapia génica es el conjunto de procedimientos que permiten la introducción de genes sanos o normales dentro de las
células de un organismo, con el fin de tratar enfermedades que
antes parecían incurables. Para ello se han desarrollado técnicas
que permiten identificar y remplazar los genes defectuosos,
logrando así reparar tejidos y órganos dañados.
Formas de incorporar un gen en una célula
A. Difusión. El gen puede atravesar la membrana plasmática y
llegar hasta el núcleo.
B. Proyectiles. Se “disparan” pequeñas esferas de material
sólido, que ingresan a la célula y que llevan consigo copias del
gen foráneo.
C. Inyección. El ADN se inyecta en las células a través de agujas
muy finas.
D. Virus. Los virus se caracterizan por “inyectar” su ADN en las
células. Así, si se inserta en el virus el gen deseado, éste lo
podrá incorporar en el genoma de la célula.
En un comienzo, la terapia génica se pensó como la alternativa de tratamiento para enfermedades genéticas causadas por un
solo gen (monogenéticas), como la fenilcetonuria. En la actualidad se visualiza como posible tratamiento para muchas enfermedades,
siendo el cáncer la más estudiada, además de otras como la
diabetes tipo I, el mal de Alzheimer y enfermedades infecciosas
como SIDA y Hepatitis. En Chile se desarrollan diferentes
proyectos de investigación referidos a terapia génica. Uno de
ellos, liderado por científicos del Centro de Estudios Moleculares
de la Célula (CEMC) de la Universidad de Chile, busca desarrollar
un tratamiento para personas con lesiones en la médula espinal,
que han perdido la movilidad. Los investigadores descubrieron
que el trauma sufrido por el SNC luego de una lesión medular,
altera la homeostasis de las proteínas, aumentando los niveles de
estrés celular. Usando un virus como vector, lograron introducir un
gen que codifica para un factor de transcripción que regula la
homeostasis proteica, en las células de la médula espinal dañada
de ratas. Con este tratamiento consiguieron una recuperación parcial de la movilidad de los animales lesionados.
La

terapia génica puede ayudar a solucionar el alcoholismo, si un grupo de investigadores del Instituto Milenio de Dinámica Celular y
Biotecnología de la Universidad de Chile tiene éxito en su búsqueda de una vacuna contra esta adicción. Estudiaron una mutación, que
afecta a parte de la población asiática, que impide que se produzca la enzima aldehído deshidrogenasa (DH), encargada de metabolizar
el alcohol, lo que desencadena que sus derivados se acumulen en el organismo generando una serie de molestos síntomas. Los
investigadores emplearon un virus como vector para ingresar una molécula que evita la transcripción del gen que codifica la enzima DH
en ratas, y observaron efectos de intoxicación y disminución del consumo de alcohol en estos animales entre un 50 % y un 60 %. El
próximo paso de este proyecto es intentar aplicar exitosamente, en humanos, el procedimiento desarrollado en ratas.

Proyecto genoma humano

Como se sabe, el genoma es todo el material genético de una célula, incluido el de las mitocondrias. El PGH busca identificar
la secuencia completa de las tres mil millones de bases nitrogenadas presentes en los 23 pares de cromosomas. Este es el primer paso
para identificar los genes responsables de la síntesis de proteínas. Conocer el mensaje contenido en nuestros genes es comparable a
conocer nuestro “manual de instrucciones”.
 El PGH se inició en 1990, con investigaciones subsidiadas por el gobierno de Estados Unidos y otras privadas; en 1998 se
sumaron laboratorios de todo el mundo. Gracias a nuevas técnicas moleculares y a los avances computacionales, como el desarrollo de
internet que permitió un rápido intercambio de información, fue posible que en el año 2000 se publicara el primer borrador, varios años
antes de lo esperado.
Algunas observaciones y conclusiones
• Los genes que codifican proteínas son cerca de treinta mil, se estimaban cien mil, y se encuentran alejados entre sí.
La mayor parte del ADN la constituyen secuencias de función aún desconocida. Se concluyó que no existe una
relación directa entre la complejidad de un organismo y la cantidad de ADN.
• Cada gen está implicado en la síntesis de más de una proteína.
• Compartimos genes con bacterias y virus, por lo que parte de nuestro genoma provendría de microorganismos
primitivos.

Posibles aplicaciones
Además de las aplicaciones científicas relacionadas con la comprensión del funcionamiento de las células del organismo y de
este en su globalidad, el conocimiento obtenido a partir del PGH podría ser usado con fines terapéuticos; por ejemplo, se podría
identificar a los genes responsables de una enfermedad genética y modificar su expresión, e informativos, porque si se conocen los
genes de un individuo se podría saber su predisposición a contraer algunas enfermedades o sus aptitudes para desarrollar ciertas
actividades.
Conocer el genoma de una persona permitirá saber si sufrirá de una enfermedad genética o si la porta, con vistas a su
prevención o curación. Existen comités internacionales de bioética que vigilan los avances de la genómica, y velan por el respeto de los
principios de libertad y dignidad de las personas, frente a los riesgos de desviación de la investigación biomédica o de sus aplicaciones
hacia usos que podrían vulnerar los derechos de las personas.

Las más recientes disciplinas biológicas son la genómica y la proteómica. La genómica, apoyada en la genética y en la
informática, se ocupa de descifrar los genomas. La proteómica se encarga de estudiar al proteoma o conjunto de proteínas codificadas
y expresadas por el genoma, y explicar cómo influyen en el fenotipo.